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地龙参麦口服液（曾用名：健心乐口服液）是由地龙、红参、黄芪、麦冬、五味子等五味中药材加工制成的复方非标准制剂，具有利尿、降压、强心、补益气血、养心安神之功效[1-2]，在临床上用于各种病因引起的慢性心功能不全、心慌、胸闷、胸痛及各种心律失常，并有利水、抗凝、营养心肌之功效。原质量标准制定年代久远，只有检查项，不能全面控制制剂质量。根据全军医疗机构制剂标准提高课题要求，增加了麦冬、黄芪和五味子的薄层色谱（TLC）鉴别方法。五味子醇甲是方中五味子的有效成分之一，能够保护心肌结构和功能，降低心肌耗氧量，延长供体心的保存时间[3]；羟苯乙酯为方中的化学防腐剂，具有广谱抑菌作用，但过量使用会产生变态反应以及类激素作用[4]。为保证制剂的有效性和安全性，本研究采用HPLC法同时测定制剂中有效成分五味子醇甲和防腐剂羟苯乙酯的含量，为提高和完善地龙参麦口服液的质量标准提供可靠的试验依据。
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LC-10A型高效液相色谱仪，包括SPD-10A型紫外检测器、手动进样器、LC-solutionLite色谱工作站（日本Shimadzu公司）；BT125D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；ZF-2型三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂）；电热恒温水浴锅（天津华北实验仪器有限公司）；硅胶G薄层板、硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工有限公司）。
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黄芪甲苷对照品（含量：95.8%，批号：110781-201314）、五味子醇甲对照品（含量：99.9%，批号：110857-201513）、羟苯乙酯对照品（批号：100847-201604，含量：99.9%）、黄芪对照药材（批号：121462-201304）、麦冬对照药材（批号：121013-201310）、五味子对照药材（批号：120922-201309）均购自中国食品药品检定研究院；地龙参麦口服液（批号：170926、171208、180312）和阴性样品为中国人民解放军联勤保障部队第九八八医院自制；乙腈为色谱纯；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。
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取本品30 ml，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用1%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次20 ml，再用水洗涤2次，每次20 ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺黄芪的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。取黄芪对照药材2.0 g，加水饱和的正丁醇60 ml，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液同法制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述4种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-水（25∶11∶3）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，见图1。
图 1 黄芪TLC图
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取本品20 ml，加30%盐酸溶液3 ml，加热煮沸5 min，放冷，用二氯甲烷振摇提取2次，每次30 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺麦冬的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。取麦冬对照药材2 g，加水50 ml，煎煮30 min，滤过，滤液加30%盐酸溶液6 ml，同法制成对照药材溶液。按照TLC法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述3种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮（12∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，见图2。
图 2 麦冬TLC图
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取本品30 ml，用二氯甲烷振摇提取2次，每次30 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加二氯甲烷1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺五味子的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。取五味子对照药材1.0 g，加二氯甲烷30 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1 ml使溶解，作为对照药材溶液。再取五味子醇甲对照品，加二氯甲烷制成每1 ml含1 mg五味子醇甲的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述4种溶液各2 μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（10∶7∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，见图3。
图 3 五味子TLC图
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色谱柱为Wondasil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱：0～10 min，35%A；10～20 min，35%A→47%A；20～30 min，47%A→55%A。流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。
