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颅内感染尤其是多重耐药菌感染具有进展快、反应重、治疗难度大、病死率高的特点，故提高颅内感染治愈率受到患者及临床的广泛关注。替加环素（TGC）作为首个甘氨酰四环素类抗菌药物，具有抗菌谱广、抗耐药活性强的特点，对临床上常见耐药菌（如鲍曼不动杆菌、产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等）均有较好的疗效[1]。在耐药菌治疗药物不足的情况下，临床医生将TGC用于颅内感染的治疗，此外，越来越多的案例报道称，TGC可有效清除致病菌[2-3]。
TGC成功治疗颅内感染与脑脊液中有效药物浓度密切相关，TGC浓度监测对于提高颅内感染治愈率、精准指导临床合理用药具有重要意义[4]。本研究将利用二维液相色谱高效的自动化在线样品处理能力，建立脑脊液中TGC浓度测定方法。该方法与已报道的质谱法相比，具有操作简便、成本低、抗干扰能力强、基质效应小等优势，脑脊液样品无需复杂的前处理，高速离心后直接进样，短时间内即可完成萃取、转移及分析，更易于临床推广应用。
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二维高效液相色谱由FLC-2701全自动二维液相色谱耦合仪（湖南德米特仪器有限公司）和LC-20A色谱模块（日本岛津公司）构成；−80 ℃冰箱（美国赛默飞科技公司）；十万分之一电子天平（德国赛多利斯仪器公司）；涡旋混匀器（美国SI仪器公司）；低温高速离心机（美国贝克曼仪器公司）。
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TGC对照品（北京百灵威科技公司，批号: 10-MWV-62-1）；乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯；高氯酸、氨水为分析纯；超纯水自制。
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入住神经外科且未使用TGC的患者，住院期间需开展脑脊液生化检查时留取或从留置腰大池/脑室引流管中适量抽取。
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精密称取TGC对照品1.29 mg，用20 mg/ml精氨酸水溶液定容至100 ml容量瓶中，即得12.90 μg/ml的TGC标准溶液。
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预处理方法考察时，取脑脊液样品500 μl，直接离心、分别加入3倍体积甲醇、乙腈、10%高氯酸沉淀蛋白，涡旋混匀5 min，13 000 r/min离心10 min，取上清液进样分析。最终确定预处理方法为: 脑脊液样品13 000 r/min离心10 min后直接进样，采用外标法定量分析。
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第一维色谱柱LC1为Aston SNX5苯基色谱柱（50 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为磷酸铵（氨水调pH7.5）-甲醇 (45∶55，V/V），第二维色谱柱LC2为Aston SC5 C18色谱柱（275 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为磷酸铵（氨水调pH7.4）-磷酸铵（氨水调pH3.0）-乙腈（30∶50∶20，V/V/V），辅助流动相为纯化水。检测波长340 nm，色谱柱温40 ℃，进样量：200 μl，工作原理图见图1，时间程序见表1。
图 1 二维液相工作原理示意图
表 1 TGC检测时间程序
时间（t/min） 流速（ml/min） 功能 LC1 LC2 辅助流动相 0.01～0.80 1.00 1.20 2.00 脑脊液样品于LC1中富集 0.81～3.49 1.00 1.20 0.01 目标物在LC1中初步分离 3.50～5.50 1.00 1.20 0.01 LC1与LC2串联，目标物洗脱至LC2 5.51～11.00 1.50 1.20 0.01 目标物在LC2中洗脱分离，清洗泵反向冲洗LC1 -
分别制备空白脑脊液样品、含TGC的标准脑脊液样品、患者用药后的脑脊液样品，进行二维液相分析，得到色图谱，观察有无内源性干扰，如图2所示。结果表明，TGC的出峰时间9.38 min，脑脊液的内源性成分对TGC的测定无干扰。
图 2 脑脊液中TGC色谱图
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取不同体积TGC标准溶液，加入空白脑脊液定容，配制成浓度为64.5、129.0、387.0、645.0、1 290.0 ng/ml的系列对照溶液，按“2.2”项下操作后进样分析。以TGC浓度为自变量（X），脑脊液中TGC的峰面积为因变量（Y）进行线性回归，得回归方程为：Y=116.32X-3 223.6（r=0.999 8）。结果表明TGC浓度在64.5～1 290.0 ng/ml范围内线性关系良好，最低定量限为64.5 ng/ml。
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分别配制含TGC低、中、高及定量下限（225.0、450.0、900.0、64.5 ng/ml）4个浓度的质控（QC）脑脊液样本，按“2.2”项下操作后进样分析。1 d内每个浓度平行测定5份QC样品，连续测定3 d。将测得的峰面积代入“2.4.2”项下，计算各质控样品的浓度，并根据样本实际浓度计算本法的精密度与准确度。结果如表2所示，日内、日间RSD均小于5%，准确度均在98.80%～106.51%之间。可见本实验所建立的二维液相色谱法测定脑脊液中TGC的精密度和准确度符合《中国药典》（2015年版）检测要求[5]。
表 2 脑脊液中测定TGC浓度的精密度与准确度(%)
