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市售复方酮康唑乳膏包含酮康唑、硫酸新霉素和丙酸氯倍他索，是治疗浅部真菌感染的常用药物。其中，酮康唑是最常用的抗真菌药物，具有价格低、抗菌谱广、抗真菌活性强等优势。但细菌对硫酸新霉素易产生耐药性，可导致患者反复感染，难以根治，且丙酸氯倍他索不适合12岁以下儿童使用，副作用较多，可产生红斑、灼热、瘙痒等刺激症状，长期大面积用药可导致高血糖等[1-5]。针对上述问题，为改善市售产品的有效性和安全性，本课题组将硫酸新霉素替换为抗菌作用更强的莫匹罗星，将丙酸氯倍他索替换为副作用较少的糠酸莫米松，再结合酮康唑，制备新型复方酮康唑软膏，以提高患者的用药依从性[6-8]。
本研究采用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松3种药效成分的含量，该方法目前未见有文献报道。本法简便，灵敏，分离度好，准确性高，可以为该制剂的质量标准研究提供依据。
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AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；TU-1901型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Starter 2C型实验室pH计（奥豪斯仪器有限公司）；KQ-800KDE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
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酮康唑对照品（批号：100294-201203，含量99.4%）、莫匹罗星对照品（批号：130568-200501，含量94.2%）、糠酸莫米松对照品（批号：100930-201201，含量99.9%）均购自中国食品药品检定研究院；酮康唑原料药（批号：20130405）、莫匹罗星原料药（批号：20130301）、糠酸莫米松原料药（批号：20130228）均购自武汉鑫佳公司；聚乙二醇400和聚乙二醇3350（中国医药对外贸易公司）。
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分别取酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松适量，精密称定，加流动相制备成适宜浓度的溶液，以相应的溶剂为空白溶液，在190～400 nm波长范围内进行紫外扫描，结果见图1。
图 1 莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的紫外图谱
由图1可见，莫匹罗星在220 nm处具有最大吸收波长，糠酸莫米松在248 nm处具有最大吸收波长，酮康唑在203 nm和245.5 nm具有最大吸收波长，三者在220 nm与248 nm之间均有吸收，因在供试品中酮康唑和莫匹罗星的浓度均是糠酸莫米松的20倍，糠酸莫米松在220 nm处响应值较小，为保证3种药物能同时测定，确定酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的检测波长为248 nm。
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色谱柱：Intersil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为甲醇-pH5.5磷酸盐缓冲液(65∶35)，柱温45 ℃，流速1.0 ml/min，检测波长248 nm，进样量10 µl。理论塔板数以各组分峰计，均不低于5000，各色谱峰的分离度良好。
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酮康唑对照品溶液：取酮康唑20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入适量65%甲醇，超声使其完全溶解，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，得到酮康唑的标准储备液，4 ℃低温避光保存。精密吸取酮康唑的标准储备液1 ml，置于10 ml量瓶中，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
莫匹罗星对照品溶液：取莫匹罗星20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入适量65%甲醇，超声使其完全溶解，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，得到莫匹罗星的标准储备液，4 ℃低温避光保存。精密吸取莫匹罗星的标准储备液1 ml，置于10 ml量瓶中，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
糠酸莫米松对照品溶液：取糠酸莫米松10 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，加入适量65%甲醇，超声使其完全溶解，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，得到糠酸莫米松的标准储备液，4 ℃低温避光保存。精密吸取糠酸莫米松的标准储备液1 ml，置于10 ml量瓶中，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
混合对照品溶液：取酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的标准储备液各1 ml，置10 ml量瓶中，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
