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枇芩口服液是我院皮肤科的临床经验方，主要由枇杷叶、黄芩、赤芍、甘草等十三味中药制成，具有清热、祛湿、凉血等功效，临床主要用于治疗寻常型痤疮[1]。目前质量控制指标为制剂中的总黄酮以及君药黄芩中的成分[2]，不能全面反映制剂的整体质量。组方中黄芩、枇杷叶为君药，具有清热解毒，凉血消肿作用。黄芩活性成分主要为黄酮类化合物，其中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素抗炎及抑菌效果好。枇杷叶等药材中含有绿原酸和咖啡酸成分，具有抗菌、消炎等作用。组方中的芍药苷及甘草中的甘草酸胺同样具有抗炎、抑菌及免疫调节等功效，诸药合用，在治疗寻常痤疮中发挥协同作用[3]。本研究拟采用双波长高效液相色谱法测定绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素含量[4-5]，以进一步完善其质量标准。
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Agilent 1200 Series高效液相色谱系统（含DAD检测器，美国Agilent公司）；AUX220电子分析天平（日本岛津公司）。
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枇芩口服液（自制，批号：20200220、20200224、20200315）；黄芩苷对照品（批号：110715-201821，含量95.4%）、黄芩素对照品（批号：111595-200905，含量98.5%）、绿原酸对照品（批号：110753-201415，含量96.2%）、芍药苷对照品（批号：110736-201337，含量94.9%）、甘草酸铵对照品（批号：110731-201418，含量93.1%），咖啡酸对照品（批号：110885-200102）、汉黄芩素对照品（批号：111514-200403，含量98.0%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，TEDIA公司，批号：18085030）。
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Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)为色谱柱；流动相：0.02%磷酸水溶液(A)–乙腈(B)梯度洗脱，洗脱程序：0～10 min，10%B；10～20 min，10%～20%B；20～30 min，20%～25%B；30～40 min，25%～30% B；40～50 min，30%～40% B；50～60 min，40%～70% B； 60～65 min，70%～30% B；65～70 min，30%～10%B；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μl。
检测波长：0～18.0 min，325 nm（检测绿原酸、咖啡酸）；18.0～65.0 min，280 nm（检测芍药苷，黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、汉黄芩素）。
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分别称取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成含绿原酸355.9 μg/ml、咖啡酸550.0 μg/ml、芍药苷1480 μg/ml、黄芩苷772.7 μg/ml、黄芩素660.0 μg/ml、甘草酸铵642.4 μg/ml和汉黄芩素499.8 μg/ml的单一对照品储备液。精密吸取上述对照品储备液适量，置于同一10 ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度依次为35.59、5.500、296.1、77.27、66.00、128.5和1.999 μg/ml的混合对照品溶液。
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精密量取相应批号的枇芩口服液2ml，置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。
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根据处方中各药的比例，依次制备不含绿原酸（缺茵陈、墨旱莲和枇杷叶）、咖啡酸（缺夏枯草、墨旱莲、枇杷叶和丹参）、赤芍、黄芩和甘草的阴性样品，按“2.2.2”项下供试品溶液制备阴性溶液。
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精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定，结果见图1。在供试品溶液色谱中，与对照品溶液色谱中绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素位置上均有相应的色谱峰出现，且色谱峰之间的分离度均˃1.5，理论板数˃3000。
图 1 枇芩口服液HPLC色谱图
