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痛风颗粒是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院名老中医夏涵教授的经典经验方，组方精良，仅由茵陈、连钱草和伸筋草三味中药组成，具有清热利湿、通络的功效，临床多用于治疗痛风性关节炎。在前期研究中发现该方对于缓解患者患处的疼痛有显著的效果[1]。疼痛是一种因组织损伤或潜在的组织损伤而产生的痛苦感觉，它既是机体的一种保护性机制，提醒机体避开或处理伤害，也是临床许多疾病的常见症状。本方组成中单味药的研究发现，茵陈[2]、连钱草和伸筋草[3]均有抗炎镇痛的效果。本研究旨在通过痛风颗粒各有效成分及总有效成分对佐剂性关节炎大鼠模型抗炎镇痛作用机制研究，为中药在镇痛方面的研究提供一定的基础和参考依据。
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健康SD大鼠56只，雄性，SPF级，购自常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(苏)2016-0010。
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茵陈、连钱草、伸筋草按1∶1∶1混合，提取总黄酮、总生物碱和总有机酸，所得各部位质量分数均>50%（上海中医药大学中药所）；茵陈（上海上药华宇药业有限公司，批号：2017121503）；连钱草（批号：171201）、伸筋草（批号：180201）均购自上海同济堂药业有限公司；痛风颗粒（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院委托上海宝龙药业有限公司配制，批号：181001）；苯溴马隆（立加利仙，50 mg/片，德国赫曼大药厂，批号：190612）。
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完全弗氏佐剂（CFA，BioFroxx公司，批号：2203ML010）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批号：190920）；白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素10(IL-10）、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒（批号：2019101803）购自武汉益承生物科技有限公司。
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IX71光学显微镜(OLYMPUS)；DNM-9602酶标仪（北京普朗新技术有限公司）；AC8洗板机（芬兰Thermo Lab systems）；TGL-16M离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；GNP-9080隔水式恒温培养箱（苏州江东精密仪器有限公司）；吉尔森P型移液器(Pipetman)。
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模型组及对照组大鼠，采用完全弗氏佐剂诱导关节炎大鼠模型[4-5]。取弗氏佐剂（每支10 ml），在冰浴下与卡介苗混合，配制成含卡介苗10 mg/ml的水包油乳剂，对大鼠右后足趾皮下进针至踝关节，注射弗氏佐剂0.1 ml致炎，诱导关节炎发生；空白组于相同位置注射0.1 ml生理盐水。
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SD大鼠56只，雄性，体重（180±20）g，随机分为空白组、模型组、总黄酮组、总有机酸组、总生物碱组、痛风颗粒组、阳性对照组(苯溴马隆)等7组，每组8只，适应性饲养1周，模型组和对照组进行造模，于造模后第15天开始给药，空白组、模型组每日给予蒸馏水1 ml灌胃；痛风颗粒组给予相当于生药6.88 g/kg的痛风颗粒煎剂；总黄酮组给予相当于生药150 mg/kg的总黄酮提取物；总有机酸组给予相当于生药110 mg/kg的总有机酸提取物；总生物碱组给予相当于生药90 mg/kg的总生物碱的提取物；阳性对照组给予5.25 mg/kg苯溴马隆。每天灌胃一次，连续灌胃30 d。
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在各组大鼠右后足踝关节上同一位置划一标记线，分别于造模前及造模后第15、25、35、45 d测量并记录各组大鼠右后足的标记线以下足容积(ml3)，记录结果，计算足趾肿胀率，[足趾肿胀率=（致炎后足趾体积－致炎前足趾体积）/致炎前足趾体积]。
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造模后第44天，禁食禁水12 h，末次给药2 h后将大鼠用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血2 ml测定大鼠血常规。