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（1）混合对照品溶液：精密称取羟苯乙酯、五味子醇甲对照品各适量，加甲醇溶解并定容，制成每1 ml含羟苯乙酯、五味子醇甲分别为505.89、116.12 µg的混合对照品储备液。精密量取上述混合对照品储备液2 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得羟苯乙酯、五味子醇甲质量浓度分别为101.18、23.22 µg/ml的混合对照品溶液。
（2）供试品溶液：精密量取样品2 ml，置于10 ml量瓶中，加50%甲醇溶液定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
（3）阴性对照溶液：分别取缺羟苯乙酯、缺五味子的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。
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精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图4。结果表明，在该色谱条件下，供试品溶液在与对照品溶液相同保留时间处出峰，阴性对照溶液对羟苯乙酯、五味子醇甲的测定无干扰。
图 4 地龙参麦口服液HPLC图
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精密量取“2.2.2”项下混合对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加50%甲醇溶液定容，摇匀，进样，记录峰面积。以羟苯乙酯和五味子醇甲质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得羟苯乙酯回归方程为Y=58 559.18X−90 593.32 (r=0.999 9)，五味子醇甲回归方程为Y=27 155.08X−7 196.072 (r=0.999 9)。结果表明，羟苯乙酯和五味子醇甲检测质量浓度线性范围分别为25.29~252.94、5.81~58.06 μg/ml。
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取“2.2.2”项下混合对照品溶液，连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，羟苯乙酯和五味子醇甲峰面积的RSD分别为0.62%、0.45%，表明仪器精密度良好。
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取已知含量的供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按进样测定，记录峰面积。结果显示，羟苯乙酯和五味子醇甲峰面积的RSD分别为1.03%、0.85%，表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。
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取同一批样品，平行制备6份供试品溶液，进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果显示，羟苯乙酯和五味子醇甲的含量平均值分别为0.468 8、0.115 6 mg/ml，RSD分别为0.75%、0.85%(n=6)，表明本方法重复性良好。
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精密量取已知含量的样品（批号：170328）1.0 ml，共9份，分别置于10 ml量瓶中，各加入低、中、高质量的羟苯乙酯和五味子醇甲对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。
表 1 加样回收率试验结果(n=9)
成分 样品量（m/mg） 加入量（m/mg） 测得量（m/mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%） 羟苯乙酯 0.468 8 0.252 9 0.717 6 98.38 99.72 0.76 0.468 8 0.252 9 0.719 1 98.97 0.468 8 0.252 9 0.721 9 100.08 0.468 8 0.505 9 0.976 3 100.32 0.468 8 0.505 9 0.970 9 99.25 0.468 8 0.505 9 0.972 6 99.58 0.468 8 0.758 8 1.231 9 100.57 0.468 8 0.758 8 1.232 2 100.61 0.468 8 0.758 8 1.225 3 99.70 五味子醇甲 0.115 6 0.058 1 0.172 6 98.11 99.35 1.02 0.115 6 0.058 1 0.172 7 98.28 0.115 6 0.058 1 0.173 2 99.14 0.115 6 0.116 1 0.230 0 98.54 0.115 6 0.116 1 0.230 6 99.05 0.115 6 0.116 1 0.232 6 100.78 0.115 6 0.174 2 0.288 5 99.25 0.115 6 0.174 2 0.291 1 100.75 0.115 6 0.174 2 0.290 2 100.23 -
取3批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表2。
表 2 样品含量测定结果(n=3, mg/ml)
样品批号 羟苯乙酯 五味子醇甲 160903 0.437 1 0.102 6 170112 0.531 9 0.106 1 170328 0.468 8 0.115 6 -
黄芪TLC鉴别时，样品的正丁醇提取液用1%氢氧化钠溶液洗涤，既可以除去酸性、酚类非指标成分，又能促进其他黄芪皂苷转化成黄芪甲苷，增加黄芪甲苷的量[9-11]，提高鉴别效果。
试验过程中，曾进行过红参和地龙的薄层鉴别研究。在对红参的鉴别中，采用不同的展开系统阴性均出现干扰；而在地龙的研究中采用不同供试品处理方法、不同的展开系统均无法显示出地龙的特征性斑点，故质量标准中舍弃了对红参和地龙的薄层鉴别。
