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钙调神经磷酸酶抑制剂（CNI）于20世纪90年代引入器官移植领域，是大多数实体器官移植免疫抑制方案的基石[1-2]。目前，94%的肾移植受者在移植后使用基于CNI的免疫抑制方案出院，90%以上的受者接受他克莫司治疗[3-4]。他克莫司主要通过细胞色素P450（如CYP3A4和CYP3A5等）代谢，由P-糖蛋白（P-gp）进行转运。研究表明，CYP3A5酶是他克莫司在人体主要的代谢酶，MDR1（编码P-gp的基因）的基因多态性也是肾移植术后他克莫司血药浓度的影响因素[5-6]。
《器官移植免疫抑制剂临床应用技术》（2019版）建议他克莫司服药后一个月内血药浓度需控制在8～12 ng/ml[7]，各移植中心的靶浓度根据具体给药方案、血药浓度检测试剂盒的规定而确定。我院器官移植中心靶浓度为10～15 ng/ml。但由于通常器官移植术后 5～7 d他克莫司的药物浓度达到稳态，这使得他克莫司首次给药剂量与首次的血药浓度检测值可能存在一定的时间差，因此需要尽早对给药剂量进行干预，以达到提高他克莫司的疗效和减少其不良反应的目的。
由于肾功能通常不会在肾移植术后完全恢复，移植受者具有慢性肾脏病第2或第3期的特征[8]，因此，本研究对我院在2013年至2017年做肾移植手术的尿毒症患者的CYP3A5（CYP3A5*3，6986A>G）及MDR1（C3435>T，G2677 >T/A，C1236>T）基因型进行检测，探讨其对于他克莫司血药浓度、血药浓度/剂量比值的影响，以及与最佳治疗浓度范围和患者肌酐水平的相关性，为开展早期肾移植患者的免疫抑制剂个体化管理，避免浓度过低造成免疫不足或浓度过高产生不良反应提供依据。
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选取2013年7月至2017年7月在上海长征医院被诊断为尿毒症，并接受同种异体肾移植的131例受者。其中男性患者89例，女性患者42例，年龄区间在6～68岁，无其他严重疾病。所有被选取的研究对象均签署了知情同意书。
入选标准：①首次进行肾移植手术的患者；②在治疗过程中使用他克莫司作为免疫抑制剂；③符合诊断标准，无其他严重疾病。排除标准：排除术前术后使用CYP3A酶诱导剂或抑制剂。
用药方案：临床诊断患者为慢性肾衰竭尿毒症期，后接受肾移植手术，术后采用他克莫司+霉酚酸类药物+激素的三联方案作为免疫抑制治疗方案。他克莫司初始剂量为0.1 mg/（kg·d），分2次给药。
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患者于入院检查时抽取外周血2 ml（EDTA-2K抗凝管），焦磷酸测序方法检测CYP3A5（CYP3A5*3，6986A>G）及MDR1（C3435>T，G2677>T/A，C1236>T）的基因型。
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患者前1晚8时服用他克莫司，次日早晨8时服药前抽取外周血2 ml（EDTA-2K抗凝管），通过微粒子酶免疫分析（美国雅培公司ARCHITECT i1000SR）检测他克莫司浓度。
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收集整理以上患者的他克莫司血药浓度、给药剂量、肌酐水平、红细胞比容，使用统计学方法比较患者基因型对于血药浓度的影响，研究免疫抑制剂最佳浓度范围。
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使用SPSS20.0软件进行统计学分析，计量资料均以（
$\bar x $ ±s）表示，采用χ2检验考察肾移植受者基因型上的等位基因分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，采用非参数检验Mann-Whitney U检验比较2组组间是否存在显著性差异，使用Kruskal-Wallis检验多个独立样本之间是否存在显著性差异，P≤0.05具有统计学意义。 -
