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先天性免疫是机体防御病毒感染的第一道防线也是获得性免疫触发的先决条件。当病毒进入机体细胞，胞质内的感受器即被活化，而胞质感受器启动的信号最终激活STING受体，诱导产生Ⅰ型IFN和促炎性因子。2012年首次报道STING上游通路的关键分子是cGAMP，可由胞质内的cGAS催化生成，cGAMP作为人体内的第二信使，在天然免疫信号通路中发挥着重要作用。cGAMP可与接头蛋白STING结合并活化STING，进一步激活TANK结合激酶1(TBK1），诱导转录因子干扰素调节因子3(IRF3）和NF-κB入核，产生Ⅰ型IFN和细胞因子，以便机体清除入侵的病原微生物，从而防御各种病毒感染[1]，维持机体健康稳态。cGAS-cGAMP-STING通路在抗病毒药物研发中的作用引起越来越多科学家的关注，本文就该通路的最新研究进展及其在抗病毒中的作用进行系统的梳理概括。
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STING是一种完整的内质网（ER）膜蛋白，可通过结合cGAS合成的2'3'-cGAMP形成二聚体，招募TBK1，磷酸化IRF3，从而使一系列的信号传递下去，最后诱导干扰素的产生。研究者早期认为cGAMP只存在于细菌等低等生物细胞中，直到2013年发现哺乳动物细胞中也含有cGAMP[2]。cGAMP作为第二信使，可以直接结合STING并活化STING及其上游关键合成酶cGAS。2012年陈志坚团队[3]检测到cGAS能感知到胞质DNA的存在，并激活一系列炎症反应。胞质DNA与cGAS结合，诱发cGAS的催化中心发生构象改变，把GTP和ATP转化为cGAMP。 Swanson等[4]发现cGAMP除了激活Ⅰ型IFN外，还激活了炎性小体，抑制DNA病毒的感染。
有研究显示，真核细胞中的cGAS-cGAMP-STING信号通路的抗病毒作用有着古老的进化起源，其进化于微生物对噬菌体的防御机制[5]。越来越多的研究发现该通路在癌症、抗病毒、抗炎症反应和疫苗研发等领域都是一个十分具有前景的医疗靶点[6-9]。
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cGAS-cGAMP-STING信号通路是被内源性和外源性的DNA所激活，因此，该通路主要针对DNA病毒起作用。DNA病毒主要包含疱疹病毒（HSV）、腺病毒（ADV）、伪狂犬病毒（PRV）、痘病毒（Poxvirus）和乙肝病毒（HBV）。cGAS-cGAMP-STING通路对DNA病毒的影响作用取决于DNA病毒种类，另外，相比于抑制病毒的复制，cGAS-STING通路更倾向通过抑制旁观者细胞（bystander cell）的传播来发挥抗病毒作用[10]，如卡波济肉瘤病毒（KSHV）。在人细胞模型、小鼠细胞模型和小鼠动物模型中，HSV-1感染后，STING促使NLRP3（NOD-like receptor protein 3）定位于内质网，并促进NLRP3的脱泛素化从而激活炎性小体，使得cGAS-cGAMP-STING-NLRP3在抗HSV-1感染中起到了重要作用[11-12]。β-连环蛋白可以促进cGAS-cGAMP-STING通路中Ⅰ型IFN的产生，从而更好地发挥抗HSV-1的作用。HSV-1的US3是HSV-1壳外蛋白，可作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，HSV-1可通过US3高度磷酸化β-连环蛋白以抵消β-连环蛋白的抗HSV-1作用[13]。Li等[14]通过IP和nano-LC-ESI-MS / MS分析进行的公正筛选已确定三结构域蛋白家族21（TRIM21）是泛素E3连接酶，能促进γ-干扰素诱导蛋白16（IFI16）进出，引起IFI16蛋白进入泛素-蛋白酶体途径降解，IFI16-K3 / 4 / 6R突变可延长IFI16的半衰期，诱导更多STING依赖性I型IFN和下游干扰素刺激基因（ISGs）表达，从而使细胞对HSV-1病毒感染更具有抵抗力。Zhou等[15]的研究发现阴离子通道LRRC8/VRAC是一个跨细胞膜转运cGAMP的转运蛋白，能将HSV-1感染细胞产生的cGAMP转运到非感染细胞中，激活STING信号和干扰素应答，从而发挥抗HSV-1作用。
