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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是真核细胞中的一种重要的代谢氧化还原辅酶，它在各种生物过程中起关键作用，包括新陈代谢、衰老、细胞死亡、DNA 修复和表达[1-2]。NAD主要有3种生物合成途径，在哺乳动物中，补救途径是NAD的主要来源并且该途径只有两个步骤（图1）。NAD 在该途径中的合成速率主要由烟酰胺磷酸核糖基转移酶（Nampt）决定，该步骤首先将烟酰胺（NAM）和5-磷酸核糖基-1-焦磷酸（PRPP）转化为烟酰胺单核苷酸（NMN）。然后，在第二步中将NMN与ATP偶联并转化为NAD[3]。直接使用NMN可以弥补NAD的不足，因此NMN可以参与多种疾病的调节，如2型糖尿病、肥胖症、心力衰竭、神经再生和炎症等[4-8]。
溃疡性结肠炎是炎症性肠病的一种。近年来，其病因和发病机制的研究受到广泛关注[9-11]。目前治疗溃疡性结肠炎的手段主要是对症治疗，如抗感染药、糖皮质激素和免疫抑制剂等，但这些药物长期使用会带来很多不良反应[12-13]。NAD与多种炎症性疾病有关，如败血症和类风湿性关节炎[14-15]。此外，有报道显示，炎症性肠病患者结肠组织和血清中Nampt浓度升高，并将Nampt作为小儿炎症性肠病严重程度的标志物[16-17]。因此，作为NAD合成的中间重要产物NMN，也有可能对炎症性肠病产生一定作用。与此同时，目前有很多含有NMN的保健品问世，但是由于NMN参与调节的功能非常复杂，并且有研究表明NMN可以促进肿瘤的增殖等作用[18]，因此，补充NMN并不一定对人体都有益。并且，NMN作为保健品需要长期服用，但对于一些患有如炎症性肠病的慢性病患者，评价其对于患者的安全性极其重要。
本研究主要考察NMN对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型的作用。以评价NMN作为保健品是否适用于患有溃疡性结肠炎的患者。
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雄性C57小鼠（8周龄，上海西普尔-必凯实验动物有限公司），放于实验室适应2周后进行造模。按照之前的方法进行模型制备[19]，将DSS（美国MP公司，分子量为36 000～50 000）溶于水中，至终浓度为3%，让小鼠自由饮用。
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将NMN[音芙医药科技（上海）有限公司]溶于生理盐水中，制备不同浓度的NMN溶液，将雄性C57小鼠分为6组，分别为生理盐水对照组，3、10、30、100、300 mg/kg NMN的不同剂量组。按照容积0.1 ml/10 g，通过灌胃（ig）和腹腔注射（ip）两种方式，从第1天开始给药，每天1次，直至实验观察结束。
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按照之前的评分标准进行评分[19]，对体重下降程度、大便性状、血便情况分别进行评分，而后进行加和，计算总分数。具体评分标准见表1。
表 1 疾病评分
评分 体重下降（%） 大便性状 血便情况 0 无 正常 无 1 1～5 — — 2 5～10 半稀便 潜血 3 10～15 — — 4 ≥15 稀便 肉眼血便 注：“—”表示无此项评分。 -
小鼠处死后，取整个结肠部位，测量长度进行比较。而后将结肠下段部位组织用4%多聚甲醛固定24 h，然后包埋在石蜡中。准备厚度为4 μm的切片，按照之前的实验方法，进行HE染色[19]。
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本实验指标均为定量数据，数据以（
$\bar x \pm s$ ）表示。两两比较采用t-test法进行，采用GraphPad Prism 7统计软件进行统计分析。 -
为了确定实验的最佳观察时间，首先对小鼠的生存曲线进行测定。将100和300 mg/kg的NMN通过灌胃的给药方式，检测3%DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠生存时间（图2），在给药第9天时，300 mg/kg组中有2只小鼠死亡，生理盐水对照组和100 mg/kg组在第10 天出现小鼠死亡。第17天时，300 mg/kg组小鼠全部死亡，而在第20天时，生理盐水对照组和100 mg/kg组全部死亡。3组生存曲线之间并无统计学差异。由于在给药第9天时，有小鼠出现死亡，因此我们将后面实验的观察时间设定为8 d。
图 2 NMN对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠生存曲线的影响（每组n = 10）
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为了考察不同给药方式对小鼠的影响，我们分别通过灌胃和腹腔注射两种给药方式，观察NMN对于小鼠体重和DAI的影响，如图3所示，灌胃和腹腔注射两种给药方式对溃疡性结肠炎模型小鼠体重和DAI分数的影响无显著性差异，二者都在第5天时表现出体重下降并出现稀便情况。因此，为了更真实的模拟人用药环境，我们在后续实验中均采用灌胃的给药方式。