患者在术后3周内的平均血药浓度趋近于14 ng/ml，如图1。患者术后每周他克莫司的平均给药剂量均在逐步减少，分别为（3.7±1.4）、（3.4±1.6）、（3.0±1.5）、（2.7±1.4）mg/d，如图2，但是不同患者的给药剂量差异较大，每周最大差异分别达到6.15倍、16.6倍、9.86倍和11.67倍。患者在术后1个月内的血药浓度与给药剂量的比值存在一个逐渐增大的过程，如图3，在第3周左右出现最大值。
图 1 肾移植受者他克莫司血药浓度与时间的变化趋势
图 2 肾移植受者他克莫司给药剂量与时间的变化趋势
图 3 肾移植受者他克莫司血药浓度/给药剂量与时间的变化趋势
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CYP3A5*3（A6986G）常见基因型为AA、AG、GG；MDR1（C1236T）常见基因型为CC、CT、TT；MDR1（G2677T/A）常见基因型为GG、GA、AA、GT、TT、AT；MDR1（C3435T）常见基因型为CC、CT、TT。在131例接受肾移植手术的尿毒症患者中，通过焦磷酸测序法测得患者CYP3A5和MDR1基因型的分布情况，详情见表1。经过χ2检验，结果显示以上各基因型的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05）。
表 1 CYP3A5与MDR1的基因型分布情况
基因 基因型 例数 百分比（%） CYP3A5*3
（A6986G）AA 7 5.3 AG 56 42.7 GG 68 51.9 MDR1
（C1236T）CC 49 37.4 CT 63 48.1 TT 19 14.5 MDR1
（G2677T/A）GG 29 22.1 GA 20 15.3 AA 1 0.8 GT 46 35.1 TT 17 13 AT 18 13.7 MDR1
（C3435T）CC 54 41.2 CT 58 44.3 TT 19 14.5 -
表 2 CYP3A5基因多态性与肾移植患者他克莫司血药浓度、给药剂量以及浓度/剂量比的关系
基因型 时间
（周）血药浓度
（ng/ml）给药剂量
（m/mg）浓度/剂量比
（C/D）CYP3A5*1/*1
（AA）1 13.3±6.0 4.4±2.1 3.6±3.0 2 12.4±3.9 4.7±2.3 3.0±1.3 3 12.6±4.7 4.5±2.0 3.0±0.9 4 11.4±3.4 4.4±1.9 2.9±1.2 CYP3A5*1/*3
（AG）1 13.6±5.4 4.3±1.3 3.5±2 2 14.7±5.4 4.1±1.4 4.0±2.0 3 14.3±4.4 3.6±1.3 4.4±1.7 4 12.0±3.3 3.1±1.3 4.3±1.6 CYP3A5*3/*3
（GG）1 14.9±6.6 3.1±1.2 5.6±3.7 2 14.4±5.1 2.7±1.3 6.4±3.6 3 13.7±4.4 2.4±1.2 7.1±4.7 4 11.9±3.5 2.2±1.2 6.7±3.3 术后1～2周内基因型为CYP3A5*1/*1（AA）和基因型为CYP3A5*1/*3（AG）的肾移植受者在血药浓度、给药剂量和浓度剂量比方面无显著性差异（P>0.05）。第3周和第4周剂量浓度比值方面存在显著性差异（P<0.05），基因型为*1/*1（AA）的浓度剂量比较小，其他各组在血药浓度和给药剂量方面无显著性差异（P>0.05）。
术后1～4周内基因型为CYP3A5*1/*1（AA）和基因型为CYP3A5*3/*3（GG）的肾移植受者在血药浓度方面无显著性差异（P>0.05），第1周内基因型为*1/*1（AA）与*3/*3（GG）的患者在给药剂量和浓度剂量比方面无显著性差异（P>0.05），但前者的平均给药剂量大于后者。在第2周到第4周*1/*1（AA）和*3/*3（GG）的患者在给药剂量和浓度剂量比值存在显著性差异（P<0.05）。
术后1～4周内基因型为CYP3A5*1/*3（AG）和基因型为CYP3A5*3/*3（GG）的肾移植受者在血药浓度方面无显著性差异（P>0.05），在给药剂量和浓度剂量比方面具有显著性差异（P<0.05）。
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术后1～4周 MDR1（C1236T）（表3），MDR1（G2677T/A）（表4）以及MDR1（C3435T）（表5）各基因的基因型患者，仅在MDR1（G2677T/A）基因型的患者术后第2周的血药浓度方面存在显著性差异（P<0.05），其余各基因的基因型患者血药浓度，给药剂量和浓度/剂量比方面均无显著性（P>0.05）。