另外，cGAS-cGAMP-STING通路在抗人类巨细胞病毒 (HCMV)中发挥着重要作用[16]。STING高表达可以显著降低HCMV在人成纤维细胞中的复制[17]。
Wang等[18]研究发现猪干扰素诱导的跨膜蛋白1（pIFITM1）是宿主抑制PRV感染的限制性因素，而PRV诱导的pIFITM1的表达依赖于cGAS-cGAMP-STING先天性免疫信号通路和Ⅰ型IFN受体。Cheng等[19]研究表明，cGAS-cGAMP-STING途径对于感知鼠痘病毒（ECTV）感染，诱导Ⅰ型IFN产生以及控制ECTV复制至关重要。ECTV是一种研究宿主与正痘病毒关系的有价值模型。实验表明，缺乏cGAS或STING的小鼠表现出较低的Ⅰ型IFN水平和较高的病毒载量，并且对鼠痘更敏感。但是，其对ECTV反应的作用目前尚不清楚。
Ito等[20]设计了STING通路的配体cGAMP作为HBV疫苗佐剂功效的动物实验，使野生型（WT）和HBV转基因（HBV-Tg）小鼠均接种乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和cGAMP，结果发现HBsAg和cGAMP的疫苗接种显著增强了WT和HBV-Tg小鼠对HBsAg的体液免疫和细胞免疫反应。cGAMP诱导了与辅助性T细胞1（Th1）和Th2响应相关的细胞因子的释放，并诱导激活了淋巴组织中的抗原呈递细胞。基于以上实验，Ito等认为cGAMP进行疫苗接种可以克服慢性HBV感染患者的耐受性。
Pepin等[21]证明cGAMP依赖连接蛋白转移至吞噬细胞可以调节抗DNA病毒效应，使上皮细胞和巨噬细胞共培养，上皮细胞中的cGAMP可以直接转移至巨噬细胞胞内，从而反式激活巨噬细胞中STING信号通路。cGAMP的转移依赖于上皮细胞中连接蛋白的表达，抑制连接蛋白的表达会使该途径的STING通路的激活减弱。cGAMP反式激活巨噬细胞又起到了正反馈的作用，放大了STING通路的抗病毒作用。Wang等[22]发现通过增加DNA传感器cGAS及其下游衔接蛋白STING的敏感性来对抗DNA病毒，此反应中Mn2+是必需的。Mn2+增强了cGAS对dsDNA的敏感性及其酶促活性，Mn2+还通过增加cGAMP-STING结合亲和力来增强STING活性。这些发现表明，Mn2+是宿主抵御DNA病毒的关键物质。
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虽然登革热病毒（DENV）是一种生命周期中没有DNA阶段的RNA病毒，它也可以通过STING的蛋白水解作用来操纵cGAS-STING介导的先天性免疫。Su等[23]进行的共培养细胞模型发现，随着人STING单倍型的不同，STING对DENV蛋白酶的敏感性也不同，在DENV感染后控制细胞因子的产生和病毒复制的效果也不同。外源重新激活的病毒DNA进一步增强了DENV蛋白酶与STING相互作用和裂解的能力。DENV感染会降低具有蛋白酶敏感性STING单倍型细胞的宿主先天性免疫。然而，研究者在鼠类和非人灵长类动物中也发现了对登革热蛋白酶耐受的STING，揭示STING可能是不同物种限制登革热病毒复制的一种宿主因子。
Gutjahr等[24]通过在鼻内单独给HIV-1 Gag p24纳米颗粒（NP-p24）或与2'3'-cGAMP合用一起接种于CB6F1小鼠，发现相对于单独接种NP-p24的小鼠，用NP-p24加2'3'-cGAMP接种的小鼠的病毒复制得到了更为有效的控制，且小鼠的黏膜和全身性HIV-1 Gag p24特异性IgA和IgG滴度非常高，但是，在单独接种NP-p24的小鼠中并未检测到。cGAMP并行引发体液免疫反应的能力，包括在黏膜表面分泌IgA，可能对某些病毒感染（如HIV-1）有作用。
