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2019年12月，武汉市出现多例不明原因的病毒性肺炎病例，病例临床表现主要为发热、咳嗽，少数病人腹泻、呕吐、呼吸困难，胸片呈双肺浸润性病灶[1]。2020年2月11日，世界卫生组织将该病命名为新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），并称引起该病的病毒为SARS-CoV-2，与成年人相比，儿童更不易感染该病毒，65岁以上老年人更易受感染[2]。目前全球疫情愈演愈烈，国内用了两个多月控制住疫情，中医药做出了巨大贡献，但部分地区输入性病例和无症状感染者不断增加，寻找相应的群体性配方，是当前一项十分紧迫的研究任务。据古文献记载，加上黄煌教授临床经验和近期的个案报道，建议可以采用两首古代相传的治疗时令病的经验成方——荆防败毒散和十神汤，作为群体性预防用方[3]。
荆防败毒散，出自《摄生众妙方》，由荆芥、防风、羌活、独活、柴胡、前胡、川芎、枳壳、茯苓、桔梗、甘草等十一味中药组成，已上市的中成药包括荆防颗粒、荆防合剂。临床研究表明，荆防败毒散能缓解发热、咳嗽、喘息与肺部啰音等作用，调节机体炎症因子和细胞免疫状况，增强机体的免疫功能[4-6]。现代药理学研究证明其具有解热、镇痛和抗炎的作用[7]。
本文通过网络药理学筛选出荆防败毒散作用靶点，并进行聚类分析，预测荆防败毒散中核心活性成分，进而运用分析软件对药材-成分-靶点进行分子对接及信号通路分析，并预测其治疗COVID-19的作用机制，为荆防败毒散用于预防及治疗COVID-19的可能性提供理论参考。
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借助中药系统药理分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[8]，分别以荆芥、防风、羌活、独活、柴胡、前胡、川芎、枳壳、茯苓、桔梗、甘草为关键词搜索荆防败毒散中的成分。本研究结合口服生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18），筛选收集到的化学成分，并结合《中国药典》2015年版中药物的含量测定项对已筛选的成分进行补充，最终建立荆防败毒散的成分库。
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经OB和DL筛选合格的成分，在TCMSP数据库对其成分靶点进行收录。对未在TCMSP中收录靶点的成分，在PubChem查询成分对应的Canonical SMILES序列，并利用此序列在SwissTarget数据库[9]（http://www.swisstargetprediction.ch/）中对该成分的靶点进行预测，收集预测结果中的靶标蛋白基因名称。最后对收集的所有靶点在Unitprot数据库[10]（http://www.Unitprot.org/）输入蛋白名称并限定来源为Homo sapiens，获取官方基因名作为荆防败毒散的靶点库。通过Cytoscape 3.6.1软件，构建荆防败毒散药材-成分-靶点网络，分析成分和靶点网络。
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在CTD、NCBI和GeneCards数据库中，以“COVID-19”、“novel coronavirus pneumonia”等检索词检索，检索时间为2020年7月13日。将检索结果合并、去重，获取新冠肺炎疾病相关基因，并把相关基因编码的蛋白质作为药物治疗的潜在作用靶点。
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将荆防败毒散成分的靶点与COVID-19靶点分别导入String数据库，获取荆防败毒散成分靶点和COVID-19靶点的蛋白-蛋白相互作用（PPI）关系，通过Cytoscape软件Merge功能，取两者交集，挖掘关键靶点网络。
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为了进一步了解上述筛选出的靶标蛋白基因的功能及在信号通路中的作用，将筛选得到的作用靶点导入Metascape数据库[11]（https://metascape.org/），通过输入靶基因名称列表并限定物种为人，进行GO（gene ontology）生物过程（BP，Biological Process）、细胞组成（CC，cellular component）、分子功能（MF，molecular function）富集分析和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信号通路富集分析，并利用R 4.0.0软件将其结果可视化。
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从ZINC数据库[12]（http://zinc.docking.org/）下载Degree值前10成分的mol2格式文件，用Autodock Tool软件打开该成分，使其能量最小化并判定成分的Root、选定可扭转的键，保存为*pdbqt格式文件。从PDB数据库[13]（https://www.rcsb.org/）下载SARS-CoV-2 3CL水解酶（Mpro，PDB ID: 6LU7）和血管紧张素转化酶II（ACE2，PDB ID: 1R42）的3D结构PDB格式文件[14-15]，运用Pymol软件移除靶蛋白中的配体和非蛋白分子（如水分子），再保存为PDB格式文件。随后用Autodock Tool软件打开的PDB文件，加氢、计算电荷并给蛋白添加原子类型（Assign AD4 type），将其保存为*pdbqt格式文件[16]。