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本试验考察了甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-水3种不同的流动相体系，在满足基线平稳、指标峰分离度良好、峰型对称度好的基础上，从经济环保的角度出发，选用乙腈-水体系。但羟苯乙酯和五味子醇甲极性有一定差别，故采用梯度洗脱法来达到快速检测的目的。
由紫外吸收图谱可知，羟苯乙酯和五味子醇甲在254 nm附近均有最大吸收，故选择254 nm作为检测波长，操作更加简单、普适性更强[12]。
试验中考察了水、甲醇、乙醇、稀乙醇和50%甲醇作为提取溶剂，结果显示50%甲醇作溶剂时，指标成分无干扰，提取率高。
本研究曾尝试测定红参中有效成分的含量，将样品采用直接过滤法、蒸干后甲醇超声法、正丁醇萃取法等均无法有效检测出红参中的有效成分，故最终放弃对红参的含量测定。
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《中国药典》（2015年版）四部通则0181【合剂】项下规定羟苯酯类防腐剂的用量不得超过0.05%，但所有抑菌剂都有一定的毒性，添加到制剂中的抑菌剂应是在抑菌效力测试试验基础上的最低有效量[13]。样品处方中羟苯乙酯的用量为0.05%，但3批样品的测定结果显示羟苯乙酯的含量差异较大，因而把羟苯乙酯含量也作为质量控制项符合制剂的安全性要求。
Study on the quality control improvement of Dilong Shenmai oral liquid
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摘要:
目的 完善地龙参麦口服液的质量标准。 方法 采用薄层色谱法（TLC）对地龙参麦口服液中黄芪、麦冬和五味子进行定性鉴别。采用HPLC法测定制剂中五味子醇甲、羟苯乙酯的含量，色谱柱为Wondasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(梯度洗脱)，流速为1.0 ml/min，检测波长为254 nm，柱温为30 ℃。 结果 TLC色谱图斑点清晰，分离度良好，阴性无干扰。五味子醇甲和羟苯乙酯检测质量浓度线性范围分别为5.81～58.06 μg/ml (r=0.999 9)、25.29～252.94 μg/ml (r=0.999 9)；平均加样回收率分别为99.35% (RSD为1.02%)和99.72% (RSD为0.76%)。 结论 该方法简便、快速、准确，能更全面有效地控制地龙参麦口服液的质量。 Abstract:Objective To improve the quality control of Dilong Shenmai oral liquid. Methods TLC was used for the qualitative identification of Astragali Radix, Ophiopogonis Radix and Schisandrae Chinensis Fructus in Dilong Shenmai oral liquid. HPLC was used to determine the contents of schisandrin and ethylparaben in the preparation. Wondasil C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used with acetonitrile-water as the mobile phase at the flow rate of 1.0 ml/min for gradient elution. The detection wavelength was set at 254 nm, and column temperature was 30 ℃. Results TLC spots were clear and well-separated without negative interference. The linear ranges of schisandrin and ethylparaben were 5.81−58.06 μg/ml (r=0.999 9) and 25.29−252.94 μg/ml (r=0.999 9). The average recoveries were 99.35% (RSD=1.02%) and 99.72% (RSD=0.76%). Conclusion This method is simple, quick and accurate. It can be used for effective quality control of Dilong Shenmai oral liquid. -
Key words:
- Dilong shenmai oral liquid /
- HPLC /
- TLC /
- schisandrin /
- ethylparaben
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据国际癌症研究机构（IARC，https://www.iarc.who.int/）提供的数据显示，2020年女性乳腺癌现已成为全球最常见的癌症之一[1]。其中有15%～25%的乳腺肿瘤存在人类表皮生长因子受体2（HER2）过表达。HER2阳性的乳腺癌浸润性强、无病生存期短、预后差，对化疗敏感性差，且易复发[2]。曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。虽然曲妥珠单抗单药对乳腺癌治疗起到了很好的改善的效果, 但其疗效还有所不足，如对HER2过表达的乳腺癌患者初次治疗有效率仅在30%左右[3]。EGCG是绿茶中主要的多酚[4]，有抑制肿瘤细胞生长、增殖、转移和血管生成，诱导细胞凋亡和增强抗肿瘤免疫等多种抗肿瘤作用[5-9]。据报道，EGCG在乳腺癌、胃癌、白血病、膀胱癌治疗中均显示有抗肿瘤作用[10-13]。本实验旨在探讨曲妥珠单抗与EGCG对HER2过表达细胞株是否具有协同增殖抑制作用，为HER2高表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