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Hou团队[25]基于细胞分析，从合成的小分子中鉴定出具有吖啶酮骨架的化合物2g、9g和12b是STING激动剂，它们在整个物种中均是STING的激动剂。其中，12b活性最好，并且其对人和鼠STING依赖性信号的诱导均与2'，3'-cGAMP相似。蛋白质分析表明2g、9g和12b可以通过直接与STING结合从而激活STING通路，而12b与STING的亲和力更强。而且与2'，3'-cGAMP相比，12b可以诱导各种细胞因子产生更快，更强劲和更持久的免疫应答。基于此，团队首次成功修饰鼠STING激动剂以获得人类敏感性，这些结果表明，12b是有效的人STING激动剂。此外，吖啶酮类似物显示出巨大的抗病毒或抗肿瘤治疗潜力。Zhang等[26]报道了基于细胞的高通量筛选测定法，该测定法可用于鉴定小分子cGAS-cGAMP -STING途径激动剂，发现6-溴-N-（萘-1-基）苯并[d][1,3]二唑-5-羧酰胺（BNBC）是cGAS-cGAMP -STING途径的激动剂，不仅可以诱导针对多种病毒的先天抗病毒免疫力，而且还可以刺激适应性免疫应答的激活。Lian等[27]的研究发现CCHC型锌指蛋白3（ZCCHC3）缺乏抑制dsDNA和DNA病毒触发的下游效应基因的诱导，ZCCHC3直接与dsDNA结合，增强cGAS与dsDNA的结合，这对病毒感染后cGAS的激活很重要。Ku等[28]发现了类鼻疽杆菌T6SS5依赖性细胞融合触发宿主中的Ⅰ型IFN基因表达，并导致cGAS-STING通路激活，cGAS和STING的激活导致自噬细胞死亡。他们提出：cGAS–STING途径通过微核形成将异常的细胞融合感知为危险信号，并因此通过自噬死亡的诱导限制异常的被病毒感染的细胞分裂和限制潜在的细胞转化。Palermo等[29]的研究发现，STING激动剂cGAMP与FDA批准的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂（resminostat）的组合可显著增加HIV感染前细胞的HIV前病毒激活率和特异性凋亡，降低HIV感染细胞的比例并在CD4（+）中央记忆T（TCM）细胞中观察到了HIV DNA的总量，该研究通过减少病毒库并诱导HIV感染细胞的特异性死亡，代表了一种消除HIV的新策略。
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Kawasaki等[30]发现STING转运受到肌管蛋白相关蛋白（MTMR）3和MTMR4的调节，而MTMR3和MTMR4可以调节PtdIns3P（磷脂酰肌醇）的产生，PtdIns3P可通过调节STING转运来抑制DNA介导的先天免疫应答，并发挥关键作用。Ghosh等[31]研究发现I型干扰素诱导型人寡腺苷酸合成酶样蛋白（OASL）是cGAS-cGAMP-STING途径的负反馈调节剂，OASL独立于双链DNA，直接且特异性地与cGAS结合，从而与第二信使cGAMP产生非竞争性抑制，起到负反馈调节cGAS-cGAMP-STING通路的作用。Jia等[32]的研究发现，病毒感染导致胞内脂质过氧化水平升高，产生4-羟基壬烯酸（4-HNE）等脂质过氧化代谢产物，促进STING羰基化、抑制STING活化。谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）通过将高反应性脂质过氧化物(L-OOH)转化为低反应性脂质醇(L-OH)，保护细胞免受脂质过氧化作用并维持胞浆内氧化还原平衡。而GPX4缺陷通过增强脂质过氧化可进一步促进4-HNE产生、特异性抑制cGAS-STING介导的DNA识别通路，从而抑制抗DNA病毒免疫反应。Huang等[33]确定HCMV蛋白UL31作为cGAS的抑制剂。UL31直接与cGAS相互作用，并使DNA与cGAS分离，从而抑制cGAS的酶功能并降低cGAMP的产生。UL31的过表达有效抑制抗病毒应答，而敲低或敲除UL31则明显增强了HCMV诱导Ⅰ型IFN和下游抗病毒基因的生成。Fu等[34]的研究结果表明HCMV UL42也是cGAS依赖性抗病毒反应的抑制剂。
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近几年，人们在理解胞质DNA传感和信号转导方面取得显著进步，尤其是在cGAS和cGAMP鉴定方面取得重大突破。大量证据清楚地表明cGAS-cGAMP-STING途径在抗病毒中的作用，这归因于胞浆DNA的识别和Ⅰ型IFN的产生。cGAMP可有效抗病毒复制，延长病毒滞留时间，延长生存周期，因此，可用于制备治疗HBV、HCV等病毒的药物。cGAS激活典型的模式识别受体（PRRs）通路，通过STING上调IFNs的表达，进而诱发抗病毒的活性。最近报道，该通路的激动剂具有良好的抗病毒作用，有望进一步开发为抗病毒新药。