运用Autodock Vina将成分和受体对接。结合能小于0说明配体与受体可以自发结合，目前对于活性分子的靶点筛选尚无统一标准，本文根据结合能进行排序，结合能数值的绝对值越大，对接结果较好，该成分可视为荆防败毒散预防COVID-19的潜在活性成分。
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从TCMSP数据库中搜索荆防败毒散各味药的成分，并依据OB≥30%及DL≥0.18要求，得到最终选定的结果为187个不同的成分（28个无已知靶点），其中荆芥11个、防风18个、羌活15个、独活9个、柴胡17个、前胡24个、川芎7个、枳壳5个、茯苓15个、桔梗7个、甘草92个。筛选后的荆防败毒散中部分活性成分的基本信息见表1。
表 1 荆防败毒散中部分活性成分的基本信息
成分名称 MOL ID MW OB (%) DL 药味归属 β谷甾醇 MOL000358 414.79 36.91 0.75 荆芥、防风、羌活、前胡、独活、枳壳 谷甾醇 MOL000359 414.79 36.91 0.75 荆芥、防风、羌活、前胡、川芎、甘草 槲皮素 MOL000098 302.25 46.43 0.28 荆芥、柴胡、前胡、甘草 异欧前胡素 MOL001942 270.30 45.46 0.23 防风、前胡、羌活、独活 欧前胡素 MOL001941 270.30 34.55 0.22 防风、前胡、羌活、独活 紫花前胡苷 MOL004792 408.44 57.12 0.69 羌活、独活、前胡 柚皮素 MOL004328 272.27 59.29 0.21 枳壳、甘草 异鼠李素 MOL000354 316.28 49.60 0.31 柴胡、甘草 豆甾醇 MOL000449 412.77 43.83 0.76 荆芥、柴胡 亚油酸乙酯 MOL001494 308.56 42.00 0.19 防风、川芎 山奈酚 MOL000422 286.25 41.88 0.24 柴胡、甘草 紫花前胡素 MOL013077 328.39 39.27 0.38 防风、前胡 木犀草素 MOL000006 286.25 36.16 0.25 荆芥、桔梗 甘草酚 MOL002311 366.39 90.78 0.67 甘草 宽叶甘松酸 MOL013098 328.39 87.48 0.37 前胡 Divaricate acid MOL011737 320.32 87.00 0.32 防风 甘草吡喃
香豆素MOL004904 384.41 80.36 0.65 甘草 shinpterocarpin MOL004891 322.38 80.30 0.73 甘草 芒柄花黄素 MOL000392 268.28 69.67 0.21 甘草 xambioona MOL005018 388.49 54.85 0.87 甘草 丹参酮IIA MOL007154 294.37 49.89 0.40 前胡 异甘草酚 MOL004948 366.39 44.70 0.84 甘草 去氢齿孔酸 MOL000300 453.75 44.17 0.83 茯苓 7-甲氧基-2-甲基异黄酮 MOL003896 266.31 42.56 0.20 甘草 美迪紫檀素-3-O-葡萄糖苷 MOL004924 432.46 40.99 0.95 甘草 过氧化麦角
甾醇MOL000283 430.74 40.36 0.81 茯苓 去氢茯苓酸 MOL000276 526.83 35.11 0.81 茯苓 茯苓酸 MOL000289 528.85 33.63 0.81 茯苓 kanzonol F MOL004988 420.54 32.47 0.89 甘草 汉黄芩素 MOL000173 284.28 30.68 0.23 防风 -
利用Cytoscape软件进行“荆防败毒散药材-成分-靶点”网络的构建，网络共包括447个节点（11种药材节点、159个成分节点、277个靶点节点）和2718条边，如图1所示，其中形状“△”代表药材，“〇”代表成分，“◇”代表基因，每条边则表示药材中所含成分及成分与靶点相互作用关系。性状的大小代表Degree值的大小。按照Degree值，排名前10位的成分分别是槲皮素、山奈酚、木樨草素、汉黄芩素、β-谷甾醇、7-甲氧基-2甲基异黄酮、丹参酮IIA、柚皮素、芒柄花黄素、异鼠李素。
图 1 荆防败毒散药材-成分-靶点网络
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在数据库中检索并筛选得到COVID-19相关的273个靶点，将273个疾病靶点和277个荆防败毒散活性成分的作用靶点导入String数据库，得到靶点PPI关系，利用Cytoscape软件将两者进行Merge取交集处理，得到包含55个靶点和766条边的Hub网络，见图2。按照Degree值从高到低，Hub网络中排名前10位的靶点分别为MAPK3、TNF、IL6、CASP3、TP53、MAPK8、MAPK1、IL10、CCL2、MAPK14。
图 2 荆防败毒散干预COVID-19的Hub网络
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通过Metascape数据库进行的GO功能富集分析得到GO条目1376个（P<0.01），其中BP条目1304个，包括细胞因子和凋亡信号、刺激反应、多生物过程、免疫过程、细胞代谢、生物进程调控等；CC条目19个，包括细胞膜、细胞器膜、基质、转录因子等；MF条目53个，包括酶活性和酶结合、细胞因子活性和结合能力、转录因子结合、蛋白特异性结合等各类别分析中排名前20位的条目，见图3。
图 3 荆防败毒散成分作用靶点GO功能分析