图 3 NMN不同给药方式对于DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重和DAI影响
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为了进一步考察不同浓度NMN对DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠的影响，我们应用了不同浓度的NMN通过灌胃给药的方式，分别对小鼠的体重和DAI进行了检测。结果显示（图4A、4B），不同浓度的NMN对小鼠的体重和DAI的影响，与对照组相比均无显著性差异。为了更进一步确认，我们又对结肠长度和结肠形态进行了检测，结果显示（图4C、4D），300 mg/kg的NMN与对照组相比，肠道长度和免疫组化切片结果并无显著性差异。
图 4 不同浓度的NMN对DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠的作用
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本研究测定了不同剂量的NMN对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的体重、DAI评分、结肠长度和肠道形态的影响，即NMN对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠并无显著作用。
NMN作为NAD的前体，其功能目前认为是通过NAD来体现的，NNM和NAD的代谢是紧密联系的。NAD在人体内有3条生化途径：Preiss-Handler途径、从头合成途径和补救合成途径（图1）[20]。Preiss-Handler途径从NA开始，经过NAPRT催化变成NAMN，经过NMNAT的催化，变成NAAD，然后再被NAD合成酶NADS催化成NAD[21]。从头合成途径首先是从食物中摄取的色氨酸开始，经过一系列体内生化反应生成喹啉酸（QA），而后经过（QPRT催化生成NAMN进入Preiss-Handler途径[22]。补救合成途径从NAM开始，然后经过NAMPT催化后，变成NMN，NMN同样通过NMNAT酶的催化转变成NAD，而后NAD在经过3个消耗途径NAD依赖的去乙酰化酶（Sirtuins）、多聚ADP核糖聚合酶（PARPs）、环腺苷二磷酸核糖（cADPR）合酶后变成烟酰胺完成循环[2]。NAD的含量在这3条途径下保持平衡，补救合成途径是人体NAD的主要来源，该过程中的NAMPT是这个循环的限制步骤[23]。
NMN作为NAD合成的重要中间产物，存在于多种类型的细胞中，并参与了不同的生物学过程。NMN可防止由NAD分解代谢酶而引起的NAD耗竭。目前报道的NMN大部分作用对人体都是有益的，但是随着研究的深入，NAD的增加也能够加重某些疾病的发展，如炎症和肿瘤[18, 24-25]。近期有研究表明，在克罗恩结肠炎和溃疡性结肠炎患者的结肠组织中，血浆Nampt和mRNA水平均显著升高[16]。更有研究表明，Nampt的特异性抑制剂FK866，改善了DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠症状，并抑制了小鼠中与炎症相关的肿瘤发生。由于Nampt是NMN的重要合成生物酶，因此,我们怀疑NMN可能也会加重DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠症状。基于此，我们首先检测了不同剂量的NMN对模型小鼠的生存曲线的影响，发现与对照组相比，NMN并不会显著改变模型小鼠的生存时间。而后我们发现不同给药方式也不能显著改变小鼠溃疡性结肠炎的状态。最后我们又检测不同浓度的NMN对于肠炎小鼠的影响，发现300 mg/kg 剂量以下的NMN，对于模型小鼠的体重、DAI评分、结肠组织均不能引起显著性改变。因此，NMN对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠并无影响。
综上，NMN具有广泛的人体生物调节作用，目前市面上出现了很多含有NMN的保健品。虽然我们的研究结果表明NMN对DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠无明显毒副作用，但是对于NMN的副作用仍需继续考察，特别是对于长期使用NMN的人群来说，充分考察其安全性尤为重要。
Effect of NMN on DSS induced ulcerative colitis in mice
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摘要:
目的 探究烟酰胺单核苷酸（NMN）对葡聚糖硫酸钠盐（DSS）诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型的作用。 方法 采用DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠模型评价NMN的作用。应用DSS对C57小鼠进行造模，给予NMN后观察模型小鼠的生存时间、体重、疾病评分（DAI）、结肠组织长度以及结肠组织切片病理学变化。 结果 NMN对模型小鼠的生存时间、体重、DAI、肠道形态学变化等无显著性改变。 结论 NMN对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠无显著作用。 Abstract:Objective To investigate the effects of Nicotinamide mononucleotide (NMN) on ulcerative colitis induced by dextran sulfate sodium (DSS) in mice. Methods DSS-induced ulcerative colitis mice were used to evaluate the effects of NMN. After NMN administration, the survival time, weight, disease activity index (DAI), colon tissue length and pathological changes of colon tissue slices were observed. Results NMN did not cause significant changes in the survival time, weight, DAI, and intestinal morphology of ulcerative colitis mice. Conclusion NMN has no significant effect on DSS-induced ulcerative colitis mice. -
Key words:
- nicotinamide mononucleotide /
- ulcerative colitis
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子宫内膜异位症（endometriosis，EM）是临床上最为常见的慢性妇科疾病之一，以慢性盆腔疼痛、月经紊乱和不孕为主要的临床表现。EM本质是血瘀证，临床治疗时以活血化瘀为主，常用的药物有桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行等，能够有效缓解患者痛经、非经期盆腔痛等症状[1]。
目前活血化瘀类中药对EM治疗的具体机制不是很清晰，其针对的靶点也不是很明了。网络药理学将生物网络作为研究对象，探究药物、靶点、疾病之间的联系，系统完整地研究药物的机制，可展现出药物对于多个靶点、多个通路不同影响。因为和中医整体观念天然契合，网络药理学现已广泛应用于中药研究中[2-3] 。在本研究中，笔者采用网络药理学的方法探究活血化瘀类中药治疗EM的作用机制，构建“化合物-靶标-通路-疾病”网络，并初步探析何种活血化瘀药在EM治疗中更具优势，为临床用药以及进一步实验研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 活血化瘀类中药确认
根据卫生部“十一五”规划教材《中药学》分类，确认桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行七味活血化瘀药为本次主要研究对象。
1.2 中药有效成分以及相关靶点的获取
利用中药化学成分数据库TCMSP平台（http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），检索七味中药所含活性成分。依据数据库指南要求，将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%以及类药性（drug-like，DL）≥0.18作为筛选条件，对活性成分进行筛选[4]。OB值是评价药物能否发挥药效的重要药动学参数，DL值是指化合物与所有已知药物之间的相似程度。上述2个参数是评价中药化学成分吸收、分布、代谢、排泄的关键参数。获得符合OB、DL参数有效活性成分后，利用TCMSP数据库查询各有效活性成分对应相关靶点。利用Venn图工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对药物化学成分以及相关靶点进行共同点分析，寻找活血化瘀中药共有成分和作用靶点。
1.3 EM相关靶点基因确认
利用美国国立生物技术信息中心Gene数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）将所获靶点信息转换成基因名称。查询GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，获得与EM相关基因靶点。最后将每种中药的作用靶点对应的Gene Symbol与EM基因进行比对，获得每种中药可能影响EM的相关基因，利用Cytoscape 3.6.0软件构建化合物－靶点网络[5]。
1.4 构建蛋白互作网络