尽管cGAS-cGAMP-STNG通路被发现和研究多年，但是STNG信号相关的网络结构并不完善，其与其他通路如caspase 1/9、STAT、NF-κB等的交互作用并不是完全清楚，接下来的工作需要完善该信号网络，为基于靶点的药物设计提供药理机制基础。
Role of cGAS-cGAMP-STING pathway in antivirus
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摘要: 先天性免疫是宿主防御病原体入侵机体的第一道防线。胞质中异常核酸的检测表明一些保守的病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns）引发了Ⅰ型干扰素（IFN）介导的先天性免疫反应。DNA传感器环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS）识别并结合宿主或病原体胞质DNA，促使第二信使环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）的合成并触发干扰素基因刺激蛋白(STING）依赖性下游信号传导。该文简述了cGAS-cGAMP-STING通路及其在抗病毒研究中的最新进展，为开展病毒防治研究提供新思路，为抗病毒药物的研发提供新的方向。
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关键词:
- 环鸟苷酸-腺苷酸合成酶 /
- 环鸟苷酸-腺苷酸 /
- 干扰素基因刺激蛋白 /
- 抗病毒
Abstract: Innate immunity is the host's first line defense against pathogens invading to the body. Detection of abnormal nucleic acids in the cytoplasm showed that some conserved pathogen associated molecular patterns (PAMPS) triggered type I interferon (IFN) -mediated innate immune responses. The DNA sensor— cGAS (cGAMP Synthase) recognizes and binds to host or pathogen cytoplasmic DNA, promotes the formation of the second messenger cGAMP (cyclic GMP-AMP), and triggers STING (stimulator of interferon genes) dependent downstream signaling. Here we briefly describe the latest progress of the cGAS-cGAMP-STING pathway and its important role in antivirus, and provide new ideas for virus prevention research and new direction for the development of antiviral drugs. -
脓毒症是机体对感染的免疫反应失调而引发危及生命的多器官功能障碍[1]，是感染致死的首要原因。据统计，全球每年有4 700万～5 000万脓毒症病例，脓毒症相关死亡人数至少为1 100万[2]，约占全年总死亡人数的1/5。脓毒症的病理生理学过程包含宿主全身过度炎症反应和免疫抑制的复杂相互作用，其中,免疫抑制会导致院内感染和体内病毒重激活，甚至出院后长期持久的免疫失能状态，脓毒症患者在免疫麻痹期的累积病死率约为总病死率的90%[3]。脓毒症免疫麻痹主要表现为细胞因子分泌失调、抗原提呈细胞功能减弱、T细胞亚群稳态失衡[4]，最终造成机会性感染的易感性增加。然而，临床上对于脓毒症的治疗手段十分有限，阻断TNF-α[5-6]、TLR4[7-8]等控制炎症级联反应的免疫抑制疗法在临床试验中也相继失败；幸运的是，纠正脓毒症免疫麻痹的免疫激活疗法异军突起，为脓毒症治疗带来了曙光，且许多疗法已被临床试验证实有效。本文对基于免疫麻痹纠正的脓毒症免疫疗法研究进展进行综述。