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取复方酮康唑软膏0.5 g，精密称定，置于50 ml的容量瓶中，加65%甲醇适量，超声溶解，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
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取空白软膏基质0.5 g，精密称定，置于50 ml的容量瓶中，加65%甲醇适量，超声溶解，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得阴性对照溶液。
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取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液分别按照上述色谱条件进样，记录色谱图及相关参数。莫匹罗星的保留时间为5.075 min，理论塔板数为9196，对称因子0.81；糠酸莫米松的保留时间为18.413 min，理论塔板数为11859，对称因子0.88；酮康唑的保留时间为23.318 min，理论塔板数为12291，对称因子0.89，空白基质对莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的测定无干扰，方法专属性好。对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液色谱见图2。
图 2 复方酮康唑软膏的RP-HPLC色谱图
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分别精密吸取酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松标准储备液各0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2 ml，置10 ml量瓶中，用65%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液按上述色谱条件分别进样10 µl，记录色谱图峰面积。以峰面积A对浓度C (µg/ml)进行线性回归，结果见表1。
表 1 复方酮康唑软膏中主药的线性方程
药名 线性方程 r 线性范围（µg/ml） 莫匹罗星 A=2.295C+10.20 0.9995 40.0～400.0 糠酸莫米松 A=28.240C+1.871 0.9995 2.0～20.0 酮康唑 A=12.280C+27.94 0.9995 40.0～400.0 -
分别精密量取同一批复方酮康唑软膏6份，每份约0.5 g，按“2.3.2”项下操作，测定，计算酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松含量。结果见表2，结果表明该方法重复性良好。
表 2 复方酮康唑软膏中三种主药的重复性试验结果
药物 含量（µg/ml） 测得量（µg/ml） 平均含量（µg/ml） RSD（%） 莫匹罗星 200.00 203.60 204.30 1.51 200.00 204.90 200.00 201.70 200.00 208.80 200.00 206.40 200.00 200.40 糠酸莫米松 10.00 10.10 9.99 1.23 10.00 9.91 10.00 10.06 10.00 10.10 10.00 9.99 10.00 9.79 酮康唑 200.00 203.30 203.60 0.65 200.00 203.90 200.00 202.60 200.00 204.90 200.00 205.00 200.00 201.60 -
取供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样10 µl测定，计算不同时间点莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的含量，结果见表3。
表 3 复方酮康唑软膏中三种主药的稳定性试验结果
主药 时间（t/h） RSD
（%）0 2 4 6 8 12 24 莫匹罗星 100.00 99.94 100.00 99.94 99.81 99.12 98.49 0.68 糠酸莫米松 100.00 99.69 100.49 100.38 100.38 99.65 98.37 0.74 酮康唑 100.00 99.90 100.06 100.02 100.04 99.64 100.00 0.15 -
分别精密称取莫匹罗星8、10、12 mg，糠酸莫米松0.4、0.5、0.6 mg，酮康唑8、10、12 mg（相当于标示量的80%、100%、120%），精密称定，分别置于0.5 g的空白基质中，加适量流动相溶液，超声10 min使溶解，置于50 ml量瓶中，加流动相溶液稀释至刻度，摇匀，得低、中、高不同浓度的溶液，每个浓度各3份。用0.22 µm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液按上述色谱条件分别进样，记录色谱图峰面积。根据回归方程计算出相应浓度和含量，并计算回收率、平均回收率及RSD。结果见表4。
表 4 复方酮康唑软膏中三种主药回收率试验结果(n=3)
药名 加入量（µg/ml） 测得量（µg/ml） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD
（%）莫匹罗星 160.00 154.40 96.50 97.50 0.59 160.00 156.59 97.87 160.00 155.87 97.42 200.00 195.76 97.88 200.00 193.35 96.67 200.00 194.55 97.28 240.00 235.70 98.21 240.00 234.92 97.88 240.00 234.74 97.81 糠酸莫米松 8.00 7.73 96.62 97.99 0.79 8.00 7.84 98.00 8.00 7.83 97.91 10.00 9.88 98.80 10.00 9.71 97.10 10.00 9.78 97.80 12.00 11.88 99.00 12.00 11.85 98.75 12.00 11.75 97.92 酮康唑 160.00 153.63 96.02 97.62 0.74 160.00 156.39 97.74 160.00 155.84 97.40 200.00 195.72 97.86 200.00 194.06 97.03 200.00 195.44 97.72 240.00 236.46 98.52 240.00 235.60 98.17 240.00 235.38 98.08 -