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分别精密吸取对照品储备液0.50、1.00、1.50、2.50、3.50、5.00ml置于5ml棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀。即得系列浓度的混合对照品溶液，按照上述的色谱分析条件进样分析，以浓度（X，μg/ml）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程及线性范围，结果见表1。
表 1 枇芩口服液中有效成分的回归方程、相关系数和线性范围
有效成分 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 绿原酸 Y=18.102X−0.0003 0.9991 3.559～35.59 咖啡酸 Y=51.805X+0.0874 0.9993 0.5500～5.500 芍药苷 Y=2.2865X+0.5859 0.9999 29.61～296.1 黄芩苷 Y=215.23X+43.349 0.9999 7.727～77.27 黄芩素 Y=14.843X−69.402 0.9998 6.600～66.00 甘草酸铵 Y=4.7447X−48.701 0.9995 12.85～128.5 汉黄芩素 Y=413.09X−64.950 0.9998 0.1999～1.999 -
精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果显示绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.57%、1.98%、1.74%、1.07%、2.01%、1.41%和1.69%，表明仪器精密度良好。
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取同一批样品（批号：20200224）6份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定峰面积，绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.91%、1.90%、0.68%、1.41%、1.78%、1.40%和1.97%，表明方法重复性良好。
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取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h，按“2.1”项下色谱条件进样测定峰面积，绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.05%、1.90%、1.32%、1.06%、1.78%、2.02%和1.87%，结果表明供试品溶液在10 h内稳定。
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精密量取已知含量（批号：20200224）的枇芩口服液1ml，共9份，分别按相当于绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素含有量的80%、100%、120%加入对照品溶液（不同加入量各3份），按“2.1”项下色谱条件进样，测定含量，并计算加样回收率和RSD，结果见表2。
表 2 枇芩口服液加样回收率测定结果(n=9)
成 分 样品含量
(µg)加入量
(µg)测得量
(µg)回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）绿原酸 66.46 56.94 122.4 98.24 98.55 0.75 66.46 71.18 136.2 98.02 66.46 88.98 154.9 99.39 咖啡酸 11.32 8.800 19.94 97.99 97.95 0.67 11.32 11.00 22.02 97.27 11.32 13.20 24.33 98.59 芍药苷 638.3 493.5 1117.7 97.14 97.58 0.67 638.3 592.2 1220.7 98.34 638.3 710.6 1329.3 97.25 黄芩苷 151.3 123.6 274.13 99.38 99.70 0.61 151.3 154.5 304.73 99.31 151.3 185. 5 337.47 100.40 黄芩素 103.7 84.48 187.93 99.71 98.88 1.51 103.7 105.6 209.07 99.78 103.7 132.0 231.93 97.15 甘草酸铵 115.5 102.8 217.17 98.90 98.26 1.41 115.5 128.5 243.0 99.22 115.5 154.2 264.57 96.67 汉黄芩素 1.908 1.599 3.427 95.02 96.41 1.41 1.908 1.999 3.837 96.50 1.908 2.399 4.252 97.72 -
取3个批号枇芩口服液（批号：20200220、20200224、20200315），按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算7种成分的含量，结果见表3.
表 3 枇芩口服液7种成分的含量测定结果（n=3，μg/ml）
批号 绿原酸 咖啡酸 芍药苷 黄芩苷 黄芩素 甘草酸铵 汉黄芩素 20200220 69.54 12.11 615.3 157.3 99.97 112.2 1.709 20200224 66.46 11.32 638.3 151.3 103.7 115.5 1.908 20200315 65.80 11.21 633.2 149.2 105.2 117.2 1.911 -