EGCG（MedChemExpress公司），CCK-8检测试剂盒（美国bimake生物科技有限公司）；GAPDH一抗、AKT一抗、p-AKT一抗、MAPK一抗、p-MAPK一抗、EGFR一抗、p-EGFR一抗、HER2一抗、p-HER2一抗、抗兔IgG一抗、抗鼠IgG一抗、HRP抗体二抗（美国Cell Signaling Technology公司），凝胶过滤层析标准品（美国BIO-RAD公司），二抗Goat pAb to Human IgG（英国Abcam公司）。
1.1.2 细胞株
人乳腺癌细胞系BT474、SK-BR-3（购自中国科学院细胞库并保存于本实验室）。
1.1.3 仪器
AKTA Avant 25蛋白纯化仪、Imager 600超灵敏多功能成像仪（美国Cytiva公司）； Agilent 1200 series高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Spark多功能酶标仪（瑞士TECAN）； Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪（德国赛多利斯）。
1.2 方法
1.2.1 曲妥珠单抗的表达与纯化
用含有曲妥珠单抗重链和轻链表达载体的质粒共转染Expi293F细胞7 d后收集培养上清液，用Protein A亲和层析法进行纯化。SEC-HPLC对抗体的纯度进行检测，并用流式细胞术检测曲妥珠单抗抗体与HER2过表达细胞株SK-BR-3、BT474的结合活性。
1.2.2 流式细胞术
细胞按3×104个细胞/孔铺于V型底96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗按100 nmol/L的起始浓度，3倍比稀释，分成11个浓度梯度，末孔为PBS作为阴性对照，加入铺有细胞的96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗与细胞4℃共孵育1～2 h，用含0.1% BSA的PBS洗1遍，加入二抗Goat pAb to Human IgG，1∶200稀释，每孔30 μl，4℃孵育30 min。二抗孵育结束，用含0.1% BSA的PBS洗2遍，每孔加入30 μl 含0.1% BSA的PBS，用 Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪进行检测。
1.2.3 细胞培养
采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养SK-BR-3细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养BT474细胞，培养条件为5% CO2，37℃。当细胞密度达到80%～90%时进行传代，每周2～3次。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.4 CCK8检测细胞增殖
将细胞按1×104个细胞/孔的数量接种于96孔板中，在37℃、5% CO2条件下培养24 h。每孔加入100 μl含设定浓度药物的培养基，培养48 h后，弃去孔内培养基，每孔加入100 μl含10%CCK8试剂的培养基，继续培养1～3 h，用酶标仪在450 nm测定光密度值（A），并计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（A对照−A实验）/（A对照−A背景）。联合给药组用CompuSyn软件计算CI值（药物联合指数），通过CI值的数值可以定量判断药物间相互作用的强度以及性质（CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用；CI<1为协同作用）。
1.2.5 Western blot检测
根据分组将细胞按5×105个细胞/孔的数量接种于6孔板培养24 h。弃去原培养基，加入含设定浓度药物的培养基继续培养24 h。采用细胞裂解液试剂盒提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按每泳道30 μg蛋白样品的上样量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。一抗、二抗均按照抗体使用说明书稀释。洗膜后，加ECL发光液，用超灵敏多功能成像仪进行显影，并用ImageJ软件对条带进行灰度值分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值 。
1.2.6 统计学方法
采用 GraphPad prism 8.0软件（Version X，USA）进行统计学分析和作图，用compuSyn软件计算联合指数。两组数据之间比较采用t检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 SEC-HPLC检测曲妥珠单抗的纯度
将表达纯化后的曲妥珠单抗用SEC-HPLC进行检测，结果显示曲妥珠单抗的纯度为100%，且分子量大小在150 kDa（1kDa=1×103）左右（图1）。
2.2 流式细胞术验证曲妥珠单抗与SK-BR-3、BT474的结合活性
采用流式细胞术测定曲妥珠单抗与HER2过表达乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474的结合活性。结果显示，曲妥珠单抗以浓度依赖性的方式结合SK-BR-3和BT474细胞，其中，曲妥珠单抗与SK-BR-3细胞株结合的EC50值为1.128 nmol/L，与BT474细胞株结合的EC50值为1.203 nmol/L，两者EC50值大约一致（图2）。
2.3 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对BT474的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对BT474的增殖抑制作用。图3A和图3B结果显示， EGCG和曲妥珠单抗对BT474细胞均显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图3C结果显示EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图3D结果显示EGCG在一定浓度范围内（45～200 μmol/L）与16.67 nmol/L 曲妥珠单抗联用时显示有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 3 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞增殖的影响注：A.EGCG对BT474细胞增殖的影响；B.