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赶黄草（Penthori Chinensis Herba）在民间又名水泽兰、水杨柳等，以其为原料制成的单味成方制剂肝苏颗粒现收载于《中华人民共和国卫生部部颁标准中药成方制剂十三册》附录[1]。赶黄草是苗族的传统药物，主产于四川古蔺，具有清热、利湿、解毒、活血、平肝、健脾等功效[2]，可用于酒精性、非酒精性脂肪肝，淤积性、酒精性及其他诱导因素引起的肝损伤的保护和治疗[3-13]。赶黄草中化学成分类型众多，以黄酮类、萜类、酚酸类为其主要活性成分[14]。其中，具有以黄酮苷连接没食子酰基结构的大环多酚类化合物（图1）乔松素-7-O-[4'', 6''-(S)-六羟基二苯甲酰基]-β-D-葡萄糖苷（pinocembrin-7-O-[4'',6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose，PHG）、乔松素-7-O-[3''-O-没食子酰基-4'', 6''-(S)-六羟基二苯甲酰基]-β-D-葡萄糖苷（pinocembrin-7-O-[3''-O-galloyl-4",6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose，PGHG）、乔松素二氢查耳酮-7-O-[3''-O-没食子酰基-4'', 6''-(S)-六羟基二苯甲酰基]-β-D-葡萄糖苷（pinocembrin dihydrochalcone-7-O-[3''-O-galloyl-4'',6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose or thonningianin A，THA）的肝保护及抗肝纤维化活性较强[15-17]，同时也具有较好的降糖活性[18]，有较高的开发价值，故本实验建立HPLC法同时测定该3种化合物的含量，并通过正交试验优选其提取工艺，为该类成分的进一步开发研究提供前期基础。
图 1 赶黄草中大环多酚类成分的化学结构图
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从四川收集3批赶黄草药材（表1），药材经课题组孙连娜副教授鉴定为虎耳草科植物扯根菜（Penthorum chinense Pursh）的干燥地上部分。各批次药材均留样于上海中医药大学中药资源与生物技术研究中心。
表 1 赶黄草药材来源信息表
样品编号 采集地区 批号 提供单位 S1 四川古蔺 18110803 四川古蔺肝苏药业有限公司 S2 四川古蔺 18110804 四川古蔺肝苏药业有限公司 S3 四川古蔺 19050701 四川新荷花中药饮片有限公司 -
XS105DU 电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XS104 电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；HDM-10000B 数显电热套（上海利闻科学仪器有限公司）；N-1300旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）；1200型高效液相色谱仪（美国 Agilent 公司）；Centrifuge 5810R高速台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。
PHG对照品（批号：20181117）、PGHG对照品（批号：20181103）、THA对照品（批号：20181103）均由本实验室制备，且经HPLC归一化法检测表明纯度均在98%以上；水为超纯水；甲酸（色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；乙醇、甲醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司 ）。
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精密称定PHG、PGHG、THA对照品，加80%甲醇分别制成对照品储备液，质量浓度分别为0.610 4、0.604 4、0.485 2 mg/ml。
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取赶黄草药材粉末（过3号筛）1 g，精密称定后转移至250 ml锥形瓶中，精密移取并加入80%甲醇水溶液100 ml，称重确定初始重量，回流提取1 h，放至常温，加溶剂补至初始重量，摇匀，取样，过膜，取续滤液作供试品溶液。
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色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）；洗脱条件：梯度洗脱（0～20 min，32%→50% A，20～25 min，50%→90% A，25～30 min：90%→32% A）；其他参数：流速为1 ml/min，柱温为30℃，检测波长为280 nm，进样量为10 μl。在此色谱条件下，供试品溶液（图2）中PHG、PGHG、THA与其他成分均达到基线分离，分离度大于1.5，理论塔板数以PHG计不低于20 000。
图 2 标准品溶液（A-C）与药材提取液（D）HPLC图