浓度（ng/ml） 日内（n=5） 日间（n=3） 准确度 RSD 准确度 RSD 225.0 100.31 ± 2.83 2.82 98.80 ± 0.95 0.96 450.0 104.58 ± 2.19 2.09 103.51 ± 2.72 2.63 900.0 106.51 ± 2.06 1.94 101.82 ± 4.28 4.20 64.5 105.04 ± 2.47 2.35 99.01 ± 2.05 2.08 -
配制“2.4.3”项下低、中、高及定量下限4个浓度的QC样品，每个浓度平行3份，分别考察室温放置4 h、进样器放置6 h、反复冻融3次、冰冻放置1周后的稳定性。结果如表3所示，表明上述条件对TGC的检测结果无明显影响。
表 3 脑脊液中TGC在不同温度条件下的稳定性
样品浓度（ng/ml） 室温放置4 h 进样器放置6 h 反复冻融3次 冰冻放置1周 平均浓度（ng/ml） RSD（%） 平均浓度（ng/ml） RSD（%） 平均浓度（ng/ml） RSD（%） 平均浓度（ng/ml） RSD（%） 64.5 68.67 ± 2.93 4.27 65.52 ± 1.52 2.32 65.01 ± 1.43 2.20 68.56 ± 3.06 4.46 225 223.16 ± 5.06 2.27 221.62 ± 2.45 1.11 224.72 ± 4.50 2.00 222.99 ± 5.40 2.42 450 452.44 ± 9.11 2.01 459.04 ± 13.45 2.93 464.03 ± 8.39 1.81 459.68 ± 8.25 1.80 900 885.14 ± 15.09 1.70 881.32 ± 13.36 1.52 888.13 ± 13.80 1.55 899.79 ± 10.13 1.13 -
本实验选取2例接受TGC治疗的多重耐药菌所致的重症颅内感染患者，脑脊液标本药敏试验均报告对TGC敏感。患者1接受说明书推荐剂量，即首剂静脉滴注100 mg，后以50 mg每12 h维持治疗。患者2同样接受静脉给药，剂量为受试者1的2倍。达到稳定药物浓度后，留取两位受试者的脑脊液，按“2.2”项下操作后进样分析。受试者脑脊液中TGC浓度分别为187.42、275.41 ng/ml。
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甲醇、乙腈、10%高氯酸是常用蛋白沉淀剂，本研究在空白脑脊液中分别加入3倍体积上述沉淀剂，离心后与不加蛋白沉淀剂组比较，沉淀量无显著差异，且所得上清液与沉淀完全分离。现多项研究认为，因脑脊液中蛋白质含量低，故直接离心更利于生物样品的微量分析[6]。另直接离心法进样，脑脊液中TGC浓度无稀释，也无其他前处理方法造成的误差，更利于临床样本的分析。
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TGC对G-菌（如流感嗜血杆菌、大肠杆菌、对鲍曼不动杆菌等）MIC90为2～4 mg/L[7-8]。本试验中，无论是常规给药还是加倍剂量给药的患者，稳态脑脊液浓度显然均未起到杀菌作用，导致抗感染治疗效果不佳。这可能与以下因素有关：①TGC相对分子质量大而且水溶性强，很难进入到脑脊液中。有研究报道在血脑屏障正常的志愿者中，脑脊液中TGC浓度仅为血浆的11%。而对于脑膜炎患者，血脑屏障通透性可增至33%～52%，这可能也是静脉注射TGC成功治疗颅内感染的主要原因[9-10]，但血脑屏障破坏的程度个体差异较大。②重症感染患者常伴有全身炎症反应、肝肾功能异常、多器官功能障碍综合征等，血药浓度低于正常水平，在同等穿透率的情况下，药物从血液进入脑脊液中的剂量减少[11]。③TGC的蛋白结合率较高，为71%～87%[12]。颅内感染时，脑脊液蛋白水平提高，使游离的药物浓度降低[13]。④ 脑脊液引流量与药物清除率呈正相关，引流量越大，脑脊液中的药物浓度越低[14]。
目前，TGC治疗方案大多参照说明书或文献报道推荐剂量，未考虑血脑屏障、脑脊液引流量、给药途径等患者自身因素的影响，使颅内TGC的浓度不足、疗效不佳。本研究建立的脑脊液中抗菌药物TGC的二维液相色谱分析方法简便、准确、稳定，对促进TGC的合理使用、改善临床治疗结局具有重要意义。临床可根据脑脊液中TGC的浓度，及时调整给药剂量或给药途径，提高治愈率，节省医疗费用。此外，也为研究TGC在颅内的药动学及量效关系奠定了基础。
Determination of tigecycline in human cerebrospinal fluid by two-dimensional liquid chromatography and its clinical application
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摘要:
目的 建立二维液相色谱法检测人脑脊液中替加环素浓度，用于颅内感染患者的药物浓度监测。 方法 采用外标法定量，第一维色谱柱为Aston SNX5苯基色谱柱（50 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为磷酸铵（氨水调pH7.5）-甲醇（45:55，V/V），流速1.0 ml/min。第二维色谱柱为Aston SC5 C18色谱柱（275 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为磷酸铵（氨水调pH7.4）-磷酸铵（氨水调pH3.0）-乙腈（30:50:20，V/V/V），流速1.2 ml/min。检测波长340 nm，色谱柱温40 ℃，进样量：200 μl。 结果 脑脊液中替加环素64.5～1 290.0 ng/ml内与峰面积呈良好线性关系（r=0.999 8）；日内、日间精密度RSD<5%，准确度为98.80%～106.51%。 结论 该方法操作简便、快速、准确、灵敏，适用于临床人脑脊液替加环素的浓度监测，可为颅内感染患者的个体化给药提供科学依据。 