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小胶质细胞是参与防御脑缺血再灌注损伤的主要免疫细胞，在中枢神经系统修复和神经发生中发挥重要作用。在缺血性中风发生后，小胶质细胞表型往往会发生改变[1-2]。小胶质细胞经活化后会极化为促炎M1型和抗炎M2型两种表型[3-4]。抗炎型小胶质细胞能通过减轻炎症反应、清除细胞碎片和释放神经营养因子来促进大脑的恢复。然而小胶质细胞除了具有神经保护作用外，还是大脑中促炎细胞因子的主要产生者。促炎型小胶质细胞能通过启动炎症级联反应释放大量的炎性细胞因子引起炎症反应，阻碍大脑恢复过程[5-6]。
乌帕替尼(upadacitinib)是一种口服的、可逆的JAK激酶(Janus kinase)抑制剂，对JAK1有较强的选择性，已被批准用于治疗类风湿关节炎[7-9]，目前临床研究正在评估几种免疫介导的炎症性疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎等炎症相关疾病[10-11]。有报道称小胶质细胞的极化与JAK/STAT信号通路有关[12-13]，却没有对于JAK1选择性抑制剂乌帕替尼在神经系统应用方面的报道。本研究通过使用BV2小胶质细胞OGD/R模型，探讨乌帕替尼对BV2小胶质细胞极化的影响及其可能的作用机制。
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BV2细胞和PC12细胞均购自中科院上海细胞库，培养条件：高糖型DMEM培养基，含10%胎牛血清(FBS),置37 ℃，5%CO2培养箱中。
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细胞培养箱、酶标仪（Thermo公司）；水平高速离心机（Eppendorf公司）；氧糖剥夺（OGD）装置（Billups-Rothenberg公司）；实时定量PCR仪（美国AB7500）；Odyssey双色激光成像系统（LICOR公司）。
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乌帕替尼（货号：AK600704，美国Ark Pharm 公司）；噻唑蓝(MTT)试剂盒（塞维尔生物科技有限公司）；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；SYBR Green（Thermo Fisher）；IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA试剂盒（美国R&D公司）；GAPDH、JAK1、p-JAK1、STAT6、p-STAT6抗体（CST公司）。
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细胞接种在细胞培养板中，培养24 h待细胞贴壁后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)将孔内培养基洗净，更换为无血清无糖的DMEM培养基，将培养板置于OGD装置中，用混合气体（95%N2+5%CO2）将装置中空气置换出来，培养板连同OGD装置一起放入37 ℃培养箱中3～4 h后取出细胞，再更换为含血清的高糖DMEM培养基继续培养24 h。
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待测细胞每孔加入MTT试剂20 μl，37 ℃孵育4 h后，将孔内液体吸尽弃去，每孔加入150 μl 二甲基亚砜(DMSO)，震荡1 min使结晶物充分溶解，用酶标仪检测492 nm处吸光度值。计算生存率：每孔的吸光度值为该孔实测吸光度值减去空白吸光度值，对照组吸光度均值定为生存率100%，每孔细胞生存率=（该孔吸光度值/对照组吸光度均值）×100%。
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BV2细胞以3×105个/ml浓度密度接种于六孔板中，待细胞长满底部后，用200 μl的枪头垂直沿直尺过圆心迅速在底部划痕，用PBS清洗3遍将划下的细胞洗净，加入无血清无糖DMEM培养基进行OGD缺氧3 h，之后更换为无血清高糖培养基恢复氧糖继续培养24 h，在恢复氧糖期间0、6、12、24 h拍照观察迁移变化。划痕图片经Image J软件处理圈出划痕区域面积S，迁移率=（1‒S/S0h）×100%。
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收集细胞培养上清，在4 ℃、14 000/min离心10 min，以去除细胞或细胞碎屑，吸取澄清的上清培养基做后续检测。按酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒（美国R&D公司）说明书进行操作，根据标准品吸光度值制作标准曲线，计算出每个样品吸光度值对应的炎症因子含量。
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将BV2小胶质细胞正常培养或 OGD 4 h/R24 h后的培养上清液(CM)用原培养基稀释1倍后分别加入正常或者OGD 4 h处理的PC12神经细胞中，复氧共培养24 h后采用 MTT 检测PC12细胞的生存率。