取3批样品，依法测定，结果见表5。
表 5 3批次样品含量测定结果(n=3，%)
样品批号 酮康唑 莫匹罗星 糠酸莫米松 20190411 99.03 99.20 101.4 20190415 106.3 99.76 101.6 20190408 100.6 100.7 100.7 -
本研究根据软膏剂的特性，选择了提取效率较高，操作简便的超声提取法进行样品前处理，对溶剂种类、溶剂体积、提取时间进行考察，最终选择65%甲醇50 ml，超声提取10 min，该提取方法可有效的除去样品中的杂质，让测定的专属性更高。
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对于流动相的选择，本实验尝试以甲醇-0.6%醋酸铵溶液作为流动相[9-12]，结果基线非常不稳定，这可能是由于醋酸铵的紫外吸收所造成。以甲醇-水、乙腈-水，甲醇-磷酸二氢钠溶液和甲醇-乙腈-水等作为流动相[13-15]，使用磷酸二氢钠溶液分离效果及峰形较好，有机相甲醇的比例应控制在一定范围，甲醇低于50%则酮康唑峰保留时间过长；流动相的酸度对酮康唑（弱碱性）和莫匹罗星（弱酸性）[16]的峰形及保留时间亦有影响，用磷酸将磷酸二氢钠的pH值调节到4.5、5.0、5.5和6.0。结果表明，当流动相的pH值为5.5时，莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的三组峰值均具有较好的分离度，并且无前延和拖尾现象。对于检测波长的选择，酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松在220 nm与248 nm均有吸收，因在供试品中酮康唑和莫匹罗星的浓度均是糠酸莫米松的20倍，为了让这三种药物能同时测定，提高检测的灵敏度，确定最佳检测波长为248 nm。对于色谱柱的选择，本研究考察了岛津、安捷伦和沃特世等品牌的色谱柱，最终选择了岛津Intersil ODS-3柱，三种待测成分在该柱上分离度好，峰形佳，所以确定为最佳色谱柱。
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3个批次的复方酮康唑软膏均为实验室自制，从测定结果可以看出，不同批次的样品中酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的含量有一定波动，这提示我们在进行中试放大生产时，要充分考虑各因素的影响，保证制剂中主要成分的含量稳定，同时对软膏剂的长期稳定性也需要进行考察。
Determination of three constituents in compound ketoconazole ointment by RP-HPLC
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摘要:
目的 建立同时测定复方酮康唑软膏中酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松含量的方法。 方法 采用反相高效液相色谱法，色谱柱为Intersil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-pH5.5磷酸盐缓冲液（65∶35），柱温45 ℃，流速1.0 ml/min，检测波长248 nm。 结果 方法学验证表明，酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松3种成分线性关系良好（r≥0.9995），日内日间精密度均小于3.0%，回收率在90%～108%之间，稳定性和重复性的RSD均小于3.0%，符合方法学要求。按照新建立的方法测定了3个批次样品中三组分的含量，结果符合要求。 结论 该方法简便可靠，可为复方酮康唑软膏的质量控制提供依据，也为其质量标准研究奠定了基础。 Abstract:Objective To establish a RP-HPLC method for determination of ketoconazole, mupirocin and mometasone furoate in compound ketoconazole ointment. Methods RP-HPLC was conducted on a Intersil ODS-3 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), with methanol-PBS with pH 5.5 (65:35) as the mobile phase and the column temperature was 45 ℃. The flow rate was 1.0 ml/min, and the detection wavelength was 248 nm. Results The methodological verification showed that ketoconazole, mupirocin and mometasone furoate had a good linearity (r≥0.9995). The inter/intra-day precisions were less than 3.0%, The recovery rates were between 90% and 108%. The stability and repeatability of RSD were also less than 3.0%, which met the requirements of method validation. The contents of the three components in three batches were determined by the new method. Conclusion The method is simple and reliable. It can provide a basis for the quality control of compound ketoconazole ointment and lay a foundation for its quality standard research. -