1. 细胞因子相关疗法
细胞因子在脓毒症的发病和转归中发挥着重要作用，细胞因子表达谱的变化是免疫麻痹状态的重要标志。主要表现为IL-10等抑炎因子分泌增加，TNF-α等促炎因子分泌减少，进而负性调节免疫细胞功能，加重免疫抑制状态。细胞因子不仅可以作为生物标志物判断免疫麻痹状态，从而引导临床给药，还可以作为有效的脓毒症免疫治疗手段。
1.1 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是一种造血生长因子，因能使骨髓祖细胞增殖分化形成粒细胞和巨噬细胞的集落而得名[9]。GM-CSF能激活单核细胞和粒细胞，促进树突细胞的成熟，促进T细胞增殖，并参与iNKT细胞和肺泡巨噬细胞的稳态分化[10]。GM-CSF受体下游包括JAK2/STAT5、ERK、NF-κB和PI3K-Akt等关键通路，能够上调单核/巨噬细胞中的MHC II类分子表达[11]。重组蛋白药物沙格司亭（Sargramostim）在临床上已用于各种原因引起的白细胞或粒细胞减少症。在肥胖伴糖尿病的脓毒症小鼠中，GM-CSF通过增强中性粒细胞和单核细胞的吞噬能力和ROS产生能力从而改善脓毒症的生存[12]。GM-CSF还能通过促进小鼠巨噬细胞选择性转化来减轻脓毒症诱导的急性肾损伤，并提高生存率[13]。Presneill等[14]纳入伴有急性呼吸窘迫综合征的18例重度脓毒症患者的II期临床试验显示，GM-CSF治疗使PaO2/FiO2改善，外周血中性粒细胞计数增加，但未能改善肺外器官功能以及生存率。Drossou-Agakidou等[15]对56例新生儿脓毒症患者的临床试验表明，GM-CSF能使表达HLA-DR的单核细胞数量显著增加。Meisel等[16]纳入38例脓毒症免疫抑制患者的II期临床试验表明，mHLA-DR引导的GM-CSF治疗对恢复单核细胞免疫功能安全有效，且能缩短通气时间并改善临床评分。Hall等[17]对17例小儿脓毒症患者的随机对照研究表明，GM-CSF可以恢复TNF-α产生能力，有效预防院内感染。Leentjens等[18]纳入18例健康志愿者的临床研究表明，GM-CSF对人内毒素血症后免疫麻痹具有逆转趋势。另有预计120例患者参与的IV期临床试验将研究GM-CSF对小儿脓毒症免疫麻痹的逆转作用，目前还在进行中（NCT03769844）。对于全球大流行的COVID-19，既有GM-CSF疗法走向临床试验（NCT04326920），也有针对炎症因子风暴的GM-CSF阻断疗法初见成效[19-20]。可见，GM-CSF是一种有潜力的脓毒症免疫疗法，但仍需准确有效的生物标志物来有效区分患者的免疫状态，以确定其给药时机。
1.2 干扰素γ
干扰素γ（IFN-γ）也称II型干扰素，是一种主要由NK细胞和T细胞等免疫细胞产生的细胞因子，在抗感染和抗肿瘤反应中发挥关键作用。能激活多种免疫细胞，并诱导抗原提呈细胞MHC分子的表达[21]。Döcke等[22]通过临床研究表明，IFN-γ能恢复脓毒症患者的单核细胞HLA-DR表达以及LPS诱导的TNF-α应答。Leentjens等[18]纳入18例健康志愿者的临床研究表明，IFN-γ能降低免疫麻痹状态下的IL-10水平，增加单核细胞HLA-DR表达，并增强LPS诱导的TNF-α应答。Delsing等[23]的研究为IFN-γ辅助免疫治疗可恢复真菌脓毒症患者的免疫功能提供了证据，评估IFN-γ治疗念珠菌血症患者的II期临床试验正在进行中（NCT04979052）。在COVID-19重症患者中，IFN-γ水平表现出严重低下[24]。有病例报告称，IFN-γ能恢复重症COVID-19患者的mHLA-DR，因此呼吁更多mHLA-DR低下的重症患者采用IFN-γ治疗[25]。虽然一般认为IFN-γ有助于增强病原清除能力，但也有研究表明脓毒症早期血浆IFN-γ升高不利于继发念珠菌感染的清除和个体生存[26]，因此，仍需要更多的基础研究和临床试验来探索用药指征和给药时机。
1.3 白介素7