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弃去培养基，用PBS漂洗一次，六孔板中每孔加入200 μl的异硫氰酸胍裂解液(TransZol Up)，反复吹打使细胞充分裂解，室温静置5 min。按全式金RNA提取试剂盒操作步骤提取RNA，之后按全式金反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，储存于‒20 ℃用于后续实验。反转录得到的cDNA使用 7500型实时 PCR 仪进行定量分析，本实验使用内参基因 GAPDH 对模板进行均一化处理。对照组、OGD组和乌帕替尼组基因之间表达差异通过2−ΔΔCt计算。
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弃去培养基，用预冷的PBS清洗2遍，每孔加入50 μl预冷的RIPA裂解液，放冰上裂解5 min，收集裂解液，于4 ℃、14 000 g离心15 min，收集上清。二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度，用8% SDS-PAGE胶电泳分离蛋白，湿转至硝酸纤维素膜上，于封闭液室温封闭2 h后，更换为一抗在4 ℃孵育过夜，用等渗缓冲液(TBST)漂洗5 min（3次），加入荧光二抗室温避光孵育1 h，漂洗干净后用Odyssey双色红外激光扫描成像系统对膜进行扫描。图像条带通过image J软件进行分析，计算蛋白表达量。
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使用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据用均数±标准差(
$\bar x \pm s$ )表示。采用单因素方差分析检验差异的显著性，P<0.05表示有统计学意义。 -
结果如图1所示，BV2细胞OGD 3 h后细胞的生存率较未进行OGD的对照组明显降低（P<0.01），给予乌帕替尼后生存率较OGD组差异无统计学意义（图1A）；在OGD 4 h后，与对照组相比，OGD组细胞生存率明显降低（P<0.01），而与OGD组相比，乌帕替尼200 μmol/L浓度下能显著提高BV2细胞生存率（P<0.05）（图1B）。因此，选择OGD 4 h作为后续实验条件，选择乌帕替尼200 μmol/L作为后续实验药物浓度。
图 1 乌帕替尼对OGD/R诱导的BV2细胞损伤的影响
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结果如图（图2）所示，与对照组相比，OGD组BV2细胞M1型标志物：CD11b、CD32、iNOS的mRNA水平均明显增加（P<0.05），而M2型标志物：Arg-1、IL-10、CD206的mRNA水平改变无统计学意义。与OGD组相比，给予乌帕替尼后CD11b（P<0.01）、CD32（P<0.05）、iNOS（P<0.01）的mRNA水平均显著减少，M2型标志物mRNA水平改变无统计学意义。
图 2 乌帕替尼对OGD/R后BV2细胞极化的影响
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从细胞划痕实验结果（图3）中可以看出，与对照组相比，OGD组BV2细胞在6 h（P<0.05）、12 h（P<0.05）和24 h（P<0.01）细胞迁移率均明显增加，而与OGD组相比，乌帕替尼给药组在6 h和12 h细胞迁移率的改变无统计学意义，在给药24 h后的细胞迁移率明显降低（P<0.05）。
图 3 乌帕替尼对BV2细胞OGD后迁移能力的影响
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与对照组相比，OGD组培养基中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明显升高（P<0.01）。与OGD组相比，乌帕替尼给药组IL-1β（P<0.05）、IL-6（P<0.01）、TNF-α（P<0.05）等3种炎性因子水平均显著降低（图4）。
图 4 乌帕替尼对BV2细胞OGD/R后培养基中炎性因子水平的影响
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结果如图所示，与对照组相比，条件培养基共培养12 h的OGD组PC12细胞生存率明显降低（P<0.01），在给予乌帕替尼条件培养基后，PC12细胞生存率较OGD组增加无统计学意义（图5A）；共培养24 h的OGD组细胞生存率较对照组明显减少（P<0.01），而乌帕替尼组较OGD组PC12细胞生存率明显增加（P<0.05）（图5B）。
图 5 乌帕替尼对共培养PC12细胞OGD后细胞生存率的影响
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结果如图所示，在OGD/R损伤后，BV2细胞p-JAK1和p-STAT6蛋白表达水平较对照组显著增加（P<0.01），在给予乌帕替尼后，p-JAK1和p-STAT6蛋白表达水平较OGD组显著降低（P<0.01）（图6B, 6C）。
图 6 乌帕替尼对OGD/R后BV2细胞JAK1/STAT6信号通路相关蛋白表达水平的影响