曲妥珠单抗对BT474细胞增殖的影响；C.16.67 nmol/L曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、45 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与45 μmol/L EGCG联用对BT474细胞增殖的影响；D.16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对BT474细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；*P<0.05，****P<0.0001，与空白组比较；△△△△P<0.0001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.4 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对SK-BR-3细胞的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对SK-BR-3的增殖抑制作用。图4A和图4B结果显示，EGCG和曲妥珠单抗均对SK-BR-3细胞显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图4C结果显示，EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图4D结果显示，EGCG在一定浓度范围内（7.5～120 μmol/L）与16.67 nmol/L曲妥珠单抗联用时有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 4 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对SK-BR-3细胞增殖的影响注：A.EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响；B. 曲妥珠单抗对SK-BR-3细胞增殖的影响；C. 16.67 nmol/L 曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、15 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与15 μmol/L EGCG联用对SK-BR-3细胞增殖的影响；D. 16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；△△△P<0.001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.5 Western blot法检测EGCG、曲妥珠单抗单用及二者联用对BT474细胞中EGFR、HER2、Akt、MAPK及其磷酸化蛋白表达的影响
图5A-F结果显示，EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联用组均能显著降低BT474细胞中p-Akt、p-MAPK、p-EGFR的表达。图5G-H结果显示，曲妥珠单抗单药组能显著降低BT474细胞p-HER2的表达，EGCG单药组虽然无显著性差异（P>0.05），但对p-HER2的表达有一定抑制作用。与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞p-Akt、p-MAPK、p-EGFR、p-HER2蛋白的表达。
图 5 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞中MAPK、Akt、EGFR、HER2及其磷酸化蛋白的表达的影响注：A. p-Akt、Akt的蛋白表达水平；B. p-Akt、Akt的相对蛋白表达量；C. p-MAPK、MAPK的蛋白表达水平；D. p-MAPK、MAPK的相对蛋白表达量；E. p-EGFR、EGFR的蛋白表达水平；F. p-EGFR、EGFR的相对蛋白表达量；G. p-HER2、HER2的蛋白表达水平；H. p-HER2、HER2的相对蛋白表达量；****P<0.0001，与对照组比较；##P<0.01、###P<0.001、 ####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较3. 讨论
ErbB-2(HER-2/neu)是一种分子量为1.85×105的穿膜受体络氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族[14]。该家族由4个紧密相关的络氨酸激酶（TK）受体组成：HER1(EGFR)、HER2、HER3和HER4。HER2主要是通过与家族中的其他成员形成同源或异源二聚体，激活下游的RAS/MAPK和磷脂酰肌醇-3/激酶（PI3K）/ATK信号通路，进而促进细胞增殖、迁移、血管生成以及抑制细胞的凋亡[15-16]。ERK/MAPK通路是参与细胞增殖控制的主要细胞内信号通路之一。 PI3K/ATK信号通路在控制Her-2/neu过表达细胞的生长和转化表型中起重要作用[17-18]。HER2过表达的癌症表现出较强的转移能力和浸润能力，对化疗敏感性差，且易复发。
曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。1998年，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准应用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌[19]。曲妥珠单抗可能通过下调HER2受体在细胞膜上的表达，阻断HER2和HER3形成异源二聚体从而抑制下游通路，导致细胞周期阻滞，以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性活性[20]等。虽然曲妥珠单抗单药治疗起到了一定的效果, 但大部分HER2过表达的乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗不产生反应，初次治疗有效率大约在30%, 即使对曲妥珠单抗产生反应的患者也有约50%会在1年内发生耐药。
茶多酚可以抑制多种与细胞增殖和肿瘤进展相关的酶活性。EGCG是茶多酚中的主要成分之一。研究显示，在人A431表皮样癌细胞中，EGCG可能通过阻断EGF与其受体的结合进而抑制EGFR活性[21]。EGCG能抑制结肠癌细胞中EGFR、HER2、HER3的激活，并抑制细胞生长[22]。