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取“2.1.1”项方法制备的混合对照品溶液，依次稀释2、4、10、50、100倍，分别按“2.1.3”项色谱条件进样测定，以3种成分的进样浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，分别进行HPLC检测，线性拟合得回归方程。PHG、PGHG、THA的回归方程分别为：Y=18 575.798X+5.091 9（r=0.999 9），Y=21 923.382X+29.293 3（r=0.999 9），Y=21 544.589X−13.093 6（r=0.999 9），线性范围依次是6.10～610.40、6.04～604.40、4.85～485.20 μg/ml，以上表明3种化合物线性关系良好。
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取对照品溶液，按“2.1.3”项色谱条件进行HPLC检测，连续进样分析6次，记录峰面积。结果显示PHG峰面积的RSD为1.15%，PGHG峰面积的RSD为0.18%，THA峰面积的RSD为0.12%，表明所用仪器精密度良好。
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取赶黄草药材（S3，过3号筛）6份，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，再分别按“2.1.3”项色谱条件进行HPLC检测，记录峰面积，计算含量。结果显示样品中PHG的平均含量为5.83 mg/g，RSD为1.03%；PGHG平均含量为9.99 mg/g，RSD为0.91%；THA平均含量为1.31 mg/g，RSD为0.50%，表明本方法重复性良好。
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取赶黄草药材（S3，过3号筛）1份，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，分别放置0、4、8、12、24 h后取样，按“2.1.3”项色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示样品中PHG、PGHG、THA峰面积的RSD分别为1.72%、2.44%和4.06%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
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取同一批赶黄草药材（S3，过3号筛）6份，每份约0.5 g，精密称定，按照药材含有量1∶1的比例，分别精密加入PHG、PGHG、THA对照品，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项条件进行HPLC分析，记录峰面积，计算回收率。结果显示PHG、PGHG、THA加样回收率分别为102.04%、100.90%、101.55%，对应的RSD值分别为0.88%、0.82%、1.43%，表明该方法可靠。
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取各批次赶黄草药材（S1～S3，过3号筛）各3份，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液后按“2.1.3”项条件进行HPLC分析，记录峰面积并计算含量（表2）。
表 2 赶黄草中3种化合物的含量（n=3）
样品编号 PHG/
（mg/g）PGHG/
（mg/g）THA/
（mg/g）总含量/
（mg/g）S1 3.66 5.12 1.99 10.77 S2 7.06 8.26 1.77 17.09 S3 5.69 9.73 1.25 16.67 -
取赶黄草药材（S2）切成3～5 cm小段，称取50 g，加入60%乙醇溶液500 ml，分别采用浸渍法（浸渍24 h）、渗漉法（浸泡24 h后以5 ml/min的流速收集渗漉液）、回流法（加热回流1 h）提取。结果表明，浸渍法平均总提取率为36.67%，渗漉法平均总提取率为36.82%，回流法平均总提取率为71.99%。考察结果为回流法提取效果最佳，因此选择回流法作为提取方法。
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在确定提取方法为回流法的基础上，取赶黄草药材（S2），选择常规回流提取中对提取效果影响较大的因素：溶媒浓度（A）、提取时间（B）、溶媒用量（C）、提取次数（D）作为影响因素，每个因素各取3个水平，在平行操作条件下，设计L9（34）正交试验（表3）。
表 3 正交试验因素水平表
水平 A因素 B因素 C因素 D因素 溶媒浓度（%） 提取时间（t/h） 溶媒用量（倍） 提取次数（次） 1 40 1 10 1 2 60 2 20 2 3 80 3 30 3 以PHG、PGHG、THA的总提取率作为考察指标得正交试验结果（表4），根据极差大小可以看出各因素对赶黄草中大环多酚类成分的影响大小为A>B>D>C；进一步方差分析（表5）结果表明，溶媒浓度（A）对提取效果有显著影响（P<0.05），而其他3个因素无显著影响（P>0.05）。因此，根据正交试验得出的最佳组合为A3B1C3D2。
表 4 正交试验结果表
试验号 A因素 B因素 C因素 D因素 总提取率（%） 溶媒浓度（%） 提取时间（t/h） 溶媒用量（倍） 提取次数（次） 1 1 1 1 1 32.27 2 1 2 2 2 46.67 3 1 3 3 3 50.47 4 2 1 2 3 50.40 5 2 2 3 1 70.53 6 2 3 1 2 80.07 7 3 1 3 2 92.86 8 3 2 1 3 89.79 9 3 3 2 1 87.56 K1 129.41 175.54 202.15 190.37 K2 201.01 206.99 184.63 219.61 K3 270.21 218.11 213.86 190.66 极差R 46.93 14.19 9.74 9.75 表 5 方差分析表