Key words:
- RP-HPLC /
- ketoconazole /
- mupirocin /
- mometasone furoate
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近年来，随着肿瘤、器官移植和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等导致的免疫功能低下人群的增加，侵袭性真菌感染（IFIs）的发病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隐球菌和曲霉菌是IFIs最主要的致病菌，并且造成的病死率超过90%[3]。在念珠菌属中，白念珠菌（Candida. albicans）是院内血液感染最常见的致病菌原体，其在重症监护病房（ICU）患者中致病率超过17%，病死率高达40%[4-5]。临床上治疗IFIs的抗真菌药物主要包括：多烯类（两性霉素B）、核酸类（5-氟胞嘧啶）、唑类（氟康唑）和棘白菌素类（卡泊芬净）药物（图1）[6-7]。然而，由于临床上出现抗真菌药物严重的耐药性和毒副作用，IFIs的治疗效果相当有限。因此，迫切需要研发全新机制的抗真菌药物。
组蛋白乙酰化修饰（包括组蛋白乙酰化和去乙酰化）是表观遗传学研究的重要组成部分。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）将组蛋白和其他蛋白上的赖氨酸末端乙酰基去除，对染色体重塑和基因的表达起着重要作用[8-9]。目前HDAC抑制剂主要集中于抗肿瘤研究方向，且已有多个上市药物应用于肿瘤的治疗。据研究报道，真菌中的HDACs，如烟曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、酿酒酵母[13]和新生隐球菌的HDACs[14-15]参与了毒力相关的过程和形态变化。因此，抑制真菌HDACs可能是治疗IFIs的有效策略。
联合药物治疗是提高临床一线药物疗效并克服真菌耐药性的有效策略之一。真菌的耐药性涉及转录调节，其中染色体重塑和组蛋白修饰起主要作用。HDACs调节的组蛋白修饰在应激信号通路中起着至关重要的作用，这可能与真菌对各种环境（包括药物）的应激反应有关[16]。此外，已有研究报道，HDAC抑制剂与唑类药物联用具有协同增效作用[17-18]。例如，HDAC抑制剂MGCD290与氟康唑联用具有协同抗多种临床真菌分离株的作用[19]。
基于此，本研究首先对8个市售的HDAC抑制剂（图2）进行体外协同抗真菌活性测试，筛选结果显示化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有优秀的体外协同抗耐药白念珠菌活性。后续考察其与不同唑类药物联用时对不同念珠菌属的体外协同抗真菌活性，以及对正常细胞的毒性作用，以期为抗真菌药物的研发提供依据。
1. 材料和方法
1.1 实验试剂与菌株
临床分离的6株唑类耐药白念珠菌（编号：9893，10061，10060，9173，4108和0304103），2株唑类耐药热带念珠菌（编号：5008，10086），1株光滑念珠菌（编号：9073）和1株耳道念珠菌（编号：0029）由海军军医大学附属长征医院提供。菌株活化首先从−80 ℃中挑取菌株冻存液至YEPD液体培养基活化24 h,然后取10 μl菌悬液至1 ml YEPD中，并在30 ℃、200 r/min下培养16 h后待用。HUVEC细胞来源于中国科学院上海细胞库，并在新鲜配置的DMEM完全培养基中培养。
YEPD液体培养基：取10 g酵母浸膏、20 g葡萄糖、20 g蛋白胨溶解于1 000 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，保存于4 ℃条件下备用。RPMI 1640培养基：取10 g RPMI 1640（Gibco）粉末、34.5 g吗啡啉丙磺酸、2 g NaHCO3、2.7 g NaOH溶解于1 000 ml三蒸水中，经0.22 μm的微孔滤膜过滤与灭菌后，置于4 ℃条件下保存和备用。DMEM完全培养基：按照89% DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1%的双抗比例混匀制得，混匀后置于4 ℃条件下保存和备用。PBS缓冲液：10 × PBS 100 ml溶解于900 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，置于4 ℃条件下保存和备用。
1.2 仪器
THZ-92A气浴恒温振荡器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、MJ-150-I霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、LW100T生物显微镜（北京测维光电技术有限公司）、HDC-15K高速离心机（上海泰坦科技股份有限公司）、C170二氧化碳培养箱（BINDER GmbH）、infinite M200多功能酶标仪（Tecan Austria GmbH）、高压蒸汽灭菌锅、无菌洁净工作台。
1.3 棋盘式微量液基稀释法