白介素7（IL-7）最初被认为是一种T细胞和B细胞前体的生长因子，该信号对整个淋巴细胞群体的发育和维持至关重要，包括T细胞、B淋巴细胞和先天淋巴细胞[27]。IL-7R信使RNA的低表达与脓毒性休克患者28 d病死率独立相关[28]。IL-7治疗有望改善脓毒症的淋巴细胞减少症以及T细胞功能障碍。在小鼠脓毒症模型中，IL-7可增强T细胞的生存、转运和功能，并改善小鼠生存情况[29]。IL-7改善小鼠脓毒症后的免疫功能障碍，并提高真菌二次打击模型[30]和铜绿假单胞菌二次打击模型[31]的存活率。IL-7治疗还可以通过γδ T细胞IL-17的产生，在脓毒症小鼠模型中加速中性粒细胞募集和细菌清除[32]。在脓毒症患者中，IL-7能恢复失能T细胞产生IFN-γ的能力，且效果优于PD-L1抗体和OX40L[33]。Venet等[34]纳入70例脓毒症休克患者的体外临床前研究表明，IL-7能恢复离体淋巴细胞增殖，恢复离体CD4+和CD8+效应T细胞增殖，恢复离体CD8+效应T细胞的IFN-γ产生。Venet等[35]还证明IL-7治疗改善脓毒症患者T淋巴细胞的mTOR激活、GLUT1表达和葡萄糖摄取，通过免疫代谢途径使T细胞增殖增强。Francois等[36]纳入27名患者的临床研究表明，IL-7治疗能促进T细胞增殖和激活，逆转CD4+和CD8+效应T细胞的减少，这是脓毒症免疫抑制的关键机制。遗憾的是，最近一项考察重组人IL-7（CYT107）对脓毒症患者淋巴细胞重构的大规模临床试验因药动学问题而终止（NCT03821038）。由于T细胞功能障碍和大量凋亡是严重COVID-19患者的重要特征[37]，因此，IL-7可能对COVID-19相关脓毒症的治疗有广泛的前景。目前已经证实，IL-7能够恢复COVID-19患者离体T细胞的IFN-γ产生能力[38]，恢复淋巴细胞计数至对照组的2倍以上[39]。
1.4 白介素15
白介素15（IL-15）是免疫调节细胞因子家族的成员，是一种具有治疗潜力的多能分子，主要由髓系细胞表达，作用于T细胞、B细胞、NK细胞等多种免疫细胞[40]。在动物模型中，IL-15可阻止免疫细胞凋亡，逆转先天和适应性免疫功能障碍，并提高脓毒症小鼠的生存率[41]。IL-15显著改善脓毒症诱导的T细胞耗竭，增加NK细胞和巨噬细胞数量，增加IFN-γ水平，从而改善脓毒症动物的生存情况[42-43]。由于IL-15能维持炎症细胞因子的平衡以及NKT细胞和CD8+ T细胞的稳态反应，有学者建议将其作为COVID-19免疫调节治疗的可行手段[40]。但IL-15用于脓毒症的治疗还存在争议，比如，IL-15强激动剂未能改善烧伤脓毒症小鼠的细菌清除和生存情况[43]，IL-15能通过抑制糜蛋白酶活性抑制肥大细胞依赖的抗菌反应[44]，甚至IL-15可能加重脓毒症的严重程度[45]。由此可见，需要更多的基础研究和临床试验来确定IL-15的安全性、有效性，并确定其合理的给药时机。
2. 免疫检查点相关疗法
免疫检查点是免疫细胞功能的关键调节因子。近年来，免疫检查点相关疗法在恶性肿瘤的治疗中逐渐趋于成熟。而脓毒症患者中存在着与恶性肿瘤相似的免疫抑制状态，这为脓毒症的治疗带来了新的思路，是目前脓毒症免疫治疗中最有潜力的策略之一。
2.1 程序性死亡受体1/配体1抗体
程序性死亡受体1/配体1（PD-1/PD-L1）是T细胞活化的负性共刺激信号，是重要的免疫检查点，近年来在肿瘤免疫治疗中大放异彩。PD-1/PD-L1在脓毒症中表达上调，且T细胞失能和耗竭是脓毒症免疫抑制的重要机制之一，因此，阻断PD-1/PD-L1轴有望纠正脓毒症免疫抑制，改善患者预后。动物实验表明，给予PD-1抗体能逆转免疫功能障碍，提高脓毒症小鼠的生存率[46]。对于原发和继发性的真菌脓毒症，PD-1/PD-L1抗体也显著恢复IFN-γ和MHC II类分子表达，提高生存率[47]。研究表明，脓毒症患者免疫功能缺陷与PD-1/PD-L1表达相关，阻断PD-1/PD-L1可通过抑制T细胞耗竭和逆转单核细胞功能障碍改善脓毒症患者的生存[48-49]。而上调PD-L1则会延迟患者中性粒细胞凋亡，并在脓毒症小鼠实验模型中促进肺损伤[50]。此外，阻断PD-1可以改善急性肝损伤中Kupffer细胞的细菌清除，并发挥对小鼠脓毒症的保护作用[51]。阻断PD-1/PD-L1轴的优势主要在于目前已上市多种成熟的抗体药物，并已经广泛用于肿瘤的治疗，具有相对高的安全性。对于具有明显免疫抑制指征的严重脓毒症患者，很多研究者都建议使用抗PD-1/PD-L1疗法，我们也期待大规模的临床试验以证明其治疗脓毒症的有效性。