因素 偏差平方和 自由度 F值 F临界值 P A 3303.955 2 22.901 F0.05 (2,2)=19
F0.10 (2,2)=9<0.05 B 324.996 2 2.253 >0.10 C 144.274 2 1.000 >0.10 D 188.129 2 1.304 >0.10 误差 144.274 2 − − − -
本实验比较并优化了供试品溶液制备方法，并考察了不同型号色谱柱、不同检测波长、不同流动相组成，在此基础上建立了赶黄草中PHG、PGHG、THA的HPLC检测方法，该法能使样品中测定成分与其他成分达到有效分离，峰型好，可简便快速分析样品，检测结果准确可靠。
在建立含量测定方法的基础上进行提取工艺优化。从毒性大小、常用性角度选择乙醇为溶媒，单因素实验结果显示回流法提取效果最佳，因此选择乙醇热回流法作为提取方法，对常规热回流法影响较大的4个因素进行3个水平设置，建立L9（34）正交试验组，以便考察不同参数设定值对赶黄草中大环多酚成分提取率的影响。通过极差及方差分析发现溶媒浓度（A）即乙醇浓度对提取率有显著性影响，而其他3个因素（B、C、D）均无显著性影响。经正交试验优选后的最佳提取工艺为A3B1C3D2，结合生产实际，从节约原料降低成本的角度，对无明显影响的3个因素进行适当调整，调整后的提取工艺为A3B2C1D2，即取赶黄草干药材，切3～5cm小段，加入10倍体积、浓度为80%的乙醇溶液，回流2次，每次2 h。按照该工艺，取3批药材各5 kg，进行3次放大验证试验，提取率均在90%以上，且RSD值为3.73%，说明该工艺稳定可行，可为赶黄草中该类成分的进一步开发研究打下基础。
Content determination and extraction process of macrocyclic polyphenols from Penthorum chinense Pursh
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摘要:
目的 建立HPLC法同时测定赶黄草中大环多酚类成分：乔松素-7-O-[4'', 6''-(S)-六羟基二苯甲酰基]-β-D-葡萄糖苷（PHG）、乔松素-7-O-[3''-O-没食子酰基-4'', 6''-(S)-六羟基二苯甲酰基]-β-D-葡萄糖苷（PGHG）、乔松素二氢查耳酮-7-O-[3''-O-没食子酰基-4'', 6''-(S)-六羟基二苯甲酰基]-β-D-葡萄糖苷（THA）的含量，并优化其最佳提取工艺。 方法 通过HPLC法测定PHG、PGHG、THA的含量，以PHG、PGHG、THA的总提取率为指标对赶黄草提取物进行分析，采用正交设计考察溶媒浓度、提取时间、溶媒用量、提取次数对提取率的影响，从而优化赶黄草大环多酚类成分的最佳提取工艺。 结果 在采用的含量测定方法下，PHG、PGHG、THA在线性范围内线性关系良好，加样回收率在100.90%～102.04%之间，RSD值均小于1.5%。最佳提取工艺为取赶黄草干药材，切3～5 cm小段，加入10倍体积、浓度为80%的乙醇水溶液，回流2次，每次2 h。该工艺下，大环多酚提取率超过90%。 结论 新建立的含量测定方法准确稳定，重复性好；经优化的提取工艺稳定可行，可为该类成分的进一步开发利用打下基础。 Abstract:Objective To establish an HPLC method for simultaneous assay of macrocyclic polyphenols from Penthorum chinense Pursh, pinocembrin-7-O-[4'', 6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose (PHG), pinocembrin-7-O-[3''-O-galloyl-4'', 6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose (PGHG) and pinocembrin dihydrochalcone-7-O-[3''-O-galloyl-4'', 6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucoside or thonningianin A (THA), and optimize the extraction process. Methods The total extraction rate of PHG, PGHG, THA was used as an investigated index to analyze the extracts from Penthorum chinense Pursh. Orthogonal design was applied to evaluate solvent amount, extraction time, solvent concentration and extraction times as the influencing factors for the optimal extraction process of macrocyclic polyphenols from Penthorum chinense Pursh. Results When this content assay method was adopted, there