为进一步研究靶点之间的相互关系，将活血化瘀药共同靶点上传至线上软件 STRING(http://string db.org)，构建蛋白互作网络。物种选择为Homosapiens，minimum required interaction score调整为highest confidence，隐藏网络图中游离节点，获取PPI网络。
1.5 KGEE通路分析
利用KEGG数据库（https://www.keg g.jp/）查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。筛选各中药KEGG通路中相关基因富集情况，并利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图。
2. 结果
2.1 活血化瘀类中药有效成分及对应靶点的获取
按照要求从TCMSP数据库中筛选出各中药有效成分，删除重复项，共有94种有效成分（supplementary materials table S1）。其中丹参有效活性成分达到65个，而泽兰有效活性成分只有2个。未能发现七味活血化瘀药共同有效成分，但β-谷固醇为川牛膝、红花、桃仁、泽兰所共有，槲皮素为川牛膝、红花、王不留行、益母草所共有，是涉及活血化瘀类中药最多的2种有效成分（supplementary materials table S2）。与此同时，我们找到了七味中药所共有的19个作用靶点（表1），包括孕酮受体（progesterone receptor）、前列腺素G/H合成酶1（prostaglandin G/H synthase 1）、前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2）、凋亡调节剂Bcl-2（apoptosis regulator Bcl-2）、核受体共激活剂（nuclear receptor coactivator 2）等。
表 1 七种活血化瘀中药共有的19个靶点序号 蛋白名称 基因名称 靶点标识码 1 钠通道蛋白5型亚基 SCN5A TAR00070 2 前列腺素G/H合成酶1 PTGS1 TAR00006 3 Beta-2型肾上腺素受体 ADRB2 TAR00261 4 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3 CHRM3 TAR00016 5 孕酮受体 PGR TAR00209 6 半胱天冬酶3 CASP3 TAR04087 7 热休克蛋白HSP 90 HSP90 TAR00444 8 钾电压门控通道亚家族H成员2 KCNH2 TAR00037 9 凋亡调节剂Bcl-2 BCL2 TAR00086 10 PKA催化亚基C-alpha PRKACA TAR00699 11 半胱天冬酶9 CASP9 TAR04090 12 γ-氨基丁酸受体亚基α-1 GABRA1 TAR00309 13 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1 CHRM1 TAR00038 14 前列腺素G/H合酶2 PTGS2 TAR00094 15 转录因子AP-1 JUN,FOS TAR00414 16 磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基，γ亚型 PIK3CG TAR00491 17 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2 CHRM2 TAR00210 18 核受体共激活剂2 NCOA2 TAR03276 19 维甲酸受体RXR-alpha RARA TAR00158 2.2 EM相关靶点确认
利用人类基因数据库查找EM作用靶点，与七味中药有效成分对应靶点进行比对，发现红花所含相关靶点数量最多，达到103个；而桃仁、泽兰所含相关靶点数量最少，为14个（图1A）；王不留行所含相关靶点占有效成分作用靶点比例最高，为54.7%；而桃仁最低，为29.8%（图1B）。经过去重处理后，七味中药所含EM相关靶点共119个（supplementary materials table S3）。利用Cytoscape3.6.0软件进行成分－靶点网络分析，获得图2，其中共计216个节点，其中黄色节点为活血化瘀药有效活性成分，而蓝色节点代表EM相关靶点。利用软件自带分析功能，对于网络各节点度值进行分析，网络中某些节点度值较高，提示该节点为网络中的关键节点（supplementary materials table S4）。在各中药所含有效成分中，槲皮素展现出极高的连接度（度值=87），远超其他有效成分，而其余较高连接度值依次是木犀草素（度值=43）、山柰酚（度值=33）、黄芩素（度值=23）、丹参酮A（度值=20）、花生四烯酸（度值=20）、β-谷固醇（度值=18）。中药是一个多有效成分的复杂系统，一个有效成分可作用于多个靶点，协同作用于某种疾病的治疗。而在靶点的分析中，较高连接度的靶点可能在EM的治疗作用中起着重要的作用。前列腺素G/H合酶2(PTGS2，度值=82）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1，度值=39）两者拥有最高的度值，是临床上炎性疾病治疗的主要靶点；核受体辅活化子2（NCOA2，度值=35）、核受体辅活化子1（NCOA1，度值=34)紧跟其后，同样在各炎症通路中作用显著；凝血酶(度值=31）是临床上治疗出血的重要靶点，直接作用于血液凝固过程的最后一环；Mu-type阿片受体（OPRM1，度值=30）则涉及到中枢镇痛功能。上述靶点均和EM症状及病机之间有着密切的关系。