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将“2.3.2”项下大鼠腹主动脉取血5 ml，静置0.5 h后，4 ℃保存，以3000 r/min，离心10 min，取血清保存于−20 ℃条件下备用。采用ELISA试剂盒测定并计算IL-6、IL-10和TNF-α水平。
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取大鼠踝关节标本置于10%甲醛溶液固定48 h，置于5%稀硝酸溶液，脱钙48 h；在室温下进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片后进行HE染色，显微镜下观察大鼠关节组织病理变化。
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采用SPSS 23.0统计软件进行分析，踝关节肿胀实验采用重复测量和多变量过程分析,计量资料比较采用单因素方差分析，组间均数的两两比较采用最小显著差别（LSD）法，计量资料用平均数±标准差（
$\bar {\rm{x}}$ ±s）表示。 -
由表1所示，与空白组相比，模型组大鼠在造模后第15、25、35、45 天时均有显著性差异(P<0. 01)，提示造模成功。与模型组相比，痛风颗粒各有效部位群、痛风颗粒、阳性对照组在第25、35、45 天均具有显著性差异(P<0.01)，提示各治疗组能不同程度减轻弗氏佐剂关节炎大鼠的踝关节肿胀程度。造模后第25天，与痛风颗粒组比较，总生物碱组无显著性差异(P>0. 05)，提示造模后第25天总生物碱组与痛风颗粒全方组在缓解弗氏佐剂关节炎大鼠的踝关节肿胀程度的疗效上相近。造模后第35天，与阳性对照组比较，痛风颗粒组无显著性差异(P>0.05)，提示造模后第35天痛风颗粒组与阳性对照组在缓解弗氏佐剂关节炎大鼠的踝关节肿胀程度的疗效上相近。
表 1 痛风颗粒及其各有效部位群对弗氏佐剂致炎大鼠踝关节肿胀的影响(n=8，
$ {\rm{\bar x}} \pm {\rm{s}}$ )组别 肿胀率（%） 造模前 造模后15 d 造模后25 d 造模后35 d 造模后45 d 空白组 1.57±0.22 6.43±0.21 8.53±0.47 11.79±0.57 10.93±0.55 模型组 1.47±0.29 74.40±1.33* 77.47±1.59* 72.71±1.23* 61.91±1.53* 总黄酮组 1.53±0.30 75.50±2.04 68.96±1.96#△▲ 61.53±0.97#△▲ 51.91±1.43#△▲ 总有机酸组 1.46±0.28 75.66±2.22 67.56±1.47#△▲ 63.24±1.30#△▲ 49.50±3.43#△▲ 总生物碱组 1.57±0.33 75.76±2.57 57.37±0.93#▲ 52.16±0.67#△▲ 47.93±1.88#△▲ 痛风颗粒组 1.46±0.24 76.01±1.38 57.15±2.59#▲ 48.10±1.23# 43.10±1.10#▲ 阳性对照组 1.49±0.28 74.53±2.77 52.86±1.17# 47.30±0.97# 37.58±1.56# *P<0.01，模型组与空白组比较；#P<0.01，各治疗组与模型组比较；△P<0.01，各有效部位群组与痛风颗粒组比较；▲P<0.01，痛风颗粒及各有效部位群组与阳性对照组比较。 -
由表2所示，痛风颗粒各有效部位群对致炎大鼠血液中白细胞计数（WBC）影响结果提示，总有机酸组、总生物碱组、痛风颗粒组及阳性对照组大鼠血液中白细胞计数有下降的趋势，但与模型组比较，无显著性差异(P>0.05)。痛风颗粒各有效部位群对致炎大鼠血液中中性粒细胞百分比（N%）的影响结果提示，总黄酮组、痛风颗粒组和阳性对照组大鼠血液中中性粒细胞百分比含量有下降的趋势，但与模型组比较，无显著性差异(P>0.05)。
表 2 痛风颗粒及其各有效部位群对弗氏佐剂致炎大鼠血液中白细胞计数及中性粒细胞百分比的影响(n=8，
$ {\rm{\bar x}} \pm {\rm{s}}$ )组别 WBC（×109/L） N（%） 空白组 4.45±0.40 28.05±5.30 模型组 5.52±0.75 31.17±4.41 总黄酮组 5.13±1.67 26.80±3.31 总有机酸组 4.70±1.07 29.05±5.95 总生物碱组 4.62±1.51 29.63±7.00 痛风颗粒组 4.52±0.87 26.35±4.82 阳性对照组 4.48±0.92 26.32±2.62 -
由表3所示，与空白组比较，模型组对弗氏佐剂致炎大鼠血清中IL-6、IL-10和TNF-α的含量有显著性差异，有统计学意义（P<0.01），提示造模成功。与模型组比较，各组均有显著性差异（P<0.05，P<0.01），提示痛风颗粒各有效部位群能显著降低模型大鼠的血清IL-6、TNF-α水平，升高IL-10水平。大鼠血清IL-6、TNF-α水平与阳性对照组比较，总黄酮组、总有机酸组和总生物碱组有显著性差异（P<0.05，P<0.01），痛风颗粒组无显著性差异(P>0.05)，提示痛风颗粒组降低大鼠血清IL-6、TNF-α水平与阳性对照组相似。大鼠血清IL-10水平，与阳性对照组比较，总黄酮组、总有机酸组有显著性差异（P<0.01），总生物碱组和痛风颗粒组无显著性差异(P>0.05)，提示总生物碱组和痛风颗粒组在升高IL-10水平上与阳性对照组疗效相似。