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神经炎症与神经系统疾病密切相关[14]，而小胶质细胞是神经系统参与炎症反应的关键细胞，小胶质细胞经刺激后活化，根据其激活状态分为M1型和M2型2种表型，中枢神经系统(CNS)中的小胶质细胞可以是促炎的，也可以有神经保护的作用，这取决于它们的激活状态。促炎型小胶质细胞表达促炎因子IL-1、TNF-α、IL-6、一氧化氮(NO)等，会对神经系统有不利影响[15]；而抗炎型小胶质细胞则会引起多种抗炎因子释放，如FIZZ1、Chi3I3、精氨酸酶1、Ym1、CD206、胰岛素样生长因子1（IGF-1）和Fzd1等，这些细胞因子可能参与神经保护和组织愈合[16]。
哺乳动物JAK激酶家族由3个JAKs（JAK1、JAK2、JAK3）和酪氨酸激酶2（TYK2）组成，它们经多种细胞因子触发，选择性地结合不同的受体，从而作为信号传导器在细胞内发挥作用[17]。JAK激酶激活下游的STAT蛋白，激活的STAT蛋白作为转录因子，转运到细胞核，上调促炎性细胞因子和生长因子基因[18]。本研究将JAK1选择性抑制剂乌帕替尼作用于OGD/R后的BV2小胶质细胞，结果显示乌帕替尼能增加OGD/R后BV2细胞的生存率。在发生急性脑卒中后，脑内的小胶质细胞通常会迁移至损伤部位[19]，而受到损伤部位刺激后，小胶质细胞会极化为M1型加重了缺血损伤[20]，于是笔者对BV2小胶质细胞OGD/R后的极化和迁移能力进行检测，发现BV2细胞在OGD/R后，其M1型标志物CD11b、CD32、和iNOS的mRNA水平明显升高，在乌帕替尼处理后，M1型标志物水平明显减少，这个结果表明，乌帕替尼能抑制BV2小胶质细胞向M1型极化，划痕实验结果可以看出乌帕替尼能抑制BV2细胞OGD/R后的迁移能力。为了进一步研究小胶质细胞极化后对神经系统的影响，本实验检测了OGD/R后BV2细胞培养基中炎症因子的含量，研究结果显示，乌帕替尼可减少OGD/R后BV2细胞分泌的炎症因子。之后将OGD/R后的BV2细胞条件培养基稀释一半后加入到OGD 4 h后的PC12细胞中，实现OGD/R后BV2细胞的条件培养基与OGD后PC12细胞之间的共培养，共培养结果显示，经乌帕替尼处理的BV2细胞的条件培养基能提高OGD/R后PC12细胞的生存率。乌帕替尼为JAK1选择性抑制剂，而JAK/STAT信号通路与神经炎症密切相关，于是本研究通过Western blot检测乌帕替尼对OGD 4 h/R 24 h后BV2细胞JAK1/STAT6信号通路相关蛋白的表达水平，发现经OGD/R处理后的BV2小胶质细胞JAK1和STAT6磷酸化蛋白的表达水平明显增加，而乌帕替尼处理后可明显减少JAK1和STAT6蛋白的激活，从而抑制BV2细胞炎症通路，减少由BV2小胶质细胞经激活后引起的神经炎症。
综上所述，乌帕替尼能抑制BV2细胞经OGD/R刺激后向M1型极化，抑制其迁移能力并减少炎症因子的释放，通过调控JAK1/STAT6信号通路抑制炎症反应起到神经保护的作用。乌帕替尼目前已被批准用于类风湿关节炎的治疗，但是对神经系统炎症疾病治疗的研究非常少，其抑制JAK/STAT信号通路对脑缺血损伤可能具有保护作用。
Effects of upadacitinib on BV2 cells after oxygen–glucose deprivation/recovery
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摘要:
目的 研究乌帕替尼对氧糖剥夺再复氧（OGD/R）后BV2小胶质细胞极化及炎症的影响，并探讨其作用机制。 方法 实验分对照组、OGD组和乌帕替尼组3组。BV2细胞经OGD/R处理后，噻唑蓝试剂(MTT)检测细胞生存率，划痕实验观察细胞迁移能力，实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)检测BV2细胞M1型极化标志物（CD11b、CD32、iNOS）和M2型极化标志物（Arg-1、IL-10、CD206）的mRNA水平，酶联免疫吸附测定(ELISA)检测培养基中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，蛋白质印迹法(Western Blot)检测JAK1/STAT6通路相关蛋白表达水平。 结果 乌帕替尼能增加OGD/R后BV2细胞的生存率（P<0.05），能减少BV2细胞向M1型极化（P<0.05）。乌帕替尼可明显降低OGD/R诱导的BV2细胞的迁移能力（P<0.05），减少OGD/R诱导BV2细胞分泌的炎症因子：IL-1β、IL-6、TNF-α（P<0.05）。乌帕替尼提高共培养PC12细胞的生存率（P<0.05）。乌帕替尼可显著抑制由OGD/R诱导激活BV2细胞p-JAK1和p-STAT6蛋白的表达水平（P<0.05）。 结论 乌帕替尼可减少OGD/R诱导BV2细胞向M1型极化和减少炎症反应，与JAK1/STAT6通路有关。 -
关键词:
- 乌帕替尼 /
- 氧剥夺/复氧 /
- 极化，炎症，酪氨酸激酶/信号传导及转录激活因子