were good linear relationships for PHG, PGHG, THA in the linear range. The recoveries were between 100.90% to 102.04% with the RSDs below 1.5%. The optimal extraction process was involved in cutting Penthorum chinense Pursh into 3-5 cm, adding 10 times 80% ethanol aqueous solution by volume and refluxing 2 hours twice. The extraction rate of macrocyclic polyphenols was above 90% with this process. Conclusion This assay method is accurate, stable, and repeatable. The optimized extraction process is stable and feasible for further development and utilization. -
Key words:
- Penthorum chinense Pursh /
- HPLC /
- PHG /
- PGHG /
- THA /
- orthogonal method /
- extraction process
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近年来，随着肿瘤、器官移植和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等导致的免疫功能低下人群的增加，侵袭性真菌感染（IFIs）的发病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隐球菌和曲霉菌是IFIs最主要的致病菌，并且造成的病死率超过90%[3]。在念珠菌属中，白念珠菌（Candida. albicans）是院内血液感染最常见的致病菌原体，其在重症监护病房（ICU）患者中致病率超过17%，病死率高达40%[4-5]。临床上治疗IFIs的抗真菌药物主要包括：多烯类（两性霉素B）、核酸类（5-氟胞嘧啶）、唑类（氟康唑）和棘白菌素类（卡泊芬净）药物（图1）[6-7]。然而，由于临床上出现抗真菌药物严重的耐药性和毒副作用，IFIs的治疗效果相当有限。因此，迫切需要研发全新机制的抗真菌药物。
组蛋白乙酰化修饰（包括组蛋白乙酰化和去乙酰化）是表观遗传学研究的重要组成部分。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）将组蛋白和其他蛋白上的赖氨酸末端乙酰基去除，对染色体重塑和基因的表达起着重要作用[8-9]。目前HDAC抑制剂主要集中于抗肿瘤研究方向，且已有多个上市药物应用于肿瘤的治疗。据研究报道，真菌中的HDACs，如烟曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、酿酒酵母[13]和新生隐球菌的HDACs[14-15]参与了毒力相关的过程和形态变化。因此，抑制真菌HDACs可能是治疗IFIs的有效策略。
联合药物治疗是提高临床一线药物疗效并克服真菌耐药性的有效策略之一。真菌的耐药性涉及转录调节，其中染色体重塑和组蛋白修饰起主要作用。HDACs调节的组蛋白修饰在应激信号通路中起着至关重要的作用，这可能与真菌对各种环境（包括药物）的应激反应有关[16]。此外，已有研究报道，HDAC抑制剂与唑类药物联用具有协同增效作用[17-18]。例如，HDAC抑制剂MGCD290与氟康唑联用具有协同抗多种临床真菌分离株的作用[19]。
基于此，本研究首先对8个市售的HDAC抑制剂（图2）进行体外协同抗真菌活性测试，筛选结果显示化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有优秀的体外协同抗耐药白念珠菌活性。后续考察其与不同唑类药物联用时对不同念珠菌属的体外协同抗真菌活性，以及对正常细胞的毒性作用，以期为抗真菌药物的研发提供依据。
1. 材料和方法
1.1 实验试剂与菌株
临床分离的6株唑类耐药白念珠菌（编号：9893，10061，10060，9173，4108和0304103），2株唑类耐药热带念珠菌（编号：5008，10086），1株光滑念珠菌（编号：9073）和1株耳道念珠菌（编号：0029）由海军军医大学附属长征医院提供。菌株活化首先从−80 ℃中挑取菌株冻存液至YEPD液体培养基活化24 h,然后取10 μl菌悬液至1 ml YEPD中，并在30 ℃、200 r/min下培养16 h后待用。HUVEC细胞来源于中国科学院上海细胞库，并在新鲜配置的DMEM完全培养基中培养。
YEPD液体培养基：取10 g酵母浸膏、20 g葡萄糖、20 g蛋白胨溶解于1 000 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，保存于4 ℃条件下备用。RPMI 1640培养基：取10 g RPMI 1640（Gibco）粉末、34.5 g吗啡啉丙磺酸、2 g NaHCO3、2.7 g NaOH溶解于1 000 ml三蒸水中，经0.22 μm的微孔滤膜过滤与灭菌后，置于4 ℃条件下保存和备用。DMEM完全培养基：按照89% DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1%的双抗比例混匀制得，混匀后置于4 ℃条件下保存和备用。PBS缓冲液：10 × PBS 100 ml溶解于900 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，置于4 ℃条件下保存和备用。