表 3 痛风颗粒及其各有效部位群对弗氏佐剂致炎大鼠血清中IL-6、IL-10和TNF-α的影响(n=8，
$ {\rm{\bar x}} \pm {\rm{s}}$ )组别 IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L） IL-10（ng/L） 空白组 96.46±14.39 57.96±6.68 62.93±2.10 模型组 191.58±9.04** 136.03±9.16** 34.29±2.98** 总黄酮组 141.04±12.45##△△ 98.37±6.46##△△ 37.87±3.43#△△ 总有机酸组 154.11±9.47##△△ 97.59±5.18##△△ 38.07±5.55#△△ 总生物碱组 110.65±7.40##△ 85.33±8.06##△△ 50.62±1.97## 痛风颗粒组 98.84±8.55## 65.14±4.96## 48.15±2.97## 阳性对照组 97.35±13.63## 58.95±8.61## 47.63±1.88## **P<0.01，模型组与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，各治疗组与模型组比较；△P<0.05，△△P<0.01，痛风颗粒及各有效部位群组与阳性对照组比较。 -
由图1所示，正常组大鼠骨、骨关节、滑膜组织未见明显病理性改变，滑膜组织结构清晰，无炎性细胞浸润。模型组骨关节表面软骨破坏，大量纤维组织增生、滑膜增生，炎细胞浸润。与模型组比较，总黄酮组骨关节表面软骨破坏、纤维组织增生减轻、滑膜水肿；总有机酸组骨关节表面软骨破坏和纤维组织增生减轻；总生物碱组骨关节表面软骨破坏，纤维组织增生减轻；痛风颗粒组骨关节软骨无异常，滑膜细胞增生和周围软组织炎症减轻；阳性对照组骨关节表面软骨破坏和纤维组织增生减轻，滑膜仅有轻度增生。
图 1 各组大鼠关节组织病理形态学(HE×200)
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痛风是一组嘌呤代谢异常的疾病，其临床特征多表现为关节红肿，疼痛难忍，且多反复性发作[6]。在中医学中类似于“痹证”“历节”等病症，多为因内伤气血亏虚，外感风寒湿邪，以致痰瘀流注筋脉，久病入络，痹阻关节所致[7]。痛风颗粒中以茵陈作为君药，有通利关节、清利湿热的功效；臣药连钱草，具有利湿通淋、清热解毒、散瘀消肿的功效，取其消石之功，防止痛风性尿路结石的产生；伸筋草有除湿消肿、舒筋活络的功效。三药配伍可以增强清利湿热、通络的作用。
本研究结果显示，痛风颗粒及其各有效部位群能明显抑制佐剂性关节炎大鼠的踝关节肿胀，用药25 d后，总生物碱组对大鼠肿胀率的抑制率与痛风颗粒全组方组接近，研究表明伸筋草中的生物碱类主要有石松碱(lycopodine)型、石松定碱(lycodine)型和法氏石松碱(fawcettimine)型三种[8]，可通过免疫调节机制对佐剂性关节炎发挥治疗作用[9]，这与课题组对伸筋草中生物碱的研究结果相一致[10]。用药第35天，痛风颗粒组与阳性对照组在缓解弗氏佐剂关节炎大鼠的踝关节肿胀程度的作用上相似，这与痛风颗粒在临床使用的结果相一致[11]。用药45 d后，痛风颗粒及其有效部位群均能不同程度降低弗氏佐剂关节炎大鼠的关节肿胀，关节炎的病理变化表现在滑膜细胞的炎性浸润，各治疗组病理形态学结果提示痛风颗粒组和阳性对照组能减轻滑膜细胞增生，总黄酮组、总有机酸组和总生物碱组能减轻纤维组织增生，这与关节肿胀实验结果相一致，提示痛风颗粒及其有效部位群对弗氏佐剂关节炎大鼠具有抗炎镇痛的作用。
各组关节炎大鼠白细胞计数及中性粒细胞百分比无显著性差异，但经痛风颗粒及其各有效部位群干预后，均有不同程度的下降趋势。这可能是由于WBC和N%的测定在造模后第45天进行，大鼠的炎症反应有所降低，而致该炎性指标不敏感，在今后的实验设计中宜进一步进行分时检测。
当痛风由急性期转变为慢性期时，会出现关节损害[12]。其机制可能与破骨细胞数量增多有关[13]，核转录因子-κB受体（RANK）与核因子κB活化因子配体（RANKL）结合情况对破骨细胞的生成具有密切的联系[14]。促炎细胞因子如IL-6有致痛和痛觉增敏的作用，在痛风时和间质浸润中表达增高，可导致痛风性关节炎的加重；促炎因子TNF-α是关节炎早期的关键调控因子，其水平升高能引起滑膜炎症和关节破坏[15]；抗炎因子IL-10具有抑制促炎细胞因子的产生[16]及下调促炎因子受体表达的作用。因此，降低血清TNF-α、IL-6[17]，升高IL-10含量能减弱对疼痛传入神经系统的刺激，达到抗炎镇痛的作用。本研究采用ELISA法测定血清TNF-α、IL-6和IL-10分泌水平，模型组大鼠的TNF-α、IL-6水平显著升高、IL-10水平显著降低，各治疗组能抑制TNF-α、IL-6的分泌，促进IL-10的生成，从而减少关节的炎症产生和减轻关节组织的破坏。结果表明痛风颗粒及其有效部位群可能通过促炎因子及上调抗炎因子达到保护关节的作用。其中痛风颗粒组和阳性对照组在抑制TNF-α、IL-6分泌的程度相当，表明痛风颗粒全方组的抑制促炎因子作用优于各有效部位群。生物碱组和痛风颗粒组在上调IL-10的作用程度相当，说明生物碱的上调抗炎因子作用与全方组相当。有研究表明，生物碱类成分能够激活NF-κB信号通路，促使其进入调控下游靶基因如IL-10发挥抗炎作用[18]。