表 3 MDR1（C1236T）基因多态性与他克莫司血药浓度、给药剂量以及浓度/剂量比的关系
基因型 时间
（周）血药浓度
（ng/ml）给药剂量
（m/mg）浓度/剂量比
（C/D）MDR1（C1236T）
CC1 12.6±4.6 3.7±1.4 4.1±2.5 2 15.4±5.3 3.4±1.7 5.2±1.9 3 13.8±4.0 3.0±1.6 6.3±5.2 4 12.0±2.6 2.8±1.7 5.7±3.4 MDR1（C1236T）
CT1 15.1±6.8 3.7±1.4 4.6±2.9 2 13.6±4.9 3.5±1.6 5.0±3.5 3 13.7±5.1 3.2±1.5 5.2±3.4 4 11.8±3.4 2.9±1.4 5.1±2.8 MDR1（C1236T）
TT1 13.7±5.5 3.7±1.4 4.6±3.7 2 15.0±5.4 3.4±1.6 5.3±3.1 3 14.1±3.4 3.0±1.4 6.0±3.8 4 12.0±3.7 2.6±1.3 5.8±3.0 表 4 MDR1（G2677T/A）基因多态性与他克莫司血药浓度、给药剂量以及浓度/剂量比的关系
基因型 时间
（周）血药浓度
（ng/ml）给药剂量
（m/mg）浓度/剂量比
（C/D）MDR1（G2677T/A）
AA1 12.5±0 3.9±0 3.2±0 2 18.5±0 3.6±0 5.1±0 3 9.9±0 3.4±0 2.9±0 4 12.6±0 3.3±0 3.8±0 MDR1（G2677T/A）
AT1 15.8±6.2 3.8±1.5 5.0±3.7 2 13.1±4.8 3.5±1.6 5.3±5.0 3 12.6±4.1 3.4±1.6 4.3±1.9 4 12.2±3.6 3.4±1.7 4.5±2.3 MDR1（G2677T/A）
GA1 13.5±6.6 3.4±1.2 4.5±2.8 2 12.0±5.0 3.1±1.3 4.3±1.8 3 13.2±4.6 2.9±1.3 5.4±2.8 4 11.7±3.0 2.7±1.3 5.7±3.5 MDR1（G2677T/A）
GG1 14.1±6.0 3.9±1.6 4.1±2.2 2 16.3±5.9 3.5±1.8 5.8±3.4 3 15.9±5.0 3.0±1.8 7.6±6.1 4 11.2±3.0 2.6±1.6 5.7±3.2 MDR1（G2677T/A）
GT1 14.7±6.6 3.7±1.5 4.8±3.5 2 14.6±4.6 3.5±1.6 5.1±2.5 3 13.6±4.3 3.0±1.4 5.5±2.9 4 11.7±3.7 2.5±1.1 5.5±2.8 MDR1（G2677T/A）
TT1 12.8±4.0 3.5±1.1 4.4±3.4 2 14.5±4.9 3.4±1.3 5.3±3.2 3 13.7±2.3 3.1±1.2 5.2±2.5 4 13.5±3.4 2.7±1.2 6.0±3.0 表 5 MDR1（C3435T）基因多态性与他克莫司血药浓度、给药剂量以及浓度/剂量比的关系
基因型 时间
（周）血药浓度
（ng/ml）给药剂量
（m/mg）浓度/剂量比
（C/D）MDR1（C3435T）
CC1 14.7±6.6 3.8±1.4 4.4±2.5 2 14.8±5.5 3.4±1.6 5.3±3.0 3 14.7±4.9 3.0±1.5 6.7±5.2 4 11.8±3.0 2.6±1.4 5.8±3.4 MDR1（C3435T）
CT1 14.6±5.9 3.7±1.5 4.8±3.6 2 14.1±4.8 3.5±1.6 5.1±3.3 3 13.4±4.2 3.1±1.5 5.0±2.2 4 11.7±3.7 2.8±1.4 5.0±2.4 MDR1（C3435T）
TT1 11.9±4.8 3.4±1.1 4.1±3.4 2 14.4±5.5 3.3±1.3 5.2±3.2 3 13.2±2.7 2.9±1.2 5.2±2.5 4 13.0±3.6 2.6±1.2 5.9±2.9 -