为了进一步提高HER2靶向治疗疗效，在本研究中我们探讨了曲妥珠单抗和EGCG在乳腺癌细胞的联合抗肿瘤作用。实验结果发现EGCG与曲妥珠单抗在一定浓度范围内可以协同抑制HER2过表达乳腺癌细胞的生长，提示临床治疗中如果利用EGCG和曲妥珠单抗联合治疗则需重点关注两者各自的剂量。可以先利用乳腺癌荷瘤小鼠模型对不同剂量的EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用进行评价，并参考动物体内药效实验的结果进行EGCG和曲妥珠单抗联合用药临床试验的设计，通过临床试验的结果确定临床治疗时最佳的联合用药剂量。
本研究还对EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用机制进行了阐明：与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞中p-EGFR、p-HER2和p-Akt、p-MAPK的表达，提示EGCG和曲妥珠单抗联用对HER2过表达乳腺癌细胞的协同增殖抑制活性可能与其显著增强的对Akt和MAPK信号通路的抑制作用有关。本研究为EGCG与曲妥珠单抗的联合应用提供了理论支持，并为HER2过表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
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表 1 加样回收率试验结果(n=9)
成分 样品量（m/mg） 加入量（m/mg） 测得量（m/mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%） 羟苯乙酯 0.468 8 0.252 9 0.717 6 98.38 99.72 0.76 0.468 8 0.252 9 0.719 1 98.97 0.468 8 0.252 9 0.721 9 100.08 0.468 8 0.505 9 0.976 3 100.32 0.468 8 0.505 9 0.970 9 99.25 0.468 8 0.505 9 0.972 6 99.58 0.468 8 0.758 8 1.231 9 100.57 0.468 8 0.758 8 1.232 2 100.61 0.468 8 0.758 8 1.225 3 99.70 五味子醇甲 0.115 6 0.058 1 0.172 6 98.11 99.35 1.02 0.115 6 0.058 1 0.172 7 98.28 0.115 6 0.058 1 0.173 2 99.14 0.115 6 0.116 1 0.230 0 98.54 0.115 6 0.116 1 0.230 6 99.05 0.115 6 0.116 1 0.232 6 100.78 0.115 6 0.174 2 0.288 5 99.25 0.115 6 0.174 2 0.291 1 100.75 0.115 6 0.174 2 0.290 2 100.23 
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表 2 样品含量测定结果(n=3, mg/ml)
样品批号 羟苯乙酯 五味子醇甲 160903 0.437 1 0.102 6 170112 0.531 9 0.106 1 170328 0.468 8 0.115 6
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[1] 刘清源, 冯志祥, 张正臣, 等. 健心乐口服液对心力衰竭的疗效观察[J]. 河南医药信息, 1999(5):46-47. [2] 刘清源, 冯志祥, 张正臣. 健心乐口服液强心作用的实验研究[J]. 河南中医药学刊, 2001, 16(2):27-28. [3] 郑夺, 张婷, 陈冠, 等. 多指标正交试验优选养心颗粒制备工艺[J]. 药物分析杂志, 2015, 35(7):1218-1222. [4] 王发英, 吴查青, 陈张金, 等. 复方鱼腥草合剂中3个有效成分及防腐剂的含量测定[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(3):399-403. [5] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(2015年版) : 一部, 四部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 66, 155, 302, 通则0502. [6] 申琳, 曲佳, 孙永跃. 脉康合剂的质量标准研究[J]. 中国药房, 2016, 27(21):3000-3003. doi: 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.21.40 [7] 于春艳, 邱世鑫, 包晗, 等. 延胡索与常见伪品的快速鉴别方法[J]. 甘肃医药, 2018, 37(10):932-933. [8] 刘莉, 李婷婷, 王欣, 等. 安神补心片的薄层色谱鉴别[J]. 中国药业, 2019, 28(19):43-45. doi: 10.3969/j.issn.1006-4931.2019.19.013 [9] 周亚萍, 谈瑄忠, 毛春芹, 等. 芪术益气润肠颗粒质量控制方法[J]. 中国实验方剂学杂志, 2016, 22(3):67-71. [10] 王艳, 胡娟妮, 赵勇, 等. 补中益气丸中黄芪甲苷转移率异常干扰因素研究[J]. 中国药师, 2013, 16(8):1156-1159. doi: 10.3969/j.issn.1008-049X.2013.08.023 [11] 韩宵, 闫春风, 朱磊, 等. HPLC-ELSD测定益心舒分散片中人参皂苷Rg1, Re, Rb1, Rd和黄芪甲苷[J]. 中国实验方剂学杂志, 2015, 21(16):68-71. [12] 叶隽, 陈斌, 余岳林, 等. 高效液相色谱法同时测定清肺抑火片中8个成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2017, 37(6):968-974. [13] 沈秋莲, 杨育儒, 王庆芬, 等. 枸橼酸钾溶液中抑菌剂的抑菌效果观察[J]. 安徽医药, 2017, 21(4):623-626. doi: 10.3969/j.issn.1009-6469.2017.04.009 期刊类型引用(0)
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