综上所述，痛风颗粒及其有效部位群能通过调控IL-6、TNF-α和IL-10水平来降低炎性因子，达到抗炎镇痛，缓解痛风性关节炎的作用。痛风颗粒的调控要优于各有效部位群，其中总生物碱在调控IL-10水平上不劣于痛风颗粒，但其作用机制较为复杂，有待进一步探究。
Study on the anti-inflammatory and analgesic effects of active fractions of Tongfeng granule on arthritis rats
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摘要:
目的 通过痛风颗粒各有效部位群对完全弗氏佐剂诱导的关节炎大鼠抗炎镇痛作用差异，探讨痛风颗粒及其各有效部位群可能的抗炎镇痛作用机制。 方法 将健康SD大鼠56只，随机分为空白组、模型组、总黄酮组、总有机酸组、总生物碱组、痛风颗粒组和阳性对照组，除空白组外，其余6组均建立关节炎的病理模型。造模成功15 d后，连续灌胃给药30 d。测定关节炎大鼠的踝关节肿胀、白细胞计数、嗜中性粒细胞百分比、血清白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平以及关节组织病理形态学。 结果 与模型组相比，痛风颗粒各有效部位群、痛风颗粒及阳性对照组的踝关节肿胀率均显著下降（P<0.01）。痛风颗粒各有效部位群、痛风颗粒及阳性对照组能减轻纤维组织增生，与模型组相比，痛风颗粒各有效部位群、痛风颗粒及阳性对照组的血液中白细胞计数（WBC）和中性粒细胞百分比（N%）无显著性差异(P>0.05)。与模型组相比，痛风颗粒各有效部位群、痛风颗粒及阳性对照组能显著降低模型大鼠的血清IL-6、TNF-α水平，升高IL-10水平（P<0.05，P<0.01）。 结论 该研究明确了痛风颗粒有效部位群的抗炎镇痛作用，为进一步临床用药和制剂开发提供依据。 Abstract:Objective To investigate the anti-inflammatory and analgesic effects of the active fractions of Tongfeng granules on rats with arthritis induced by complete Freund's adjuvant. Methods 56 SD rats were randomly divided into seven groups, blank group, model group, total flavonoids group, total organic acid group, total alkaloid group, Tongfeng granule group and positive control group. Except for the blank group, the remaining 6 groups established joints pathological model of inflammation. 15 days after the successful modeling, intragastric drug administration was continued for 30 days. The swelling of ankle joint, WBC, N%, IL-6, IL-10, TNF-α and the histopathology of joint were measured. Results Comparing with the model group, each effective fraction group of Tongfeng granules, Gout granules and positive control group decreased the ankle joint swelling rate significantly (P<0.01) and reduced fibrous tissue proliferation. There was no significant difference in WBC and N% of neutrophils. They significantly reduce the level of serum IL-6 and TNF-α, and increase the level of IL-10 (P<0.05, P<0.01). Conclusion This study clarifies the anti-inflammatory and analgesic effects of active fractions of Tongfeng granules and provides a basis for further clinical medication and preparation development. -