以患者术后1个月的血药浓度为依据，将患者分为5组，由表6可知：各组的肌酐水平存在显著性差异（P<0.05），而各组患者红细胞比容、年龄及性别则无显著性差异（P>0.05）。可以看出他克莫司血药浓度控制在10～13 ng/ml时患者的肌酐水平最接近于正常值。
表 6 他克莫司血药浓度与患者性别、年龄、红细胞比容和肌酐值的关系
项目 血药浓度
（ng/ml）V>16血药浓度（ng/ml）
16>VI≥13血药浓度（ng/ml）
13>III≥10血药浓度（ng/ml）
10>II≥7血药浓度（ng/ml）
17>I≥4性别 16 (M); 6 (F) 10 (M);10 (F) 35 (M);12 (F) 22 (M);8 (F) 2 (M);2 (F) 年龄（y） 42.5±13.9 39.2±15.2 41.7±13.2 40.9±14.8 32.3±6.8 红细胞比容(%) 31.9±4.7 31.3±4.3 34.5±12.1 34.2±9.9 28.7±8.5 肌酐（μmol/L） 216.7±196.8 157.6±123.3 128.8±67.3 159.5±266.4 174.8±47.5 -
在《中国肾移植后免疫抑制治疗指南》中，他克莫司+霉酚酸类药物+激素类药物的三联疗法已经成为临床上治疗肾移植后免疫排斥反应的默认疗法。指南中规定，以肾移植受者服用他克莫司后次日晨服药前的谷浓度作为检测指标，在接受手术后1个月内血药浓度要控制在10～15 ng/ml，3个月以内为8～15 ng/ml，一年以内为5-12 ng/ml [1]。本研究发现肾移植术后1个月时，为了维持目标血药浓度，不同受者之间他克莫司所需要的剂量差异最高可高达16.6倍，此情况与前期文献报道的最大差异可高达12倍的情况一致[9]。
研究发现，CYP3A5*3的基因型突变出现在中国人群中的概率高达78.8%[10]，因此， CYP3A5基因型检测已经成为目前器官移植患者使用他克莫司个体化给药的必备手段。本研究的结果表明，术后1～4周基因型为AG的患者在给药剂量及浓度剂量比方面与基因型为GG的患者存在显著性差异（P<0.05），术后2～4周基因型为AA的患者在给药剂量及浓度剂量比方面与基因型为GG的患者存在显著性差异（P<0.05）。CYP3A5*3等位基因的存在对他克莫司血药浓度具有显著性影响。可以看出不同基因型的患者在他克莫司血药浓度维持在治疗浓度的时候，带有CYP3A5*3等位基因的患者给药剂量小于带有CYP3A5*1等位基因的患者。浓度/剂量比也反映了CYP3A5等位基因的出现会导致他克莫司代谢的降低，而且CYP3A5*3等位基因的数量越多，对代谢的影响就越大。即对他克莫司的代谢速率，纯合子>杂合子>野生型，野生型的基因型代谢速率可能近似于杂合子和纯合子的50%～70%。因此，在临床上对这类患者需要降低他克莫司的给药剂量，以避免出现毒副作用。
对于不同MDR1基因型的患者，仅发现患者为MDR1（G2677T/A）基因的情况下，术后第2周他克莫司血药浓度具有显著性差异（P<0.05），其余均无显著性差异。在131例肾移植受者中，仅有1例MDR1（G2677T/A）AA的患者，可能导致分析的不准确。现有关于MDR1基因多态性对他克莫司血药浓度的影响意见也各不相同。Meta分析显示亚洲人群肾移植患者术后他克莫司血药浓度/剂量值与MDR1基因C3435T多态性相关, 其相关性为TT>CT>CC。有报道认为MDR1基因G2677T/A突变型的患者中, 他克莫司的血药浓度比野生型个体高44.7% [11]。本研究表明，CYP3A5（*1*1）每日对他克莫司剂量需求最高，CYP3A5（*3*3）最低，与文献报道一致[12]。以往的研究表明，当CYP3A5基因型出现突变时，MDR1基因对他克莫司血药浓度的影响很小[13-14]。如果将研究局限于CYP3A5基因型为AA的患者中，则携带4～6个MDR1等位基因的患者较携带0～3个等位基因的患者具有较高的剂量要求[15]。由于本研究中CYP3A5基因型为AA的患者仅有7例，受限于样本量过小，难以说明MDR1基因型对于他克莫司血药浓度的影响。