试验中选择的7种成分来源于黄芩、夏枯草、茵陈、赤芍和甘草，全面覆盖君、臣、佐、使中的多味药材，将其作为质控指标，以提高质量控制的整体性和特征性。因测定成分绿原酸分别存在于组方中茵陈、枇杷叶等药材中，咖啡酸存在于枇杷叶、丹参等药材中，因此按照相应的方法制备阴性供试品溶液。
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试验采用高效液相的DAD检测器分别对7种对照品在200～400 nm处扫描，结果绿原酸和咖啡酸在325 nm波长处有最大紫外吸收，芍药苷，黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、汉黄芩素在280 nm波长处有最大吸收，因此本实验选择325nm和280 nm作为测定波长。
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考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.02%磷酸水溶液等流动相系统，结果采用乙腈-0.02%磷酸水溶液梯度洗脱，对照品溶液与供试品溶液各成分分离度较好，梯度洗脱中基线相对平稳，峰形较好。此外，对柱温、流速、进样量等色谱条件进行优化最终确定色谱条件。
Simultaneous determination of seven components in Piqin oral liquid by dual-wavelength HPLC
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摘要:
目的 建立高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中绿原酸、咖啡酸、芍药苷、甘草酸铵、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素7种成分含量。 方法 采用双波长HPLC，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.02%磷酸水溶液(A)–乙腈(B)，梯度洗脱。流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μl。检测波长：0～18.0 min，325 nm（检测绿原酸、咖啡酸）；18.0～65.0 min，280 nm（检测芍药苷，黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、汉黄芩素）。 结果 枇芩口服液中的绿原酸、咖啡酸、芍药苷、甘草酸铵、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素完全分离，7种成分峰面积与浓度的线性关系良好，加样回收率为96.41%～99.70%。 结论 该法操作简单、准确、重复性好，可用于枇芩口服液的质量控制。 Abstract:Objective To establish a high performance liquid chromatography(HPLC) method for simultaneous determination of the contents of 7 components of chlorogenic acid, caffeic acid, paeoniflorin, ammonium glycyrrhizinate, baicalin, baicalein, and wogonin in Piqin oral liquid. Methods A double-wavelength HPLC method was performed. The column was Agilent Zorbax SB-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was 0.02% phosphoric acid aqueous solution (A)-acetonitrile (B) gradient elution; Flow rate: 1.0 ml/min; Column temperature: 35℃; Injection volume: 20 μl; Detection wavelength: 0-18.0 min, 325 nm (detect chlorogenic acid, caffeic acid); 18.0-65.0 min, 280 nm (detect paeoniflorin, baicalin, baicalein, ammonium glycyrrhizinate, wogonin) . Results The chlorogenic acid, caffeic acid, paeoniflorin, ammonium glycyrrhizinate, baicalin, baicalein and wogonin were completely separated. Seven components have a good linear relationship between the peak area and concentration, with the recoveries between 96.41% and 99.70%. Conclusion This method is simple, accurate and reproducible, and can be used for the quality control of Piqin oral liquid. -