2.2 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4抗体
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白（CTLA-4）也是重要的免疫检查点，能与膜受体CD80/CD86结合，负性调节T细胞活化。在脓毒症患者中，CTLA-4在T细胞表面表达上调[52]。在动物模型中，CTLA-4抗体能逆转淋巴细胞凋亡，提高原发性和继发性脓毒症小鼠的生存率[53]。对于原发和继发性的真菌脓毒症，CTLA-4抗体也显著恢复IFN-γ和MHC II类分子表达，改善小鼠生存率[47]。与抗PD-1/PD-L1疗法类似，抗CTLA-4疗法在肿瘤免疫治疗中有着广泛的研究和应用，为脓毒症相关免疫抑制的治疗奠定了基础。
2.3 T细胞免疫球蛋白黏蛋白3抗体
T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（TIM-3）是一种免疫抑制性受体分子，主要表达在多种T细胞表面。TIM-3在脓毒症患者T细胞中表达上调，能介导T细胞耗竭，发挥负性免疫调节作用[52]。在脓毒症中，TIM-3基因多态性与脓毒症患者生存率以及G+菌的易感性有显著关联[54]。TIM-3能在CD4+ T细胞中抑制NF-κB通路，从而介导免疫抑制[55]。使用α-乳糖阻断TIM-3能够逆转CD8+ T细胞和NKT细胞凋亡，发挥对脓毒症的保护作用[56-57]。使用抗体阻断TIM-3能恢复脓毒症患者离体的单核细胞和淋巴细胞功能[58]。因此，TIM-3阻断疗法是一种有潜力的脓毒症免疫治疗手段，TIM-3抗体在肿瘤免疫治疗中的研究也为该手段提供了参考。
2.4 淋巴细胞激活基因3抗体
淋巴细胞激活基因3（LAG-3）是一种表达在T细胞、NK细胞、B细胞等免疫细胞表面的免疫抑制性受体，能介导T细胞耗竭，发挥免疫抑制作用。LAG-3在脓毒症患者T细胞表面表达上调[52]。在脓毒症小鼠中，LAG-3敲除或阻断可保护其免受脓毒症相关免疫功能障碍，包括逆转T细胞凋亡和IFN-γ分泌等，从而改善细菌清除和生存率[59]。阻断LAG-3可能成为新的脓毒症免疫治疗手段，然而其对脓毒症转归的作用机制还需要进一步阐明。
2.5 B/T-淋巴细胞衰减因子抗体
B/T-淋巴细胞衰减因子（BTLA）是一种重要的共抑制受体，能够负性调节T细胞活化。在脓毒症中，BTLA促进T细胞凋亡，已被证明是脓毒症免疫抑制的生物标志物和中介物[60]。BTLA在脓毒症小鼠CD4+ T细胞和B细胞中表达增加，与这些细胞在脓毒症中的减少有关[61]。BTLA负向调节髓系树突状细胞的成熟及其吞噬和杀菌能力[62]。在小鼠脓毒症模型中，BTLA敲除小鼠表现出更高的存活率和对器官损伤的保护[63]。但也有研究表明，低BTLA+ T细胞比例与脓毒症患者高病死率有关[64]。BTLA可抑制TLR4反应，激活BTLA可能对LPS诱导的内毒素休克有治疗作用[65]。综上所述，在脓毒症中阻断BTLA的安全性和有效性仍需论证，并且若在炎症因子风暴期间给予BTLA抗体很有可能不利于脓毒症的治疗。
2.6 T细胞免疫球蛋白免疫受体酪氨酸抑制基序结构域抗体
T细胞免疫球蛋白免疫受体酪氨酸抑制基序结构域（TIGIT）是淋巴细胞表面的一种负性免疫共刺激分子，其配体有CD155、CD112和CD113等。脓毒症和脓毒症休克患者T细胞上TIGIT表达显著上调，且TIGIT+ T细胞比例升高与炎症反应加重和器官损伤有关[66]。阻断TIGIT配体CD155可逆转树突状细胞功能障碍，改善脓毒症小鼠的生存[67]。在伴有恶性肿瘤的小鼠中，给予TIGIT抗体能够逆转脓毒症导致的T细胞凋亡并改善生存率[68]。引人注目的是，使用TIGIT抗体可以恢复脓毒症患者离体T细胞的功能[66]，提示阻断TIGHT可能是脓毒症免疫治疗的新方法。
2.7 肿瘤坏死因子受体超家族成员4抗体
肿瘤坏死因子受体超家族成员4（OX40，TNFRSF4）是一种主要表达在T细胞表面的正性免疫共刺激分子，能与其配体OX40L结合，介导T细胞增殖和活化。OX40激动性抗体不仅能逆转脓毒症诱导的T细胞凋亡和失能，提高脓毒症小鼠的存活率，还能改善脓毒症患者外周血淋巴细胞中的T细胞功能[69]。对脓毒症患者的T细胞离体给予OX-40L，能增加其IFN-γ产生能力[33]。激活OX40/OX40L轴可能对逆转脓毒症的免疫抑制状态具有积极意义，伴随着更多基础和临床研究，OX40激动性抗体可能成为脓毒症免疫治疗的新方法。