Abstract:Objective To investigate the effects of upadacitinib on the polarization and inflammation of BV2 microglia after oxygen glucose deprivation/recovery (OGD/R) and to explore its mechanism of action. Methods The experiment was divided into 3 groups: control group, OGD group and upadacitinib treatment group. After BV2 cells were treated with OGD/R, MTT was used to detect cell survival rate. Wound scratch assay was used to detect the cell migration ability. qPCR was used to detect mRNA levels of M1-type polarization markers (CD11b, CD32, iNOS) and M2-type polarization markers (Arg-1, IL-10, CD206) of BV2 cells. ELISA was used to detect the levels of IL-1β, IL-6, and TNF-α in the culture medium. Western blot was used to detect the expression levels of JAK1/STAT6 pathway-related proteins. Results Upadacitinib increased the survival of BV2 cells after OGD/R (P<0.05), reduced the polarization of BV2 cells to M1 type (P<0.05). Upadacitinib significantly decreased the migration ability of BV2 cells induced by OGD/R (P<0.05), reduced the inflammatory factors secreted by BV2 cells induced by OGD/R: IL-1β, IL-6, TNF-α (P<0.05). Upadacitinib increased the survival rate of co-cultured PC12 cells (P<0.05). Upadacitinib significantly inhibited the expression levels of p-JAK1 and p-STAT6 proteins in BV2 cells activated by OGD/R induction (P<0.05). Conclusion Upadacitinib decreases polarization of BV2 induced by OGD/R to M1 type and reduces inflammation, which is related to JAK1/STAT6 pathway. -
Key words:
- upadacitinib /
- OGD/R /
- polarization, inflammation, JAK/STAT
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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图 1 乌帕替尼对OGD/R诱导的BV2细胞损伤的影响
A.OGD（3 h）/R（24 h）；B.OGD（4 h）/R（24 h）##P<0.01，与对照组比较；*P<0.05，与OGD组比较（n=6）
图 2 乌帕替尼对OGD/R后BV2细胞极化的影响
A.BV2细胞CD11b的mRNA水平；B.CD32的mRNA水平；C.iNOS的mRNA水平；D.Arg-1的mRNA水平；E.IL-6的mRNA水平；F.CD206的mRNA水平；#P<0.05，与对照组比较；**P<0.01，*P<0.05，与OGD组比较（n=3）。
图 3 乌帕替尼对BV2细胞OGD后迁移能力的影响
A.BV2细胞0~24 h迁移的变化，白色区域：BV2细胞，黄色曲线：细胞迁移边界的轮廓；B.BV2细胞OGD后6 h细胞迁移率；C.BV2细胞OGD后12 h细胞迁移率；D.BV2细胞OGD后24 h细胞迁移率；##P<0.01，#P<0.05，与对照组比较；*P<0.05，与OGD组比较（n=6）
图 4 乌帕替尼对BV2细胞OGD/R后培养基中炎性因子水平的影响
A.培养基IL-1β水平；B.培养基IL-6水平；C.培养基TNF-α水平 ##P<0.01，与对照组比较；**P<0.05，*P<0.05，与OGD组比较（n=6）
图 5 乌帕替尼对共培养PC12细胞OGD后细胞生存率的影响
A.PC12细胞OGD 4 h，条件培养基共培养12 h的细胞生存率；B.PC12细胞OGD 4 h，条件培养基共培养24 h的细胞生存率；##P<0.01，与对照组比较； *P<0.05，与OGD组比较（n=6）
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