临床实践和众多的文献表明，遗传因素是造成肾移植受者他克莫司谷浓度及浓度/剂量比个体差异的重要原因，我们的研究结果也与之一致。更重要的是，我们发现同一基因型的患者，他克莫司的浓度/剂量比在早期呈现逐渐减小的趋势，与之对应的给药剂量随着移植时间延长逐渐减小，且肌酐逐渐降低接近至正常人水平，说明患者肾功能处于恢复期。当患者血药浓度为10～13 ng/ml的时候，患者移植的肾功能最接近正常人肾功能水平。因此，采用现代分子生物学技术在移植术前检测患者的基因型，这对依据其基因型确定器官移植术后免疫抑制剂的剂量、改善患者预后有重要的指导意义。
Effect of CYP3A5 and MDR1 gene polymorphism on blood concentration of tacrolimus and creatinine level in uremic patients during the early phase of kidney transplantation
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摘要:
目的 评价真实临床实践中CYP3A5（CYP3A5*3，6986A>G）及MDR1（C3435>T，G2677 >T/A，C1236>T）基因多态性对尿毒症患者接受肾移植术后早期他克莫司血药浓度的影响及其最佳治疗浓度。 方法 以入选2013～2017年单中心的131例首次肾移植术且术后以他克莫司为基础进行三联免疫治疗的患者为对象，开展回顾性研究，考察患者基因多态性对他克莫司的日剂量、血药浓度、血药浓度/剂量比值和肌酐水平的影响。 结果 在维持他克莫司靶浓度（10～15 ng/ml）的前提下，肾移植术后4周内基因型为CYP3A5*3/*3（GG）肾移植受者的给药剂量低于基因型CYP3A5*1/*1（AA）和CYP3A5*1/*3（AG）。患者血药浓度在10～13 ng/ml内时，其血肌酐水平最接近正常值。 结论 CYP3A5基因多态性影响肾移植受者他克莫司的血药浓度，未发现MDR1基因多态性对他克莫司血药浓度的影响。早期肾移植血药浓度控制在10～13 ng/ml时，患者移植肾功能最接近正常人肾功能水平。 Abstract:Objective To investigate the effect of CYP3A5 and MDR1 gene polymorphisms on blood concentration of tacrolimus and creatinine level in uremic patients during the early phase after kidney transplantation in real clinical practice. Methods 131 patients who underwent kidney transplantation for the first time with triple immunotherapy based on tacrolimus in single-center from 2013 to 2017 were enrolled for retrospective study. Tacrolimus daily dose, blood concentration, blood concentration-to-dose ratio, and serum level were compared according to the various genotypes of CYP3A5 and MDR1 polymorphisms in renal transplantation recipients, respectively. Results The dosage of tacrolimus in CYP3A5*3/*3 (GG) kidney transplantation recipients within 4 weeks after kidney transplantation was lower than those of CYP3A5*1/*1 (AA) and CYP3A5*1/*3 (AG). The serum creatinine levels of patients whose tacrolimus concentration in the range of 10-13 ng/ml were close to the normal value. Conclusion CYP3A5 gene