KEGG通路富集分析筛选得到136条（P<0.01）通路，涉及与寄生虫、真菌、病毒感染引起的疾病通路有22条（如朊病毒、甲型流感、人类嗜T淋巴细胞病毒I型感染、丙肝、肺结核、疟疾、百日咳等）、癌症相关的通路17条（如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、癌症中碳代谢、转录失调等）、细胞进程、免疫系统进程、信号通路等。选Count值较大的前20条通路进行可视化，结果见图4。
图 4 荆防败毒散核心靶点KEGG富集分析的前20条通路气泡图
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将荆防败毒散中排序前10的核心成分分别与Mpro、ACE2受体进行分子对接。一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大，结合能≤–5.0 kJ/mol作为筛选标准，结合能≤–20.93 kJ/mol时则视为成分与靶点有较好的活性，结合能≤–29.336 kJ/mol时则结合活性强烈[17]。分子对接结果显示，筛选出的荆防败毒散核心成分与Mpro结合能远小于–20.93 kJ/mol，与ACE2受体结合能远小于–29.336 kJ/mol（见表2）。选择结合能均小于–29.336 kJ/mol的β-谷甾醇、丹参酮IIA、芒柄花黄素，对其与Mpro、ACE2的结合形式进行分析，丹参酮IIA可与Mpro的110位谷氨酰胺（GLN）和ACE2的158位络氨酸（TYR）形成氢键（键长20 nm和22 nm）；芒柄花黄素可与Mpro的131位精氨酸（ARG）和287位亮氨酸（LEU）分别形成氢键（键长27 nm和19 nm），与ACE2的615位天冬氨酸（ASP）形成氢键（键长22 nm）。氢键、疏水作用可能是荆防败毒散成分与两个受体主要的结合形式，结果见图5。分子对接结果表明荆防败毒散中活性成分与Mpro、ACE2结合活性较强，与后者的结合能力优于前者。
表 2 荆防败毒散中核心成分与Mpro、ACE2的结合能
成分 CAS号 化学式 结合能(kJ/mol) Mpro ACE2 槲皮素 117-39-5 C15H10O7 −27.21 −34.33 山奈酚 520-18-3 C15H10O6 −27.21 −32.66 木樨草素 491-70-3 C15H10O6 −28.89 −34.33 汉黄芩素 10-29-7 C16H12O5 −27.21 −33.91 7-甲氧基-2-甲基异黄酮 19725-44-1 C17H14O3 −25.96 −32.24 β-谷甾醇 83-46-5 C29H50O −31.40 −36.84 丹参酮IIA 568-72-9 C19H18O3 −30.14 −36.43 异鼠李素 480-19-3 C16H12O7 −27.21 −33.49 芒柄花黄素 485-72-3 C16H12O4 −29.73 −30.14 柚皮素 153-18-4 C15H12O5 −28.47 −33.49 
图 5 β-谷甾醇、丹参酮ⅡA、芒柄花黄素与Mpro和ACE2的分子对接图
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突如其来的疫情给人类带来巨大挑战，人类必须努力了解疾病特点，尽快寻找到控制措施[18]。荆防败毒散，由人参败毒散去人参加荆芥、防风而成。以荆芥、防风，羌活、独活发汗解表，开泄皮毛，使风寒之邪随汗而解，为通治一身风寒湿邪的常用组合。柴胡、枳壳、桔梗调畅气机，川芎行血合营，羌活、茯苓化痰渗湿，三组合用，意在解表祛邪与疏通气血津液。甘草调和药性，祛风散寒之力较强，宜于外感风寒湿邪较重者。荆防败毒散治退热效果极佳，用于流行性感冒见效快[19-20]。新冠肺炎疫情属于寒湿疫。因此，基于辨证论治的原则，荆防败毒散可作为群体性预防用药的选择，并对初期轻症（寒湿证）的新冠肺炎有一定治疗效果。
根据KEGG分析，得到136条通路，包括感染性疾病通路、癌症通路、细胞进程通路、免疫系统通路、信号通路等。KEGG前20条通路中，频率最高的靶点为RELA、MAPK1、MAPK3、TNF、IL6。RELA在调节对感染的免疫应答中起关键作用，而且其磷酸化调节作用可抑制肿瘤的发生[21]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。TNF在抗肿瘤、抗感染、免疫、炎症等多种生理病理过程中发挥着关键的作用[22]。结果表明荆防败毒散呈现出中药多成分-多靶点-多途径协同作用的特点，通过对上述靶点的作用，调节感染类疾病通路、免疫损伤性、炎症通路，起到防治COVID-19的作用。
ACE2是SARS-CoV和SARS-CoV-2的宿主细胞受体，SARS-CoV-2 通过表达的S-蛋白与人体ACE2结合，导致病毒入侵而致病，这可作为治疗COVID-19的突破口[23-24]。Mpro是单正链RNA病毒前体多聚蛋白水解酶核心部分，将宿主细胞内的病毒RNA翻译成蛋白以产生子代毒，在RNA复制、逆转录过程中具有重要的作用[25-26]，抑制Mpro活性将能阻止病毒的感染和复制。通过分子对接，这10个成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶的结合能远小于−20.93 kJ/mol，与ACE2受体的结合能远小于−29.336 kJ/mol，与二者结合最好的成分均为β-谷甾醇和丹参酮IIA，结合形式包括氢键、疏水作用。此外，槲皮素、山柰酚、异鼠李素也具有较强的结合能力[27-28]。表明荆防败毒散核心成分与COVID-19相关蛋白有较强的结合能力。
基于上述研究，荆防败毒散对肺部疾病有一定的保护治疗作用，能提高机体免疫力，对COVID-19具有潜在的防治作用，可作为群体性预防用药以及发病初期的治疗。鉴于网络药理学和分子对接的局限性，荆防败毒散防治COVID-19的效果有待临床进一步验证。