Key words:
- gout granule /
- active fractions /
- anti-inflammation /
- analgesia
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流感是一种严重的上呼吸道病毒感染，由于其高毒力和突变率，该病毒仍然是对公众健康的主要威胁。据美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织估计，每年有多达65 万人死于季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。传统中医药预防和治疗流感病毒导致的感染（如呼吸道肺炎和支气管炎）已成为中国临床上常规治疗策略，发挥了独特的医疗优势[2,3]。
感冒安颗粒是由金银花、连翘、板蓝根、拳参、桑叶、紫苏和荆芥等七味中药制成的复方制剂，临床应用30 多年，具有疏散风邪，解表退热功能，其预防和治疗呼吸道感染的作用已得到很好的临床验证，特别是在病毒感染初期的治疗效果尤其显著，但药效物质基础并不清楚。目前，建立了TLC法对方中的板蓝根和连翘两味药材进行特征鉴别；同时对方中各药味的共有成分绿原酸和齐墩果酸也建立了TLC鉴别方法。在含量限度方面，则建立了制剂中连翘酯苷A的HPLC法。尽管这些获批的标准已用于制剂常规质量控制，但尚需进一步进行质量评价，以期更客观、准确地反映感冒安颗粒的临床疗效。
由于中药复方复杂的化学成分，它的药理作用是通过多靶点、多途径而实现的。流感病毒感染的病理生理过程主要是病毒的直接作用和宿主免疫反应损伤（如细胞因子风暴所致的炎性损伤和ROS导致的氧化应激损伤）的结果[2,4]。为了研究感冒安颗粒临床效果的药效物质基础，我们对组方各药味的化学成分进行了文献追踪，发现方中药味含有多种黄酮类成分，如异槲皮苷、芦丁、木樨草素及木樨草苷等[5-9]。而黄酮类成分对流感病毒的作用越来越受到关注[10,11]。异槲皮苷抑制流感病毒A和B的复制，与抗病毒药amantadine或者oseltamivir合用可抑制它们导致的耐药病毒出现[12]。槲皮素与流感病毒A H1N1（A/PR/8/34）的神经酰胺酶的结合与zanamivir相当，体内研究也证实了其抗流感病毒能力，可作为抗甲型H1N1流感的有效先导化合物[13]。Zima研究认为木犀草素及其同源物是强效流感核酸内切酶抑制剂，揭示黄酮类化合物的抗流感作用[14]。鉴于此，本研究在总黄酮含量测定的基础上[15]，采用HPLC-MS/MS方法建立5 种黄酮类成分的定量方法，不仅为制剂质量评价提供方法学，也为进一步研究感冒安颗粒防治流感病毒引起的呼吸道感染机制奠定物质基础。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS仪，配以Triple Quad B.02.01（B2043.12）数据处理软件（美国安捷伦公司）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；DL-720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。1.2 试药
感冒安颗粒（本院院内制剂，批号110418、110704、111025、111121、111130、111221、120131、120201、120207、120214）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，供UV法测定，含量以92.5 %计，批号：100080-200707）；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以93.9 %计，批号：111521-201004）；木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111520-200504）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100081-200406）；异槲皮苷对照品（成都曼斯特生物制品有限公司，纯度>99.0 %，批号：MUST-10021901）；甲醇为色谱纯；甲酸为分析纯；水为蒸馏水。
2. 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素对照品各适量，用甲醇溶解，摇匀，各配制成500 μg/ml的对照品贮备液。分别精密量取5种对照品贮备液适量，稀释成浓度如下：分别含芦丁0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml，金丝桃苷0.002、0.008、0.020、0.032、0.044、0.056、0.080 μg/ml，异槲皮苷0.03、0.10、0.25、0.45、0.65、0.95、2.00 μg/ml，槲皮素0.02、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.70 μg/ml，木犀草素0.012、0.026、0.040、0.054、0.082、0.096、0.200 μg/ml的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备