1.2 仪器
THZ-92A气浴恒温振荡器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、MJ-150-I霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、LW100T生物显微镜（北京测维光电技术有限公司）、HDC-15K高速离心机（上海泰坦科技股份有限公司）、C170二氧化碳培养箱（BINDER GmbH）、infinite M200多功能酶标仪（Tecan Austria GmbH）、高压蒸汽灭菌锅、无菌洁净工作台。
1.3 棋盘式微量液基稀释法
本实验参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）公布的M27-A3方案中微量液基稀释法进行。首先，收集活化好的真菌细胞，PBS洗3次后用RPMI 1640培养基制成浓度为1×103 CFU/ml的菌悬液。按照每孔100 μl接种菌悬液至无菌96孔板中，1～9列加入倍半稀释的HDAC抑制剂，A～F行加入倍半稀释的氟康唑，其中G行只加氟康唑，第10列只加化合物，第11列为不加药的阴性对照组，后将96孔板置于35 °C条件下孵育48 h。测定每孔在630 nm处的吸光度A，依据公式：抑制率（%）=（A阳性对照孔−A化合物孔）/（A阳性对照孔−A阴性对照孔）× 100%，计算各孔对应的抑制率。如果某一孔和其左边孔对应的抑制率均大于80%，则该孔对应的化合物和FLC浓度分别作为FIC化合物和FIC氟康唑，利用协同指数公式：FICI =（FIC化合物./MIC80 化合物）+（FIC氟康唑/MIC80 氟康唑），计算各化合物对应的FICI。
1.4 时间-生长曲线实验
收集活化好的白念珠菌0304103稀释在RPMI 1640培养液中，保持菌浓度为1×105 CFU/ml。取5 ml稀释的菌悬液和不同浓度的待测药物加入50 ml的离心管中, DMSO组作为空白对照组和32 μg/ml FLC作为阳性对照。随后将50 ml的离心管置于30 °C条件下振荡培养（200 r/min），在多个时间点吸取不同药物组的真菌混悬液（100 μl）于96孔板上，测量A630值并使用GraphPad Prism 7作图。
1.5 真菌细胞总HDAC酶活性测试实验
收集指数生长期的白念珠菌0304103细胞（湿重为100 mg），然后用3 mg snailase、12 μl 2-巯基乙醇和3 ml snailase反应缓冲液等新鲜配置的真菌裂解液来处理它们，以制备真菌原生质体。真菌原生质体分散在PBS（20 ml）中以获得混悬液，然后往96孔板每孔中加入100 μl的混悬液和不同浓度的化合物Rocilinostat，并在35 °C下培育12 h。接着往每个孔中加入30 μmol/L的HDAC底物，于37°C下孵育6 h。随后添加100 μl HDAC酶促终止溶液并在37°C下孵育2 h。最后，在每个孔中取出100 μl培养物添加到黑板中，用Ex=360 nm，Em=460 nm来监测荧光强度并记录下来用于计算HDAC酶的抑制率。
2. 结果
2.1 化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有协同抗真菌活性
表1列出了HDAC抑制剂单独使用或与氟康唑联合使用的体外抗真菌活性筛选结果。MIC80为抑制80%真菌细胞生长的最低药物浓度。实验结果表明，8个HDAC抑制剂单独使用对耐药白念珠菌均无直接的抗真菌活性（MIC80>64 μg/ml）；而化合物Rocilinostat（FICI=0.039）和伏立诺他（FICI=0.125）与FLC联用时均表现出良好的协同抗真菌活性。其中，化合物Rocilinostat的协同活性最佳，值得进一步研究。
表 1 单用HDAC抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103的体外抗真菌活性(μg/ml)抑制剂 抑制剂 氟康唑 FICI 单用 联用 单用 联用 伏立诺他 >64 4 >64 4 0.125 Rocilinostat >64 2 >64 0.5 0.039 T3516 >64 64 >64 64 2 T6016 >64 64 >64 64 2 T6421 >64 32 >64 32 1 T2157 >64 32 >64 32 1 T1726 >64 64 >64 64 2 T3358 >64 32 >64 64 1.5 注: FICI值≤ 0.5表示协同，FICI值> 4表示拮抗；0.5<FICI<4表示不相关。 2.2 Rocilinostat与氟康唑或伏立康唑联用对多种白念珠菌的抗真菌活性
为进一步考察Rocilinostat是否具广谱的抗真菌作用，挑选9株临床分离的念珠菌属菌株进行协同抗真菌活性测试。如表2所示，Rocilinostat与FLC联合使用时，对两株耐FLC的白念珠菌（C. albicans 9173，FICI=0.094; C. albicans 4108, FICI=0.5）和对FLC敏感的光滑念珠菌（C. glabrata 9073）表现出协同增效作用，而对热带念珠菌（C. tropicis）和耳道念珠菌（C. auris）没有协同抗真菌活性。当Rocilinostat与伏立康唑（VRC）联用时，对耐VRC的白念珠菌（C. albicans 10060, FICI=0.033）表现出优异的协同抗真菌活性 (表3)。