Study on active ingredients of Jingfang Baidu San for preventing COVID-19 based on network pharmacology and molecular docking
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摘要:
目的 运用网络药理学和分子对接方法，预测荆防败毒散预防新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的活性成分，为临床用药提供参考。 方法 通过中药系统药理学分析平台，检索荆防败毒散组方中所有药材的化学成分和作用靶点。通过Uniprot数据库校正靶点对应的基因，利用Cytoscape软件构建药材-成分-靶点网络并进行可视化处理，利用疾病数据库检索COVID-19相关的靶点，筛选出重合的靶点，通过String数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络。通过Metascape进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，预测其作用机制，通过分子对接，计算核心成分在预防新型冠状病毒肺炎的作用强度。 结果 限定筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，共得到荆防败毒散的159个活性成分和277个靶点，与获得的273个COVID-19相关的靶点取交集，得到55个核心靶点；对核心靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，得到GO条目1376个和136条信号通路，涉及感染性疾病、癌症、细胞进程、免疫系统、信号等通路。分子对接结果显示荆防败毒散核心成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶、血管紧张素转化酶II（ACE2）具有较强的结合能力，结合形式有氢键、疏水作用。 结论 荆防败毒散中的活性成分能通过抑制新型冠状病毒（SARS-CoV-2）蛋白，ACE2结合，通过对多靶点、多通路的作用发挥对COVID-19的防治作用。 Abstract:Objective To investigate the active ingredients of Jingfang Baidu San for the prevention and treatment of COVID-19 by using network pharmacology and molecular docking, and to provide references for clinical applications. Methods The chemical constituents and action targets of all medicinal materials in Jingfang Baidu San were retrieved from TCMSP. Uniprot database was used to search the corresponding genes of targets. Cytoscape software was used to construct the network of medicinal materials-compounds-targets for visualization. The target proteins of COVID-19 were searched by disease databases. The intersection of both was considered to be analyzed to establish the protein-protein interaction (PPI) network by STRING database. GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed through Metascape database to predict its mechanism. The effective strength of core constituents on preventing COVID-19 was calculated by molecular docking method. Results A total of 159 effective ingredients and 277 potential targets were obtained in Jingfang Baidu San within the given screening conditions [oral bioavailability (OB) ≥30%; drug-like (DL) ≥ 0.18], including 55 core targets with the intersection of 273 targets of COVID-19. According to the results of GO and KEGG enrichment analysis performed on the core targets, 1376 GO items and 136 KEGG pathways were obtained, involving infectious diseases, cancer, cell progress, immune system, signaling pathways etc. The results of molecular docking indicated strong binding capacity