按已优化的黄酮提取方法进行[15]。取样品约0.5 g，精密称定，置量瓶中，加70 %甲醇35 ml，超声提取30 min，放冷，过滤，滤液加70 %甲醇溶液定容至50 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.2 色谱-质谱条件
色谱条件：采用Kromasil C 18（4.6 mm×150 mm，5 μm，100 Å）色谱柱；甲醇（A）- 0.1 %甲酸（B）作为流动相，按0～20 min，35 % A；20～40 min，45 % A梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾负离子化（ESI−）源：毛细管电压 3.0 kV；气体温度 350 ℃，气体流速 10 L/min，雾化气压 35 psi。多反应模式（MRM）监测。5种黄酮检测的离子对：芦丁m/z 609.1→300.1、金丝桃苷和异槲皮苷m/z 463.0→300.1、槲皮素m/z 301.0→151.0、木犀草素m/z 285.0→132.9。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测限和定量限
采用上述色谱条件，每个待测化合物对照品用70%甲醇溶液进行系列稀释，分别以信噪比（S/N）等于3和10确定各自的检测限和定量限。结果见表1。
表 1 5种黄酮成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限黄酮化合物 线性方程 相关系数
r线性范围
（ng/ml）检测限
（ng/ml）定量限
（ng/ml）芦丁 Y=24 527X–162.17 0.999 7 250~8 000 0.025 0.50 金丝桃苷 Y=34 123X– 1.7381 0.999 1 2~80 0.005 0.01 异槲皮苷 Y=29 935X+1 597.80 0.999 1 30 ~2 000 0.02 0.50 槲皮素 Y=19 667X+370.71 0.999 2 20~700 0.02 0.10 木犀草素 Y=33 076X–177.98 0.999 7 12~200 0.005 0.01 2.3.2 线性范围考察
精密量取“2.1.1”项下配制的5 种黄酮成分的对照品混合溶液，照“2.2”项下进样测定，记录各待测组分的峰面积积分值。横坐标为黄酮成分质量浓度（X，ng/ml），纵坐标为峰面积（Y），进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果见表1，表明5 种黄酮成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验
精密吸取供试品溶液（批号
120131 ），照“2.2”项下操作，进样，连续测定5 次和连续测定5 d，记录各待测组分的峰面积积分值，计算日内、日间RSD。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的日内精密度RSD分别为1.09 %、1.42 %、1.69 %、0.86 %、1.27 %（n=5），日间精密度RSD分别为1.85 %、1.76 %、1.43 %、2.01 %、1.90 %（n=5），表明仪器精密度良好。2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号
120131 ）5 份，各0.5 g，精密称定，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，并进行含量测定。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的含量分别为260.16、1.84、19.76、13.39、3.73 μg/g（n=5），RSD分别为1.51 %、1.73 %、0.90 %、1.44 %、1.68 %（n=5），表明方法的重复性良好。2.3.5 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号120131）9 份，每份约0.5 g，精密称定，各精密加入对照品贮备液适量，使已知样品中加入的相当对照品量分别含芦丁140.00 μg、金丝桃苷0.90 μg、异槲皮苷10.00 μg、槲皮素7.00 μg、木犀草素1.90 μg的各对照品贮备液，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算加样回收率。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的平均加样回收率分别为：102.06%、101.60%、100.63%、102.81%、101.80%（n=9），RSD分别为1.56%、1.93%、0.67%、2.07%、1.84%（n=9）。