Key words:
- Piqin oral liquid /
- HPLC /
- double-wavelength /
- content determination
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流感是一种严重的上呼吸道病毒感染，由于其高毒力和突变率，该病毒仍然是对公众健康的主要威胁。据美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织估计，每年有多达65 万人死于季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。传统中医药预防和治疗流感病毒导致的感染（如呼吸道肺炎和支气管炎）已成为中国临床上常规治疗策略，发挥了独特的医疗优势[2,3]。
感冒安颗粒是由金银花、连翘、板蓝根、拳参、桑叶、紫苏和荆芥等七味中药制成的复方制剂，临床应用30 多年，具有疏散风邪，解表退热功能，其预防和治疗呼吸道感染的作用已得到很好的临床验证，特别是在病毒感染初期的治疗效果尤其显著，但药效物质基础并不清楚。目前，建立了TLC法对方中的板蓝根和连翘两味药材进行特征鉴别；同时对方中各药味的共有成分绿原酸和齐墩果酸也建立了TLC鉴别方法。在含量限度方面，则建立了制剂中连翘酯苷A的HPLC法。尽管这些获批的标准已用于制剂常规质量控制，但尚需进一步进行质量评价，以期更客观、准确地反映感冒安颗粒的临床疗效。
由于中药复方复杂的化学成分，它的药理作用是通过多靶点、多途径而实现的。流感病毒感染的病理生理过程主要是病毒的直接作用和宿主免疫反应损伤（如细胞因子风暴所致的炎性损伤和ROS导致的氧化应激损伤）的结果[2,4]。为了研究感冒安颗粒临床效果的药效物质基础，我们对组方各药味的化学成分进行了文献追踪，发现方中药味含有多种黄酮类成分，如异槲皮苷、芦丁、木樨草素及木樨草苷等[5-9]。而黄酮类成分对流感病毒的作用越来越受到关注[10,11]。异槲皮苷抑制流感病毒A和B的复制，与抗病毒药amantadine或者oseltamivir合用可抑制它们导致的耐药病毒出现[12]。槲皮素与流感病毒A H1N1（A/PR/8/34）的神经酰胺酶的结合与zanamivir相当，体内研究也证实了其抗流感病毒能力，可作为抗甲型H1N1流感的有效先导化合物[13]。Zima研究认为木犀草素及其同源物是强效流感核酸内切酶抑制剂，揭示黄酮类化合物的抗流感作用[14]。鉴于此，本研究在总黄酮含量测定的基础上[15]，采用HPLC-MS/MS方法建立5 种黄酮类成分的定量方法，不仅为制剂质量评价提供方法学，也为进一步研究感冒安颗粒防治流感病毒引起的呼吸道感染机制奠定物质基础。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS仪，配以Triple Quad B.02.01（B2043.12）数据处理软件（美国安捷伦公司）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；DL-720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。1.2 试药
感冒安颗粒（本院院内制剂，批号110418、110704、111025、111121、111130、111221、120131、120201、120207、120214）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，供UV法测定，含量以92.5 %计，批号：100080-200707）；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以93.9 %计，批号：111521-201004）；木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111520-200504）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100081-200406）；异槲皮苷对照品（成都曼斯特生物制品有限公司，纯度>99.0 %，批号：MUST-10021901）；甲醇为色谱纯；甲酸为分析纯；水为蒸馏水。
2. 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素对照品各适量，用甲醇溶解，摇匀，各配制成500 μg/ml的对照品贮备液。分别精密量取5种对照品贮备液适量，稀释成浓度如下：分别含芦丁0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml，金丝桃苷0.002、0.008、0.020、0.032、0.044、0.056、0.080 μg/ml，异槲皮苷0.03、0.10、0.25、0.45、0.65、0.95、2.00 μg/ml，槲皮素0.02、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.70 μg/ml，木犀草素0.012、0.026、0.040、0.054、0.082、0.096、0.200 μg/ml的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备