between the core ingredients and SARS-CoV-2 3CL hydrolase or angiotensin-converting enzyme II (ACE2). The hydrogen binding and hydrophobic effect were the main forms of the interaction. Conclusion The active ingredients in Jingfang Baidu San can inhibit the binding between SARS-CoV-2 protein and ACE2, thus regulating multiple targets and signal pathways, which plays a role in the prevention and the treatment of COVID-19. -
Key words:
- Jingfang Baidu San /
- SARS-CoV-2 /
- COVID-19 /
- network pharmacology /
- molecular docking
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超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
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表 1 荆防败毒散中部分活性成分的基本信息
成分名称 MOL ID MW OB (%) DL 药味归属 β谷甾醇 MOL000358 414.79 36.91 0.75 荆芥、防风、羌活、前胡、独活、枳壳 谷甾醇 MOL000359 414.79 36.91 0.75 荆芥、防风、羌活、前胡、川芎、甘草 槲皮素 MOL000098 302.25 46.43 0.28 荆芥、柴胡、前胡、甘草 异欧前胡素 MOL001942 270.30 45.46 0.23 防风、前胡、羌活、独活 欧前胡素 MOL001941 270.30 34.55 0.22 防风、前胡、羌活、独活 紫花前胡苷 MOL004792 408.44 57.12 0.69 羌活、独活、前胡 柚皮素 MOL004328 272.27 59.29 0.21 枳壳、甘草 异鼠李素 MOL000354 316.28 49.60 0.31 柴胡、甘草 豆甾醇 MOL000449 412.77 43.83 0.76 荆芥、柴胡 亚油酸乙酯 MOL001494 308.56 42.00 0.19 防风、川芎 山奈酚 MOL000422 286.25 41.88 0.24 柴胡、甘草 紫花前胡素 MOL013077 328.39 39.27 0.38 防风、前胡 木犀草素 MOL000006 286.25 36.16 0.25 荆芥、桔梗 甘草酚 MOL002311 366.39 90.78 0.67 甘草 宽叶甘松酸 MOL013098 328.39 87.48 0.37 前胡 Divaricate acid MOL011737 320.32 87.00 0.32 防风 甘草吡喃
香豆素MOL004904 384.41 80.36 0.65 甘草 shinpterocarpin MOL004891 322.38 80.30 0.73 甘草 芒柄花黄素 MOL000392 268.28 69.67 0.21 甘草 xambioona MOL005018 388.49 54.85 0.87 甘草 丹参酮IIA MOL007154 294.37 49.89 0.40 前胡 异甘草酚 MOL004948 366.39 44.70 0.84 甘草 去氢齿孔酸 MOL000300 453.75 44.17 0.83 茯苓 7-甲氧基-2-甲基异黄酮 MOL003896 266.31 42.56 0.20 甘草 美迪紫檀素-3-O-葡萄糖苷 MOL004924 432.46 40.99 0.95 甘草 过氧化麦角
甾醇MOL000283 430.74 40.36 0.81 茯苓 去氢茯苓酸 MOL000276 526.83 35.11 0.81 茯苓 茯苓酸 MOL000289 528.85 33.63 0.81 茯苓 kanzonol F MOL004988 420.54 32.47 0.89 甘草 汉黄芩素 MOL000173 284.28 30.68 0.23 防风 
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表 2 荆防败毒散中核心成分与Mpro、ACE2的结合能
成分 CAS号 化学式 结合能(kJ/mol) Mpro ACE2 槲皮素 117-39-5 C15H10O7 −27.21 −34.33 山奈酚 520-18-3 C15H10O6 −27.21 −32.66 木樨草素 491-70-3 C15H10O6 −28.89 −34.33 汉黄芩素 10-29-7 C16H12O5 −27.21 −33.91 7-甲氧基-2-甲基异黄酮 19725-44-1 C17H14O3 −25.96 −32.24 β-谷甾醇 83-46-5 C29H50O −31.40 −36.84 丹参酮IIA 568-72-9 C19H18O3 −30.14 −36.43 异鼠李素 480-19-3 C16H12O7 −27.21 −33.49 芒柄花黄素 485-72-3 C16H12O4 −29.73 −30.14 柚皮素 153-18-4 C15H12O5 −28.47 −33.49
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