图 1 七味活血化瘀中药EM相关靶点数量及所占比例A.基于OB≥30%和DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点个数；B.基于OB≥30%、DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点的比例2.3 PPI网络的构建与分析
利用STRING软件构建靶点PPI网络，图中包含119个节点，505条边，所有节点平均度值为8.49，具体见图3。根据“度值>均值”筛选出PPI网络中关键节点56个（supplementary materials table S6），前9位关键节点，平均度值为88，见表2，与PPI网络74%节点存在相互作用关系，提示它们在网络调控中起着关键作用，可能是活血化瘀药物治疗EM的关键所在。
表 2 PPI网络中关键节点节点名称 度值 节点名称 度值 节点名称 度值 ALB 97 IL6 92 PTGS2 83 AKT1 95 TNF 86 CASP3 80 VEGFA 94 MAPK8 83 MAPK1 80 2.4 KEGG通路分析
利用KEGG数据库查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。整理各中药KEGG通路相关基因富集情况，发现七味中药共有信号通路44条（supplementary materials table S5），筛选出与EM密切相关的19条通路（表3）。从表3中，不难发现，19条通路涉及性激素、炎症、细胞调亡以及血管生成等各个方面，其中炎症相关通路达到7条，为所有通路中最多。利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图，根据图4可知，在系列通路中，泽兰与桃仁作用均弱于其他五味中药。而在PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路中，多味中药靶点存在高度富集，红花在PI3K-Akt信号通路中显著富集，远超该药其他通路，值得注意。
表 3 七味活血化瘀中药的19条KEGG通路序号 标识码 信号通路名称 类别 1 hsa04151 PI3K-Akt信号通路 炎症相关 2 hsa04668 TNF信号通路 炎症相关 3 hsa04657 IL-17信号通路 炎症相关 4 hsa04625 C型凝集素受体信号通路 炎症相关 5 hsa04064 NF-κB信号通路 炎症相关 6 hsa04115 p53信号通路 炎症相关 7 hsa00590 花生四烯酸代谢 炎症相关 8 hsa01522 内分泌抵抗 激素相关 9 hsa04915 雌激素信号通路 激素相关 10 hsa04919 甲状腺激素信号通路 激素相关 11 hsa04921 催产素信号通路 激素相关 12 hsa04210 细胞凋亡 细胞凋亡 13 hsa04071 鞘脂信号通路 细胞凋亡 14 hsa01521 EGFR酪氨酸激酶抑制剂拮抗 血管相关 15 hsa04370 VEGF信号通路 血管相关 16 hsa01521 血小板活化 血管相关 17 hsa04722 神经营养蛋白信号通路 疼痛相关 18 hsa04725 胆碱能突触 疼痛相关 19 hsa04726 血清素能突触 疼痛相关 3. 讨论
本研究采用网络药理学的研究方法，从TCMSP数据库中提取出了94个符合标准的成分，通过VENE图去重以及分析网络图的拓扑特性后，发现槲皮素为四味活血化瘀药所共有，与83种EM相关靶点存在关联。现代研究表明，槲皮素具有抑制炎症、血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖的作用，通过抗氧化作用诱导细胞凋亡，还可通过雌激素受体，调控受体下游多种底物及信号通路而调节雌激素[6-7]。木犀草素与41种EM靶点相关联，具有抗炎、抗纤维化、抑制血管生成等作用[8]。EM发生发展过程中慢性炎症反应一直贯穿始终，且存在纤维化病变，木犀草素或在EM治疗中有一定作用[9-10]。
通过VENE图，发现七味中药共有作用靶点19个，部分共有靶点与Cytoscape网络图以及PPI网络中关键节点高度对应，进一步强调了该部分共有靶点在EM中的作用。如PTGS2，该靶点所调控环氧合酶（COX-2）的高表达会导致细胞的高增殖性、高侵袭性，诱导血管生成从而加重EM的疼痛和不孕症状[11]。NCOA2、NCOA1的水平异常与EM的进展关联密切。趋化因子参与子宫内膜异位种植过程中趋化、黏附、侵袭、血管形成及细胞生长分化等多个重要环节[12]。Xiu等发现，在分泌期，NCOA1和趋化因子CXCL12在异位子宫内膜中的表达明显高于正常子宫内膜；活化血小板对异位内膜具有促炎、促血管生成的作用，促使异位内膜细胞的侵袭和增殖[13-14]，子宫内膜基质细胞可分泌F2，以密集依赖的方式诱导血小板活化和聚集，从而影响EM的进展[15-16] 。VEGFA可促进新生血管形成并使血管通透性增加，陈晓莉等[17]研究表明，内异症组血清和腹腔液VEGF水平明显高于对照组，且重度患者腹腔液中VEGF水平高于轻度患者，VEGF在EMT患者血管生成中起促进性作用,在血清与腹腔液中的高表达与疾病发生发展相关。尉伟东等[18]发现CASP3蛋白在异位内膜和在位内膜中的评分明显低于正常对照组，caspase-3的水平下降提示内膜细胞活性下降，促使子宫内膜细胞自发性凋亡增加以及凋亡信号敏感性增强，诱导或加重EM。
