LC-10A型高效液相色谱仪，包括SPD-10A型紫外检测器、手动进样器、LC-solutionLite色谱工作站（日本Shimadzu公司）；BT125D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；ZF-2型三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂）；电热恒温水浴锅（天津华北实验仪器有限公司）；硅胶G薄层板、硅胶GF₂₅₄薄层板（青岛海洋化工有限公司）。

黄芪甲苷对照品（含量：95.8%，批号：110781-201314）、五味子醇甲对照品（含量：99.9%，批号：110857-201513）、羟苯乙酯对照品（批号：100847-201604，含量：99.9%）、黄芪对照药材（批号：121462-201304）、麦冬对照药材（批号：121013-201310）、五味子对照药材（批号：120922-201309）均购自中国食品药品检定研究院；地龙参麦口服液（批号：170926、171208、180312）和阴性样品为中国人民解放军联勤保障部队第九八八医院自制；乙腈为色谱纯；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。

取本品30 ml，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用1%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次20 ml，再用水洗涤2次，每次20 ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺黄芪的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。取黄芪对照药材2.0 g，加水饱和的正丁醇60 ml，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液同法制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述4种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-水（25∶11∶3）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，见图1。

图  1  黄芪TLC图

取本品20 ml，加30%盐酸溶液3 ml，加热煮沸5 min，放冷，用二氯甲烷振摇提取2次，每次30 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺麦冬的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。取麦冬对照药材2 g，加水50 ml，煎煮30 min，滤过，滤液加30%盐酸溶液6 ml，同法制成对照药材溶液。按照TLC法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述3种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮（12∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，见图2。

图  2  麦冬TLC图

取本品30 ml，用二氯甲烷振摇提取2次，每次30 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加二氯甲烷1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺五味子的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。取五味子对照药材1.0 g，加二氯甲烷30 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1 ml使溶解，作为对照药材溶液。再取五味子醇甲对照品，加二氯甲烷制成每1 ml含1 mg五味子醇甲的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述4种溶液各2 μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（10∶7∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，见图3。

图  3  五味子TLC图

色谱柱为Wondasil C₁₈柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱：0～10 min，35%A；10～20 min，35%A→47%A；20～30 min，47%A→55%A。流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。

（1）混合对照品溶液：精密称取羟苯乙酯、五味子醇甲对照品各适量，加甲醇溶解并定容，制成每1 ml含羟苯乙酯、五味子醇甲分别为505.89、116.12 µg的混合对照品储备液。精密量取上述混合对照品储备液2 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得羟苯乙酯、五味子醇甲质量浓度分别为101.18、23.22 µg/ml的混合对照品溶液。

（2）供试品溶液：精密量取样品2 ml，置于10 ml量瓶中，加50%甲醇溶液定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

（3）阴性对照溶液：分别取缺羟苯乙酯、缺五味子的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图4。结果表明，在该色谱条件下，供试品溶液在与对照品溶液相同保留时间处出峰，阴性对照溶液对羟苯乙酯、五味子醇甲的测定无干扰。

图  4  地龙参麦口服液HPLC图

精密量取“2.2.2”项下混合对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加50%甲醇溶液定容，摇匀，进样，记录峰面积。以羟苯乙酯和五味子醇甲质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得羟苯乙酯回归方程为Y=58 559.18X−90 593.32 (r=0.999 9)，五味子醇甲回归方程为Y=27 155.08X−7 196.072 (r=0.999 9)。结果表明，羟苯乙酯和五味子醇甲检测质量浓度线性范围分别为25.29~252.94、5.81~58.06 μg/ml。

取“2.2.2”项下混合对照品溶液，连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，羟苯乙酯和五味子醇甲峰面积的RSD分别为0.62%、0.45%，表明仪器精密度良好。

取已知含量的供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按进样测定，记录峰面积。结果显示，羟苯乙酯和五味子醇甲峰面积的RSD分别为1.03%、0.85%，表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

取同一批样品，平行制备6份供试品溶液，进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果显示，羟苯乙酯和五味子醇甲的含量平均值分别为0.468 8、0.115 6 mg/ml，RSD分别为0.75%、0.85%(n=6)，表明本方法重复性良好。

精密量取已知含量的样品（批号：170328）1.0 ml，共9份，分别置于10 ml量瓶中，各加入低、中、高质量的羟苯乙酯和五味子醇甲对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

取3批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表2。

黄芪TLC鉴别时，样品的正丁醇提取液用1%氢氧化钠溶液洗涤，既可以除去酸性、酚类非指标成分，又能促进其他黄芪皂苷转化成黄芪甲苷，增加黄芪甲苷的量^[9-11]，提高鉴别效果。

试验过程中，曾进行过红参和地龙的薄层鉴别研究。在对红参的鉴别中，采用不同的展开系统阴性均出现干扰；而在地龙的研究中采用不同供试品处理方法、不同的展开系统均无法显示出地龙的特征性斑点，故质量标准中舍弃了对红参和地龙的薄层鉴别。

本试验考察了甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-水3种不同的流动相体系，在满足基线平稳、指标峰分离度良好、峰型对称度好的基础上，从经济环保的角度出发，选用乙腈-水体系。但羟苯乙酯和五味子醇甲极性有一定差别，故采用梯度洗脱法来达到快速检测的目的。

由紫外吸收图谱可知，羟苯乙酯和五味子醇甲在254 nm附近均有最大吸收，故选择254 nm作为检测波长，操作更加简单、普适性更强^[12]。

试验中考察了水、甲醇、乙醇、稀乙醇和50%甲醇作为提取溶剂，结果显示50%甲醇作溶剂时，指标成分无干扰，提取率高。

本研究曾尝试测定红参中有效成分的含量，将样品采用直接过滤法、蒸干后甲醇超声法、正丁醇萃取法等均无法有效检测出红参中的有效成分，故最终放弃对红参的含量测定。

《中国药典》（2015年版）四部通则0181【合剂】项下规定羟苯酯类防腐剂的用量不得超过0.05%，但所有抑菌剂都有一定的毒性，添加到制剂中的抑菌剂应是在抑菌效力测试试验基础上的最低有效量^[13]。样品处方中羟苯乙酯的用量为0.05%，但3批样品的测定结果显示羟苯乙酯的含量差异较大，因而把羟苯乙酯含量也作为质量控制项符合制剂的安全性要求。