3. 其他免疫活性物质疗法
3.1 胸腺肽α1
胸腺肽α1（Thymosin α1, Tα1）是一种多肽类激素，主要作用于T细胞免疫，能够增强机体免疫，逆转免疫缺陷。合成多肽药物胸腺法新（Thymalfasin）作为一种免疫调节剂，临床上已应用于病毒性肝炎、脓毒症等多种疾病的免疫增强治疗。动物实验表明，Tα1能促进Treg细胞凋亡从而改善脓毒症小鼠生存率[70]，通过Notch通路减轻脓毒症大鼠的肺损伤[71]。Tα1与激素联用能改善脓毒症小鼠免疫功能和生存情况[72-73]。Zhang等[74]纳入120例耐药菌感染的脓毒症患者的临床研究表明，联合Tα1和乌司他丁的免疫调节治疗可使T细胞增多，脓毒症患者的生存率升高。Han等[75]对纳入915名参与者的多项临床试验进行Meta分析，发现联合乌司他丁和Tα1的免疫调节治疗显著改善脓毒症患者的全因死亡率、炎症介质和机械通气持续时间。Chen等[76]纳入42例脓毒症休克患者的临床研究表明，Tα1能显著增加多种免疫细胞数量，患者的平均无热期、ICU住院天数、机械通气时间以及28天病死率均明显降低。Wu等[77]纳入361例重症脓毒症患者的临床研究表明，Tα1能逆转免疫抑制状态，改善mHLA-DR水平和28日生存率。另有一项纳入1106名患者的多中心临床试验研究了Tα1对脓毒症的安全性和有效性（NCT02867267），结果尚未公布。在COVID-19及其相关脓毒症中，Tα1能恢复淋巴细胞减少和逆转T细胞耗竭，从而降低患者病死率[78]。但也有研究认为，Tα1可能对恢复COVID-19患者的CD4+和CD8+ T细胞计数或清除病毒没有益处[79]，不能降低COVID-19相关死亡率[80-81]，甚至Tα1的使用可能不利于COVID-19患者的临床康复[82]。因此，还需要对Tα1在COVID-19以及脓毒症中的应用进行更谨慎和充分的研究，一项Tα1治疗COVID-19伴淋巴细胞减少症的临床试验正在进行中（NCT04487444）。
3.2 富含IgA和IgM的免疫球蛋白
富含IgA和IgM的免疫球蛋白（IgGAM）是一类多组分的免疫效应物质，主要通过介导调理作用、中和抗原以及调节Fc受体表达等方式发挥在脓毒症中的治疗作用[83]。相关药物五球蛋白（Pentaglobin）已在临床试验中表现出对脓毒症的有益作用[84-85]。在小鼠脓毒症模型中，静注IgGAM能够改善小鼠的行为学缺陷[86]。在重症耐药菌感染患者中使用IgGAM，能改善免疫功能和生存情况[87]，提示IgGAM是脓毒症中一种有潜力的免疫辅助疗法。然而，IgGAM的使用还存在争议，存在多种不良反应的风险，而且缺乏明确的生物标志物来指导给药。目前，一项针对脓毒症休克患者的基于血清IgM滴度的IgGAM治疗的临床试验正在进行中（NCT04182737）。IgGAM作为辅助疗法，是一种有潜力的脓毒症免疫治疗手段。
4. 总结
免疫麻痹是导致脓毒症中晚期患者死亡的主要原因，纠正免疫麻痹状态是脓毒症治疗的重要方向，需要基础研究和临床研究的共同努力。细胞因子疗法、免疫检查点相关疗法以及其他免疫疗法已经成熟应用于肿瘤的免疫治疗，也有望纠正脓毒症中的免疫麻痹。脓毒症免疫治疗面临的主要问题是判断患者的免疫状态，从而确定最佳干预策略和干预时机。专家共识[88]推荐mHLA-DR作为考察天然免疫抑制的首选指标，同时结合监测中性粒细胞功能、NK细胞计数和功能及补体水平来了解患者天然免疫状态；淋巴细胞计数可作为脓毒症患者适应性免疫功能障碍的快速筛查指标；通过检测T淋巴细胞计数、分化、增殖和分泌功能来监测脓毒症患者T淋巴细胞功能；通过血清Ig定量来监测B淋巴细胞功能。最近开展的一项多国多中心的脓毒症个性化免疫治疗试验（NCT04990232），试验根据脓毒症患者血清铁蛋白升高（表明过度炎症）或单核细胞HLA-DR量降低（表明免疫抑制），分别给予炎症抑制剂IL-1R拮抗剂阿那白滞素或免疫激活剂IFN-γ治疗，这项研究通过检测区分脓毒症患者的免疫学特征，从而确定最佳干预策略和干预时机。总之，随着免疫麻痹生物标志物研究的深入，脓毒症免疫治疗将有更广阔的应用前景。
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