按已优化的黄酮提取方法进行[15]。取样品约0.5 g，精密称定，置量瓶中，加70 %甲醇35 ml，超声提取30 min，放冷，过滤，滤液加70 %甲醇溶液定容至50 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.2 色谱-质谱条件
色谱条件：采用Kromasil C 18（4.6 mm×150 mm，5 μm，100 Å）色谱柱；甲醇（A）- 0.1 %甲酸（B）作为流动相，按0～20 min，35 % A；20～40 min，45 % A梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾负离子化（ESI−）源：毛细管电压 3.0 kV；气体温度 350 ℃，气体流速 10 L/min，雾化气压 35 psi。多反应模式（MRM）监测。5种黄酮检测的离子对：芦丁m/z 609.1→300.1、金丝桃苷和异槲皮苷m/z 463.0→300.1、槲皮素m/z 301.0→151.0、木犀草素m/z 285.0→132.9。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测限和定量限
采用上述色谱条件，每个待测化合物对照品用70%甲醇溶液进行系列稀释，分别以信噪比（S/N）等于3和10确定各自的检测限和定量限。结果见表1。
表 1 5种黄酮成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限黄酮化合物 线性方程 相关系数
r线性范围
（ng/ml）检测限
（ng/ml）定量限
（ng/ml）芦丁 Y=24 527X–162.17 0.999 7 250~8 000 0.025 0.50 金丝桃苷 Y=34 123X– 1.7381 0.999 1 2~80 0.005 0.01 异槲皮苷 Y=29 935X+1 597.80 0.999 1 30 ~2 000 0.02 0.50 槲皮素 Y=19 667X+370.71 0.999 2 20~700 0.02 0.10 木犀草素 Y=33 076X–177.98 0.999 7 12~200 0.005 0.01 2.3.2 线性范围考察
精密量取“2.1.1”项下配制的5 种黄酮成分的对照品混合溶液，照“2.2”项下进样测定，记录各待测组分的峰面积积分值。横坐标为黄酮成分质量浓度（X，ng/ml），纵坐标为峰面积（Y），进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果见表1，表明5 种黄酮成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验
精密吸取供试品溶液（批号
120131 ），照“2.2”项下操作，进样，连续测定5 次和连续测定5 d，记录各待测组分的峰面积积分值，计算日内、日间RSD。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的日内精密度RSD分别为1.09 %、1.42 %、1.69 %、0.86 %、1.27 %（n=5），日间精密度RSD分别为1.85 %、1.76 %、1.43 %、2.01 %、1.90 %（n=5），表明仪器精密度良好。2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号
120131 ）5 份，各0.5 g，精密称定，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，并进行含量测定。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的含量分别为260.16、1.84、19.76、13.39、3.73 μg/g（n=5），RSD分别为1.51 %、1.73 %、0.90 %、1.44 %、1.68 %（n=5），表明方法的重复性良好。2.3.5 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号120131）9 份，每份约0.5 g，精密称定，各精密加入对照品贮备液适量，使已知样品中加入的相当对照品量分别含芦丁140.00 μg、金丝桃苷0.90 μg、异槲皮苷10.00 μg、槲皮素7.00 μg、木犀草素1.90 μg的各对照品贮备液，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算加样回收率。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的平均加样回收率分别为：102.06%、101.60%、100.63%、102.81%、101.80%（n=9），RSD分别为1.56%、1.93%、0.67%、2.07%、1.84%（n=9）。
2.3.6 样品含量测定
取10 个批号的感冒安颗粒，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算含量，结果见表2。