表 2 Rocilinostat与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 氟康唑 Rocilinostat 氟康唑 9893 >64 >64 64 64 2 10061 >64 >64 64 64 2 10060 >64 >64 64 64 2 9173 >64 >64 4 2 0.094 4108 >64 >64 32 32 0.5 10186 >64 >64 64 64 2 5008 >64 >64 64 8 1.125 9073 32 4 32 8 0.375 0029 64 32 >64 32 1 表 3 Rocilinostat与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 伏立康唑 Rocilinostat 伏立康唑 0304103 >64 >64 32 2 0.531 10061 >64 >64 32 0.125 0.502 10060 >64 >64 2 0.125 0.033 2.3 Rocilinostat与氟康唑联用有效抑制真菌的生长
为进一步考察化合物Rocilinostat的协同抗真菌活性，我们又开展了时间-生长曲线实验。从图3结果可以看出，高浓度的氟康唑或Rocilinostat单独使用对真菌生长无抑制作用，而Rocilinostat与不同浓度的氟康唑联用能够有效抑制真菌的生长，且呈浓度依赖趋势 (图3中抑制剂为Rocilinostat)。
2.4 Rocilinostat对真菌细胞的选择性作用
采用HUVEC（人脐静脉内皮细胞）对化合物Rocilinostat进行细胞毒性的评价。结果如表4显示，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，IC50值为52.17 μmol/L (22.60 μg/ml)，相当于其发挥协同抗耐药真菌（C. albicans 0304103）活性MIC80值的44倍，表明Rocilinostat对真菌细胞具有较强的选择性作用。此外，我们还测试了化合物Rocilinostat对真菌总HDAC酶的抑制活性，结果表明，Rocilinostat对真菌HDAC酶抑制活性（IC50=0.41 μmol/L）优于泛HDAC抑制剂伏立诺他（IC50=1.03 μmol/L）。
表 4 Rocilinostat对正常细胞的毒性和真菌总HDAC酶活性IC50 (μmol/L)化合物 HUVEC 白念珠菌（总HDAC酶） Rocilinostat 52.17 0.41 伏立诺他 — 1.03 注: “—”表示没有测试。 3. 讨论
本研究从市售的8个HDAC抑制剂中筛选出协同活性最佳的化合物Rocilinostat。进一步研究发现Rocilinostat与氟康唑联用对白念珠菌和光滑念珠菌具有协同增效作用。此外，化合物Rocilinostat与伏立康唑联用对临床分离的耐药白念珠菌株同样具有优秀的抗真菌活性。更值得关注的是，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，其对真菌细胞具有很好的选择性。因此，HDAC抑制剂Rocilinostat可以作为一种低毒、有效的唑类抗真菌药物增效剂，为抗真菌药物的发展提供了新的研究基础。
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表 1 赶黄草药材来源信息表
样品编号 采集地区 批号 提供单位 S1 四川古蔺 18110803 四川古蔺肝苏药业有限公司 S2 四川古蔺 18110804 四川古蔺肝苏药业有限公司 S3 四川古蔺 19050701 四川新荷花中药饮片有限公司 
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表 2 赶黄草中3种化合物的含量（n=3）
样品编号 PHG/
（mg/g）PGHG/
（mg/g）THA/
（mg/g）总含量/
（mg/g）S1 3.66 5.12 1.99 10.77 S2 7.06 8.26 1.77 17.09 S3 5.69 9.73 1.25 16.67
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表 4 正交试验结果表
试验号 A因素 B因素 C因素 D因素 总提取率（%） 溶媒浓度（%） 提取时间（t/h） 溶媒用量（倍） 提取次数（次） 1 1 1 1 1 32.27 2 1 2 2 2 46.67 3 1 3 3 3 50.47 4 2 1 2 3 50.40 5 2 2 3 1 70.53 6 2 3 1 2 80.07 7 3 1 3 2 92.86 8 3 2 1 3 89.79 9 3 3 2 1 87.56 K1 129.41 175.54 202.15 190.37 K2 201.01 206.99 184.63 219.61 K3 270.21 218.11 213.86 190.66 极差R 46.93 14.19 9.74 9.75
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表 5 方差分析表
因素 偏差平方和 自由度 F值 F临界值 P A 3303.955 2 22.901 F0.05 (2,2)=19
F0.10 (2,2)=9<0.05 B 324.996 2 2.253 >0.10 C 144.274 2 1.000 >0.10 D 188.129 2 1.304 >0.10 误差 144.274 2 − − −
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