本实验参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）公布的M27-A3方案中微量液基稀释法进行。首先，收集活化好的真菌细胞，PBS洗3次后用RPMI 1640培养基制成浓度为1×103 CFU/ml的菌悬液。按照每孔100 μl接种菌悬液至无菌96孔板中，1～9列加入倍半稀释的HDAC抑制剂，A～F行加入倍半稀释的氟康唑，其中G行只加氟康唑，第10列只加化合物，第11列为不加药的阴性对照组，后将96孔板置于35 °C条件下孵育48 h。测定每孔在630 nm处的吸光度A，依据公式：抑制率（%）=（A阳性对照孔−A化合物孔）/（A阳性对照孔−A阴性对照孔）× 100%，计算各孔对应的抑制率。如果某一孔和其左边孔对应的抑制率均大于80%，则该孔对应的化合物和FLC浓度分别作为FIC化合物和FIC氟康唑，利用协同指数公式：FICI =（FIC化合物./MIC80 化合物）+（FIC氟康唑/MIC80 氟康唑），计算各化合物对应的FICI。
1.4 时间-生长曲线实验
收集活化好的白念珠菌0304103稀释在RPMI 1640培养液中，保持菌浓度为1×105 CFU/ml。取5 ml稀释的菌悬液和不同浓度的待测药物加入50 ml的离心管中, DMSO组作为空白对照组和32 μg/ml FLC作为阳性对照。随后将50 ml的离心管置于30 °C条件下振荡培养（200 r/min），在多个时间点吸取不同药物组的真菌混悬液（100 μl）于96孔板上，测量A630值并使用GraphPad Prism 7作图。
1.5 真菌细胞总HDAC酶活性测试实验
收集指数生长期的白念珠菌0304103细胞（湿重为100 mg），然后用3 mg snailase、12 μl 2-巯基乙醇和3 ml snailase反应缓冲液等新鲜配置的真菌裂解液来处理它们，以制备真菌原生质体。真菌原生质体分散在PBS（20 ml）中以获得混悬液，然后往96孔板每孔中加入100 μl的混悬液和不同浓度的化合物Rocilinostat，并在35 °C下培育12 h。接着往每个孔中加入30 μmol/L的HDAC底物，于37°C下孵育6 h。随后添加100 μl HDAC酶促终止溶液并在37°C下孵育2 h。最后，在每个孔中取出100 μl培养物添加到黑板中，用Ex=360 nm，Em=460 nm来监测荧光强度并记录下来用于计算HDAC酶的抑制率。
2. 结果
2.1 化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有协同抗真菌活性
表1列出了HDAC抑制剂单独使用或与氟康唑联合使用的体外抗真菌活性筛选结果。MIC80为抑制80%真菌细胞生长的最低药物浓度。实验结果表明，8个HDAC抑制剂单独使用对耐药白念珠菌均无直接的抗真菌活性（MIC80>64 μg/ml）；而化合物Rocilinostat（FICI=0.039）和伏立诺他（FICI=0.125）与FLC联用时均表现出良好的协同抗真菌活性。其中，化合物Rocilinostat的协同活性最佳，值得进一步研究。
表 1 单用HDAC抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103的体外抗真菌活性(μg/ml)抑制剂 抑制剂 氟康唑 FICI 单用 联用 单用 联用 伏立诺他 >64 4 >64 4 0.125 Rocilinostat >64 2 >64 0.5 0.039 T3516 >64 64 >64 64 2 T6016 >64 64 >64 64 2 T6421 >64 32 >64 32 1 T2157 >64 32 >64 32 1 T1726 >64 64 >64 64 2 T3358 >64 32 >64 64 1.5 注: FICI值≤ 0.5表示协同，FICI值> 4表示拮抗；0.5<FICI<4表示不相关。 2.2 Rocilinostat与氟康唑或伏立康唑联用对多种白念珠菌的抗真菌活性
为进一步考察Rocilinostat是否具广谱的抗真菌作用，挑选9株临床分离的念珠菌属菌株进行协同抗真菌活性测试。如表2所示，Rocilinostat与FLC联合使用时，对两株耐FLC的白念珠菌（C. albicans 9173，FICI=0.094; C. albicans 4108, FICI=0.5）和对FLC敏感的光滑念珠菌（C. glabrata 9073）表现出协同增效作用，而对热带念珠菌（C. tropicis）和耳道念珠菌（C. auris）没有协同抗真菌活性。当Rocilinostat与伏立康唑（VRC）联用时，对耐VRC的白念珠菌（C. albicans 10060, FICI=0.033）表现出优异的协同抗真菌活性 (表3)。
表 2 Rocilinostat与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 氟康唑 Rocilinostat 氟康唑 9893 >64 >64 64 64 2 10061 >64 >64 64 64 2 10060 >64 >64 64 64 2 9173 >64 >64 4 2 0.094 4108 >64 >64 32 32 0.5 10186 >64 >64 64 64 2 5008 >64 >64 64 8 1.125 9073 32 4 32 8 0.375 0029 64 32 >64 32 1 表 3 Rocilinostat与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 伏立康唑 Rocilinostat 伏立康唑 0304103 >64 >64 32 2 0.531 10061 >64 >64 32 0.125 0.502 10060 >64 >64 2 0.125 0.033 2.3 Rocilinostat与氟康唑联用有效抑制真菌的生长
为进一步考察化合物Rocilinostat的协同抗真菌活性，我们又开展了时间-生长曲线实验。从图3结果可以看出，高浓度的氟康唑或Rocilinostat单独使用对真菌生长无抑制作用，而Rocilinostat与不同浓度的氟康唑联用能够有效抑制真菌的生长，且呈浓度依赖趋势 (图3中抑制剂为Rocilinostat)。
2.4 Rocilinostat对真菌细胞的选择性作用