2.3.6 样品含量测定
取10 个批号的感冒安颗粒，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算含量，结果见表2。
表 2 不同批号感冒安颗粒含量测定结果（$\bar x $ ±s, n=3）批号 芦丁 金丝桃苷 异槲皮苷 槲皮素 木犀草素 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 110418 479.83±1.99 0.41 0.855±0.004 0.49 20.54±0.25 1.23 14.83±0.05 0.31 3.46±0.06 1.70 110704 198.98±3.01 1.52 0.596±0.006 1.05 11.79±0.20 1.68 15.31±0.13 0.86 4.51±0.01 0.19 111025 32.23±0.26 0.83 0.993±0.012 1.26 13.31±0.00 0.02 6.53±0.04 0.55 5.15±0.08 1.58 111121 69.18±1.03 1.51 0.499±0.006 1.26 13.36±0.21 1.56 8.04±0.14 1.69 5.65±0.07 1.19 111130 67.53±0.27 0.40 0.533±0.008 1.57 13.36±0.21 1.54 7.48±0.12 1.62 5.42±0.06 1.15 111221 275.38±3.61 1.31 0.291±0.002 0.73 11.44±0.02 0.21 15.74±0.02 0.14 6.51±0.02 0.24 120131 264.55±0.51 0.19 1.825±0.012 0.68 20.29±0.04 0.17 13.66±0.02 1.52 3.78±0.01 0.26 120201 239.19±1.55 0.65 0.593±0.010 1.76 18.95±0.06 0.33 18.41±0.21 1.16 3.86±0.03 0.81 120207 109.20±2.14 1.97 0.503±0.004 0.83 18.00±0.21 1.16 6.72±0.08 1.22 4.21±0.02 0.37 120214 108.93±0.59 0.54 0.461±0.002 0.45 17.67±0.10 0.01 6.32±0.08 1.19 4.73±0.01 0.11 3. 讨论
3.1 MS/MS条件的优化
为了获得良好的MS结果，优化了检测的离子模式、碎裂电压、碰撞能量等参数，以获得高灵敏度的分子离子和碎片离子。结果显示，ESI采用负离子模式可使待测的黄酮成分有更高的灵敏度。对照品混合液经产物离子扫描显示，芦丁的主要碎片为m/z：300.1、271.0；金丝桃苷和异槲皮苷的主要碎片为m/z：300.1、270.8；槲皮素的主要碎片为m/z：178.6、151.0、120.9、106.9；木犀草素的主要碎片为m/z：150.9、132.9、106.8。依据定量碎片离子选择原则，从远离母离子、裂解方式稳定、碎片离子有足够的丰度等方面进行考察，最终选择的碎裂电压、碰撞能量和定量离子如表3所示。由于金丝桃苷和异槲皮苷是结构异构体，它们有相同分子离子峰[M-H]− m/z 463，MS/MS图谱中有相同的产物离子峰m/z 300，这两个化合物通过比较两者在HPLC中的保留时间进行定位。
表 3 5种黄酮化合物的质谱检测参数黄酮化合物 母离子 产物离子 碰撞电压
（U/ V）碰撞能量
（U/ eV）芦丁 609.1 300.1 190 38 金丝桃苷 463.0 300.1 170 25 异槲皮苷 463.0 300.1 170 25 槲皮素 301.0 151.0 130 19 木犀草素 285.0 132.9 150 37 3.2 定量方法学验证
采用已优化的测定条件，感冒安颗粒中5 种黄酮类成分通过与各自标准对照品的保留时间和MS谱图的比较得以鉴别和确认，结果见图1。由于金丝桃苷、异槲皮苷和芦丁均是以槲皮素为苷元，结合不同的糖而形成，金丝桃苷与异槲皮苷还具有相同的分子量，它们的保留时间非常相近。采用HPLC-UV或二极管阵列检测的方法专属性不强，待测成分间相互干扰，很难保证测定结果的准确性。而本研究采用MS/MS-MRM模式测定，实现了准确定量的目的。
图 1 感冒安颗粒提取液5 种黄酮成分的MRM色谱图A. 芦丁的MRM色谱图；B.金丝桃苷、异槲皮素的MRM色谱图；C.槲皮素的MRM色谱图；D.木犀草素的MRM色谱图；1.芦丁；2. 金丝桃苷；3.异槲皮苷；4.槲皮素；5.木犀草素3.3 结果分析
本研究采用经优化的超声提取法提取感冒安颗粒中黄酮成分，用所建立的LC-MS/MS方法测定了10 个批号样品，结果显示，每批样品中均为芦丁含量最高，金丝桃苷含量最低；批间样品同种黄酮成分含量存在差异。为了保证感冒安颗粒质量的稳定性，临床疗效的一致性，对其中的主要黄酮成分可以考虑设定最低限度要求。感冒安颗粒是经传统水提醇沉工艺制得的稠膏制粒而成，我们以往的研究表明，制剂中含有大量的酸性成分[16]，工艺提取过程中的高温、偏低的pH值可能导致金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等苷类黄酮化合物发生水解反应。本研究将3种黄酮苷对照品及生产工艺获得的稠膏经2 % HCl溶液在80 ℃水浴加热处理30 min，进行HPLC-MS/MS分析，处理后的稠膏样品中金丝桃苷和芦丁含量降低，异槲皮苷和槲皮素含量增加；在3种黄酮苷对照品水解液中，均有槲皮素产生；除此之外，芦丁对照品溶液水解还出现了异槲皮苷。由此可以推测，感冒安颗粒的制备工艺可能导致黄酮类成分的水解和转化。