表 2 不同批号感冒安颗粒含量测定结果（$\bar x $ ±s, n=3）批号 芦丁 金丝桃苷 异槲皮苷 槲皮素 木犀草素 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 110418 479.83±1.99 0.41 0.855±0.004 0.49 20.54±0.25 1.23 14.83±0.05 0.31 3.46±0.06 1.70 110704 198.98±3.01 1.52 0.596±0.006 1.05 11.79±0.20 1.68 15.31±0.13 0.86 4.51±0.01 0.19 111025 32.23±0.26 0.83 0.993±0.012 1.26 13.31±0.00 0.02 6.53±0.04 0.55 5.15±0.08 1.58 111121 69.18±1.03 1.51 0.499±0.006 1.26 13.36±0.21 1.56 8.04±0.14 1.69 5.65±0.07 1.19 111130 67.53±0.27 0.40 0.533±0.008 1.57 13.36±0.21 1.54 7.48±0.12 1.62 5.42±0.06 1.15 111221 275.38±3.61 1.31 0.291±0.002 0.73 11.44±0.02 0.21 15.74±0.02 0.14 6.51±0.02 0.24 120131 264.55±0.51 0.19 1.825±0.012 0.68 20.29±0.04 0.17 13.66±0.02 1.52 3.78±0.01 0.26 120201 239.19±1.55 0.65 0.593±0.010 1.76 18.95±0.06 0.33 18.41±0.21 1.16 3.86±0.03 0.81 120207 109.20±2.14 1.97 0.503±0.004 0.83 18.00±0.21 1.16 6.72±0.08 1.22 4.21±0.02 0.37 120214 108.93±0.59 0.54 0.461±0.002 0.45 17.67±0.10 0.01 6.32±0.08 1.19 4.73±0.01 0.11 3. 讨论
3.1 MS/MS条件的优化
为了获得良好的MS结果，优化了检测的离子模式、碎裂电压、碰撞能量等参数，以获得高灵敏度的分子离子和碎片离子。结果显示，ESI采用负离子模式可使待测的黄酮成分有更高的灵敏度。对照品混合液经产物离子扫描显示，芦丁的主要碎片为m/z：300.1、271.0；金丝桃苷和异槲皮苷的主要碎片为m/z：300.1、270.8；槲皮素的主要碎片为m/z：178.6、151.0、120.9、106.9；木犀草素的主要碎片为m/z：150.9、132.9、106.8。依据定量碎片离子选择原则，从远离母离子、裂解方式稳定、碎片离子有足够的丰度等方面进行考察，最终选择的碎裂电压、碰撞能量和定量离子如表3所示。由于金丝桃苷和异槲皮苷是结构异构体，它们有相同分子离子峰[M-H]− m/z 463，MS/MS图谱中有相同的产物离子峰m/z 300，这两个化合物通过比较两者在HPLC中的保留时间进行定位。
表 3 5种黄酮化合物的质谱检测参数黄酮化合物 母离子 产物离子 碰撞电压
（U/ V）碰撞能量
（U/ eV）芦丁 609.1 300.1 190 38 金丝桃苷 463.0 300.1 170 25 异槲皮苷 463.0 300.1 170 25 槲皮素 301.0 151.0 130 19 木犀草素 285.0 132.9 150 37 3.2 定量方法学验证
采用已优化的测定条件，感冒安颗粒中5 种黄酮类成分通过与各自标准对照品的保留时间和MS谱图的比较得以鉴别和确认，结果见图1。由于金丝桃苷、异槲皮苷和芦丁均是以槲皮素为苷元，结合不同的糖而形成，金丝桃苷与异槲皮苷还具有相同的分子量，它们的保留时间非常相近。采用HPLC-UV或二极管阵列检测的方法专属性不强，待测成分间相互干扰，很难保证测定结果的准确性。而本研究采用MS/MS-MRM模式测定，实现了准确定量的目的。
图 1 感冒安颗粒提取液5 种黄酮成分的MRM色谱图A. 芦丁的MRM色谱图；B.金丝桃苷、异槲皮素的MRM色谱图；C.槲皮素的MRM色谱图；D.木犀草素的MRM色谱图；1.芦丁；2. 金丝桃苷；3.异槲皮苷；4.槲皮素；5.木犀草素3.3 结果分析
本研究采用经优化的超声提取法提取感冒安颗粒中黄酮成分，用所建立的LC-MS/MS方法测定了10 个批号样品，结果显示，每批样品中均为芦丁含量最高，金丝桃苷含量最低；批间样品同种黄酮成分含量存在差异。为了保证感冒安颗粒质量的稳定性，临床疗效的一致性，对其中的主要黄酮成分可以考虑设定最低限度要求。感冒安颗粒是经传统水提醇沉工艺制得的稠膏制粒而成，我们以往的研究表明，制剂中含有大量的酸性成分[16]，工艺提取过程中的高温、偏低的pH值可能导致金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等苷类黄酮化合物发生水解反应。本研究将3种黄酮苷对照品及生产工艺获得的稠膏经2 % HCl溶液在80 ℃水浴加热处理30 min，进行HPLC-MS/MS分析，处理后的稠膏样品中金丝桃苷和芦丁含量降低，异槲皮苷和槲皮素含量增加；在3种黄酮苷对照品水解液中，均有槲皮素产生；除此之外，芦丁对照品溶液水解还出现了异槲皮苷。由此可以推测，感冒安颗粒的制备工艺可能导致黄酮类成分的水解和转化。
本研究采用HPLC-MS/MS同时测定了感冒安颗粒中5 种黄酮类成分的含量，所建立方法的专属性、灵敏度、精密度和准确性均已得到确证，达到了同时测定多种结构相似的黄酮类成分的目的，为其质量标准的建立提供了方法学依据。我们的研究已经证明感冒安颗粒中含有多种酚酸类成分[17]，本研究又测定了其中的黄酮类成分。这些成分可能共同作用于流感病毒在宿主内复制的多环节，或者改善流感病毒对机体的炎性损伤，降低炎性细胞因子表达，改善氧化应激损伤，提高机体的免疫力等，充分发挥其多途径和多靶点作用优势，为其预防和治疗流感病毒所致呼吸道感染性疾病奠定物质基础。