利用KEGG数据库，找到了七味活血化瘀药共有EM相关通路19条，涉及性激素、炎症、细胞凋亡以及血管生成等方面。所有通路中，炎症通路达到36%。其中PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路是靶点富集最多的通路，提示活血化瘀药主要通过抗炎作用来对EM起治疗作用。与正常女性相比，EM患者的子宫内膜在位和异位内膜细胞的PI3K表达增加，AKT磷酸化水平升高，证实PI3K/AKT信号通路可影响EM进展[19]。EM是一种雌激素依赖性疾病，呈现出慢性炎症反应，多种炎性因子参与其病理过程，包括NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-17等[20]。许丽华等[21]通过实验发现，EM患者血清及腹腔液中TNF-α水平显著高于对照组。EM患者Ⅲ和Ⅳ期血清和腹腔液中TNF-α水平均高于Ⅰ和Ⅱ期，证实了TNF-α与子宫内膜异位症的发生发展密切相关,有助于子宫内膜异位症的诊断。IL-1家族在EM发生发展中作用显著，与正常女性相比，EM患者静脉血中IL-1β浓度显著增高。不仅仅是IL-1β，研究显示，IL-1β前体蛋白（proIL-1β）也可以加重炎症反应，EM患者腹腔液中IL-1β、proIL-1β水平均高于健康女性。IL-1家族细胞因子的损伤，导致EM患者腹腔免疫机制的紊乱，局部以及全身IL-1β、IL-18调控机制的缺陷，使得内膜组织的侵袭性以及生长性大幅增加，从而导致EM[22-24]。炎症相关通路的高富集也与之前网络图中TNF、IL-6等炎性相关靶点的高度值相对应，进一步强调了活血化瘀药物通过抗炎作用治疗EM的作用机制。细胞凋亡是一种独特的程序性细胞死亡，细胞的有效清除而不会引起炎症反应，EM特征为异位内膜细胞凋亡率下降。与健康女性子宫内膜相比，EM异位内膜抗凋亡因子表达增加，促凋亡因子表达减少，证实了细胞凋亡在EM的发病中确有作用，并和炎症反应存在一定关联[25]。EM发生发展过程中亦伴随着血管生成增多以及局部病灶周期性出血，EM患者异位内膜血管内皮生长因子(VEGF)表达量增高，抗血管生成因子(sFlt-1)表达量下降，证实VEGF信号通路、血小板激活通路均参与此过程，与前面靶点分析也形成呼应[26-27] 。脑源性神经营养因子是各种慢性疾病中慢性疼痛形成和维持的调节因子，EM伴有疼痛的患者血清和腹膜液中神经营养因子浓度明显高于无疼痛EM患者[28]。利用KEGG通路分析，可以发现活血化瘀药对于炎症、凋亡、疼痛、血管生成等相关通路均具备调控作用，进一步强调了临床上活血化瘀药对于EM的治疗价值。
综上所述，活血化瘀中药可通过多靶点、多通路协同作用方式对EM进行治疗，体现了中医药治疗疾病特色。上述七味中药中，桃仁、泽兰对于EM的作用低于其余活血化瘀药，而红花、益母草在EM治疗体系中，EM相关靶点高于其余中药，可能会起到更好的疗效，在临床上可尝试推广使用。本研究从网络药理学角度出发，根据活血化瘀中药有效成分和作用靶点，在一定程度上对活血化瘀中药治疗EM进行了机制的解析，为指导临床用药提供了一定的依据。但本研究仅仅基于TCMSP数据库，利用计算机软件从理论上对活血化瘀中药治疗EM作用机制做了探析，还需要通过实验和临床实践来进一步证实，而且还需要扩大活血化瘀药物探究范围，结合临床实际，深入剖析活血化瘀药共同点与差异之处。
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图 2 NMN对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠生存曲线的影响（每组n = 10）
蓝色曲线：空白对照组；红色曲线：300 mg/kg NMN组；绿色曲线：100 mg/kg NMN组
图 4 不同浓度的NMN对DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠的作用
A.体重变化曲线；B.DAI评分曲线；C.结肠长度测量代表图；D.结肠横切面免疫组化图（HE染色）；bar = 200 μm 黑色曲线：空白对照组（n = 20）；橘黄色曲线：3 mg/kg NMN组（n = 10）；紫色曲线：10 mg/kg NMN组（n = 10）；绿色曲线：30 mg/kg NMN组（n=10）；红色曲线：100 mg/kg NMN组（n = 10）；蓝色曲线：300 mg/kg NMN组（n = 20）
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