本研究采用HPLC-MS/MS同时测定了感冒安颗粒中5 种黄酮类成分的含量，所建立方法的专属性、灵敏度、精密度和准确性均已得到确证，达到了同时测定多种结构相似的黄酮类成分的目的，为其质量标准的建立提供了方法学依据。我们的研究已经证明感冒安颗粒中含有多种酚酸类成分[17]，本研究又测定了其中的黄酮类成分。这些成分可能共同作用于流感病毒在宿主内复制的多环节，或者改善流感病毒对机体的炎性损伤，降低炎性细胞因子表达，改善氧化应激损伤，提高机体的免疫力等，充分发挥其多途径和多靶点作用优势，为其预防和治疗流感病毒所致呼吸道感染性疾病奠定物质基础。
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表 1 痛风颗粒及其各有效部位群对弗氏佐剂致炎大鼠踝关节肿胀的影响(n=8，
$ {\rm{\bar x}} \pm {\rm{s}}$ )组别 肿胀率（%） 造模前 造模后15 d 造模后25 d 造模后35 d 造模后45 d 空白组 1.57±0.22 6.43±0.21 8.53±0.47 11.79±0.57 10.93±0.55 模型组 1.47±0.29 74.40±1.33* 77.47±1.59* 72.71±1.23* 61.91±1.53* 总黄酮组 1.53±0.30 75.50±2.04 68.96±1.96#△▲ 61.53±0.97#△▲ 51.91±1.43#△▲ 总有机酸组 1.46±0.28 75.66±2.22 67.56±1.47#△▲ 63.24±1.30#△▲ 49.50±3.43#△▲ 总生物碱组 1.57±0.33 75.76±2.57 57.37±0.93#▲ 52.16±0.67#△▲ 47.93±1.88#△▲ 痛风颗粒组 1.46±0.24 76.01±1.38 57.15±2.59#▲ 48.10±1.23# 43.10±1.10#▲ 阳性对照组 1.49±0.28 74.53±2.77 52.86±1.17# 47.30±0.97# 37.58±1.56# *P<0.01，模型组与空白组比较；#P<0.01，各治疗组与模型组比较；△P<0.01，各有效部位群组与痛风颗粒组比较；▲P<0.01，痛风颗粒及各有效部位群组与阳性对照组比较。 
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表 2 痛风颗粒及其各有效部位群对弗氏佐剂致炎大鼠血液中白细胞计数及中性粒细胞百分比的影响(n=8，
$ {\rm{\bar x}} \pm {\rm{s}}$ )组别 WBC（×109/L） N（%） 空白组 4.45±0.40 28.05±5.30 模型组 5.52±0.75 31.17±4.41 总黄酮组 5.13±1.67 26.80±3.31 总有机酸组 4.70±1.07 29.05±5.95 总生物碱组 4.62±1.51 29.63±7.00 痛风颗粒组 4.52±0.87 26.35±4.82 阳性对照组 4.48±0.92 26.32±2.62
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表 3 痛风颗粒及其各有效部位群对弗氏佐剂致炎大鼠血清中IL-6、IL-10和TNF-α的影响(n=8，
$ {\rm{\bar x}} \pm {\rm{s}}$ )组别 IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L） IL-10（ng/L） 空白组 96.46±14.39 57.96±6.68 62.93±2.10 模型组 191.58±9.04** 136.03±9.16** 34.29±2.98** 总黄酮组 141.04±12.45##△△ 98.37±6.46##△△ 37.87±3.43#△△ 总有机酸组 154.11±9.47##△△ 97.59±5.18##△△ 38.07±5.55#△△ 总生物碱组 110.65±7.40##△ 85.33±8.06##△△ 50.62±1.97## 痛风颗粒组 98.84±8.55## 65.14±4.96## 48.15±2.97## 阳性对照组 97.35±13.63## 58.95±8.61## 47.63±1.88## **P<0.01，模型组与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，各治疗组与模型组比较；△P<0.05，△△P<0.01，痛风颗粒及各有效部位群组与阳性对照组比较。
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