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图 1 枇芩口服液HPLC色谱图
注：A1.混合对照品(325nm)；A2.混合对照品(280nm)；B1.供试品(325nm)；B2.供试品(280nm)；C.绿原酸阴性样品、D.咖啡酸阴性样品(325nm)；E.赤芍阴性样品、F.黄芩阴性样品、G.甘草阴性样品(280nm) 1.绿原酸；2.咖啡酸；3.芍药苷；4.黄芩苷；5.黄芩素；6.甘草酸铵；7.汉黄芩素
表 1 枇芩口服液中有效成分的回归方程、相关系数和线性范围
有效成分 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 绿原酸 Y=18.102X−0.0003 0.9991 3.559～35.59 咖啡酸 Y=51.805X+0.0874 0.9993 0.5500～5.500 芍药苷 Y=2.2865X+0.5859 0.9999 29.61～296.1 黄芩苷 Y=215.23X+43.349 0.9999 7.727～77.27 黄芩素 Y=14.843X−69.402 0.9998 6.600～66.00 甘草酸铵 Y=4.7447X−48.701 0.9995 12.85～128.5 汉黄芩素 Y=413.09X−64.950 0.9998 0.1999～1.999 
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表 2 枇芩口服液加样回收率测定结果(n=9)
成 分 样品含量
(µg)加入量
(µg)测得量
(µg)回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）绿原酸 66.46 56.94 122.4 98.24 98.55 0.75 66.46 71.18 136.2 98.02 66.46 88.98 154.9 99.39 咖啡酸 11.32 8.800 19.94 97.99 97.95 0.67 11.32 11.00 22.02 97.27 11.32 13.20 24.33 98.59 芍药苷 638.3 493.5 1117.7 97.14 97.58 0.67 638.3 592.2 1220.7 98.34 638.3 710.6 1329.3 97.25 黄芩苷 151.3 123.6 274.13 99.38 99.70 0.61 151.3 154.5 304.73 99.31 151.3 185. 5 337.47 100.40 黄芩素 103.7 84.48 187.93 99.71 98.88 1.51 103.7 105.6 209.07 99.78 103.7 132.0 231.93 97.15 甘草酸铵 115.5 102.8 217.17 98.90 98.26 1.41 115.5 128.5 243.0 99.22 115.5 154.2 264.57 96.67 汉黄芩素 1.908 1.599 3.427 95.02 96.41 1.41 1.908 1.999 3.837 96.50 1.908 2.399 4.252 97.72
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表 3 枇芩口服液7种成分的含量测定结果（n=3，μg/ml）
批号 绿原酸 咖啡酸 芍药苷 黄芩苷 黄芩素 甘草酸铵 汉黄芩素 20200220 69.54 12.11 615.3 157.3 99.97 112.2 1.709 20200224 66.46 11.32 638.3 151.3 103.7 115.5 1.908 20200315 65.80 11.21 633.2 149.2 105.2 117.2 1.911
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[1] 王庆芬, 杨育儒, 沈秋莲, 等. 枇芩颗粒剂体外抑制金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的作用[J]. 中国现代应用药学, 2015, 32(12):1457-1460. [2] 王庆芬, 倪晓霞, 李杰, 等. 高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量[J]. 中国药业, 2015, 24(16):93-95. [3] 缪小海. 面膜联合中药汤剂治疗寻常痤疮的可行性分析[J]. 临床医药文献电子杂志, 2019, 6(76):150-151. [4] 姚晓, 蒋骊龙, 陈建伟. 双波长HPLC同时测定小儿咳喘灵颗粒中8种有效成分的含量[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(7):1036-1040. [5] 邱小玉, 刘玉萍, 刘烨, 等. HPLC法同时测定茵栀黄口服液中10种有效成分[J]. 中草药, 2019, 50(15):3648-3653. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2019.15.020 -
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