polymorphism affects the blood concentrations of tacrolimus in renal transplant recipients. No association has been found between the blood concentrations of tacrolimus and MDR1 gene polymorphism. Tacrolimus concentration in the range of 10-13 ng/ml might contribute to restore the early kidney graft function. -
Key words:
- tacrolimus /
- kidney transplantation /
- creatinine /
- CYP3A5 /
- MDR1
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超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
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表 1 CYP3A5与MDR1的基因型分布情况
基因 基因型 例数 百分比（%） CYP3A5*3
（A6986G）AA 7 5.3 AG 56 42.7 GG 68 51.9 MDR1
（C1236T）CC 49 37.4 CT 63 48.1 TT 19 14.5 MDR1
（G2677T/A）GG 29 22.1 GA 20 15.3 AA 1 0.8 GT 46 35.1 TT 17 13 AT 18 13.7 MDR1
（C3435T）CC 54 41.2 CT 58 44.3 TT 19 14.5 
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表 2 CYP3A5基因多态性与肾移植患者他克莫司血药浓度、给药剂量以及浓度/剂量比的关系
基因型 时间
（周）血药浓度
（ng/ml）给药剂量
（m/mg）浓度/剂量比
（C/D）CYP3A5*1/*1
（AA）1 13.3±6.0 4.4±2.1 3.6±3.0 2 12.4±3.9 4.7±2.3 3.0±1.3 3 12.6±4.7 4.5±2.0 3.0±0.9 4 11.4±3.4 4.4±1.9 2.9±1.2 CYP3A5*1/*3
（AG）1 13.6±5.4 4.3±1.3 3.5±2 2 14.7±5.4 4.1±1.4 4.0±2.0 3 14.3±4.4 3.6±1.3 4.4±1.7 4 12.0±3.3 3.1±1.3 4.3±1.6 CYP3A5*3/*3
（GG）1 14.9±6.6 3.1±1.2 5.6±3.7 2 14.4±5.1 2.7±1.3 6.4±3.6 3 13.7±4.4 2.4±1.2 7.1±4.7 4 11.9±3.5 2.2±1.2 6.7±3.3
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表 3 MDR1（C1236T）基因多态性与他克莫司血药浓度、给药剂量以及浓度/剂量比的关系
基因型 时间
（周）血药浓度
（ng/ml）给药剂量
（m/mg）浓度/剂量比
（C/D）MDR1（C1236T）
CC1 12.6±4.6 3.7±1.4 4.1±2.5 2 15.4±5.3 3.4±1.7 5.2±1.9 3 13.8±4.0 3.0±1.6 6.3±5.2 4 12.0±2.6 2.8±1.7 5.7±3.4 MDR1（C1236T）
CT1 15.1±6.8 3.7±1.4 4.6±2.9 2 13.6±4.9 3.5±1.6 5.0±3.5 3 13.7±5.1 3.2±1.5 5.2±3.4 4 11.8±3.4 2.9±1.4 5.1±2.8 MDR1（C1236T）
TT1 13.7±5.5 3.7±1.4 4.6±3.7 2 15.0±5.4 3.4±1.6 5.3±3.1 3 14.1±3.4 3.0±1.4 6.0±3.8 4 12.0±3.7 2.6±1.3 5.8±3.0