采用HUVEC（人脐静脉内皮细胞）对化合物Rocilinostat进行细胞毒性的评价。结果如表4显示，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，IC50值为52.17 μmol/L (22.60 μg/ml)，相当于其发挥协同抗耐药真菌（C. albicans 0304103）活性MIC80值的44倍，表明Rocilinostat对真菌细胞具有较强的选择性作用。此外，我们还测试了化合物Rocilinostat对真菌总HDAC酶的抑制活性，结果表明，Rocilinostat对真菌HDAC酶抑制活性（IC50=0.41 μmol/L）优于泛HDAC抑制剂伏立诺他（IC50=1.03 μmol/L）。
表 4 Rocilinostat对正常细胞的毒性和真菌总HDAC酶活性IC50 (μmol/L)化合物 HUVEC 白念珠菌（总HDAC酶） Rocilinostat 52.17 0.41 伏立诺他 — 1.03 注: “—”表示没有测试。 3. 讨论
本研究从市售的8个HDAC抑制剂中筛选出协同活性最佳的化合物Rocilinostat。进一步研究发现Rocilinostat与氟康唑联用对白念珠菌和光滑念珠菌具有协同增效作用。此外，化合物Rocilinostat与伏立康唑联用对临床分离的耐药白念珠菌株同样具有优秀的抗真菌活性。更值得关注的是，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，其对真菌细胞具有很好的选择性。因此，HDAC抑制剂Rocilinostat可以作为一种低毒、有效的唑类抗真菌药物增效剂，为抗真菌药物的发展提供了新的研究基础。
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图 2 复方酮康唑软膏的RP-HPLC色谱图
A.莫匹罗星对照品溶液；B.糠酸莫米松对照品溶液；C.酮康唑对照品溶液；D.混合对照品溶液；E.供试品溶液；F.阴性溶液 1.莫匹罗星；2.糠酸莫米松；3.酮康唑
表 1 复方酮康唑软膏中主药的线性方程
药名 线性方程 r 线性范围（µg/ml） 莫匹罗星 A=2.295C+10.20 0.9995 40.0～400.0 糠酸莫米松 A=28.240C+1.871 0.9995 2.0～20.0 酮康唑 A=12.280C+27.94 0.9995 40.0～400.0 
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表 2 复方酮康唑软膏中三种主药的重复性试验结果
药物 含量（µg/ml） 测得量（µg/ml） 平均含量（µg/ml） RSD（%） 莫匹罗星 200.00 203.60 204.30 1.51 200.00 204.90 200.00 201.70 200.00 208.80 200.00 206.40 200.00 200.40 糠酸莫米松 10.00 10.10 9.99 1.23 10.00 9.91 10.00 10.06 10.00 10.10 10.00 9.99 10.00 9.79 酮康唑 200.00 203.30 203.60 0.65 200.00 203.90 200.00 202.60 200.00 204.90 200.00 205.00 200.00 201.60
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表 3 复方酮康唑软膏中三种主药的稳定性试验结果
主药 时间（t/h） RSD
（%）0 2 4 6 8 12 24 莫匹罗星 100.00 99.94 100.00 99.94 99.81 99.12 98.49 0.68 糠酸莫米松 100.00 99.69 100.49 100.38 100.38 99.65 98.37 0.74 酮康唑 100.00 99.90 100.06 100.02 100.04 99.64 100.00 0.15
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表 4 复方酮康唑软膏中三种主药回收率试验结果(n=3)
药名 加入量（µg/ml） 测得量（µg/ml） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD
（%）莫匹罗星 160.00 154.40 96.50 97.50 0.59 160.00 156.59 97.87 160.00 155.87 97.42 200.00 195.76 97.88 200.00 193.35 96.67 200.00 194.55 97.28 240.00 235.70 98.21 240.00 234.92 97.88 240.00 234.74 97.81 糠酸莫米松 8.00 7.73 96.62 97.99 0.79 8.00 7.84 98.00 8.00 7.83 97.91 10.00 9.88 98.80 10.00 9.71 97.10 10.00 9.78 97.80 12.00 11.88 99.00 12.00 11.85 98.75 12.00 11.75 97.92 酮康唑 160.00 153.63 96.02 97.62 0.74 160.00 156.39 97.74 160.00 155.84 97.40 200.00 195.72 97.86 200.00 194.06 97.03 200.00 195.44 97.72 240.00 236.46 98.52 240.00 235.60 98.17 240.00 235.38 98.08
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表 5 3批次样品含量测定结果(n=3，%)
样品批号 酮康唑 莫匹罗星 糠酸莫米松 20190411 99.03 99.20 101.4 20190415 106.3 99.76 101.6 20190408 100.6 100.7 100.7
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