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表 4 MDR1（G2677T/A）基因多态性与他克莫司血药浓度、给药剂量以及浓度/剂量比的关系
基因型 时间
（周）血药浓度
（ng/ml）给药剂量
（m/mg）浓度/剂量比
（C/D）MDR1（G2677T/A）
AA1 12.5±0 3.9±0 3.2±0 2 18.5±0 3.6±0 5.1±0 3 9.9±0 3.4±0 2.9±0 4 12.6±0 3.3±0 3.8±0 MDR1（G2677T/A）
AT1 15.8±6.2 3.8±1.5 5.0±3.7 2 13.1±4.8 3.5±1.6 5.3±5.0 3 12.6±4.1 3.4±1.6 4.3±1.9 4 12.2±3.6 3.4±1.7 4.5±2.3 MDR1（G2677T/A）
GA1 13.5±6.6 3.4±1.2 4.5±2.8 2 12.0±5.0 3.1±1.3 4.3±1.8 3 13.2±4.6 2.9±1.3 5.4±2.8 4 11.7±3.0 2.7±1.3 5.7±3.5 MDR1（G2677T/A）
GG1 14.1±6.0 3.9±1.6 4.1±2.2 2 16.3±5.9 3.5±1.8 5.8±3.4 3 15.9±5.0 3.0±1.8 7.6±6.1 4 11.2±3.0 2.6±1.6 5.7±3.2 MDR1（G2677T/A）
GT1 14.7±6.6 3.7±1.5 4.8±3.5 2 14.6±4.6 3.5±1.6 5.1±2.5 3 13.6±4.3 3.0±1.4 5.5±2.9 4 11.7±3.7 2.5±1.1 5.5±2.8 MDR1（G2677T/A）
TT1 12.8±4.0 3.5±1.1 4.4±3.4 2 14.5±4.9 3.4±1.3 5.3±3.2 3 13.7±2.3 3.1±1.2 5.2±2.5 4 13.5±3.4 2.7±1.2 6.0±3.0
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表 5 MDR1（C3435T）基因多态性与他克莫司血药浓度、给药剂量以及浓度/剂量比的关系
基因型 时间
（周）血药浓度
（ng/ml）给药剂量
（m/mg）浓度/剂量比
（C/D）MDR1（C3435T）
CC1 14.7±6.6 3.8±1.4 4.4±2.5 2 14.8±5.5 3.4±1.6 5.3±3.0 3 14.7±4.9 3.0±1.5 6.7±5.2 4 11.8±3.0 2.6±1.4 5.8±3.4 MDR1（C3435T）
CT1 14.6±5.9 3.7±1.5 4.8±3.6 2 14.1±4.8 3.5±1.6 5.1±3.3 3 13.4±4.2 3.1±1.5 5.0±2.2 4 11.7±3.7 2.8±1.4 5.0±2.4 MDR1（C3435T）
TT1 11.9±4.8 3.4±1.1 4.1±3.4 2 14.4±5.5 3.3±1.3 5.2±3.2 3 13.2±2.7 2.9±1.2 5.2±2.5 4 13.0±3.6 2.6±1.2 5.9±2.9
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表 6 他克莫司血药浓度与患者性别、年龄、红细胞比容和肌酐值的关系
项目 血药浓度
（ng/ml）V>16血药浓度（ng/ml）
16>VI≥13血药浓度（ng/ml）
13>III≥10血药浓度（ng/ml）
10>II≥7血药浓度（ng/ml）
17>I≥4性别 16 (M); 6 (F) 10 (M);10 (F) 35 (M);12 (F) 22 (M);8 (F) 2 (M);2 (F) 年龄（y） 42.5±13.9 39.2±15.2 41.7±13.2 40.9±14.8 32.3±6.8 红细胞比容(%) 31.9±4.7 31.3±4.3 34.5±12.1 34.2±9.9 28.7±8.5 肌酐（μmol/L） 216.7±196.8 157.6±123.3 128.8±67.3 159.5±266.4 174.8±47.5
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