Abstract:Objective To establish a two-dimensional high-performance liquid chromatography method for the determination of tigecycline in human cerebrospinal fluid, which can be used for the drug monitoring in patients with intracranial infection. Methods The quantification was carried out by an external standard method. The first-dimension column was a Aston SNX5 phenyl chromatographic column (50 mm×4.6 mm, 5 μm) with ammonium phosphate (pH was adjusted with ammonium hydroxide to 7.5)-methanol (45∶55, V/V) as the mobile phase and the flow rate was 1.2 ml/min. The second-dimension chromatographic column was Aston SC5 C18 (275 mm×4.6 mm, 5 μm), with ammonium phosphate (pH was adjusted with ammonium hydroxide to 7.4)-ammonium phosphate (pH was adjusted with ammonium hydroxide to 3.0)- acetonitrile (30∶50∶20, V/V/V) as the mobile phase and the flow rate was 1.0 ml/min. The detection wavelength was 340 nm. The temperature was 40 ℃ and the injection volume was 200 μl. Results The calibration curve of tigecycline showed good linearity from 64.5 to 1 290.0 ng/ml in human cerebrospinal fluid (r=0.999 8). The RSD of intra and inter-day precision were less than 5.0% with the detection accuracy of 98.80%−106.51%. Conclusion This method is simple, quick, accurate, specific and sensitive. It meets the requirements of tigecycline determination in clinical human cerebrospinal fluid, which offers the individualized therapeutic assurance for patients with intracranial infection. -
子宫内膜异位症（endometriosis，EM）是临床上最为常见的慢性妇科疾病之一，以慢性盆腔疼痛、月经紊乱和不孕为主要的临床表现。EM本质是血瘀证，临床治疗时以活血化瘀为主，常用的药物有桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行等，能够有效缓解患者痛经、非经期盆腔痛等症状[1]。
目前活血化瘀类中药对EM治疗的具体机制不是很清晰，其针对的靶点也不是很明了。网络药理学将生物网络作为研究对象，探究药物、靶点、疾病之间的联系，系统完整地研究药物的机制，可展现出药物对于多个靶点、多个通路不同影响。因为和中医整体观念天然契合，网络药理学现已广泛应用于中药研究中[2-3] 。在本研究中，笔者采用网络药理学的方法探究活血化瘀类中药治疗EM的作用机制，构建“化合物-靶标-通路-疾病”网络，并初步探析何种活血化瘀药在EM治疗中更具优势，为临床用药以及进一步实验研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 活血化瘀类中药确认
根据卫生部“十一五”规划教材《中药学》分类，确认桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行七味活血化瘀药为本次主要研究对象。
1.2 中药有效成分以及相关靶点的获取
利用中药化学成分数据库TCMSP平台（http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），检索七味中药所含活性成分。依据数据库指南要求，将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%以及类药性（drug-like，DL）≥0.18作为筛选条件，对活性成分进行筛选[4]。OB值是评价药物能否发挥药效的重要药动学参数，DL值是指化合物与所有已知药物之间的相似程度。上述2个参数是评价中药化学成分吸收、分布、代谢、排泄的关键参数。获得符合OB、DL参数有效活性成分后，利用TCMSP数据库查询各有效活性成分对应相关靶点。利用Venn图工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对药物化学成分以及相关靶点进行共同点分析，寻找活血化瘀中药共有成分和作用靶点。
1.3 EM相关靶点基因确认
利用美国国立生物技术信息中心Gene数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）将所获靶点信息转换成基因名称。查询GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，获得与EM相关基因靶点。最后将每种中药的作用靶点对应的Gene Symbol与EM基因进行比对，获得每种中药可能影响EM的相关基因，利用Cytoscape 3.6.0软件构建化合物－靶点网络[5]。
1.4 构建蛋白互作网络
为进一步研究靶点之间的相互关系，将活血化瘀药共同靶点上传至线上软件 STRING(http://string db.org)，构建蛋白互作网络。物种选择为Homosapiens，minimum required interaction score调整为highest confidence，隐藏网络图中游离节点，获取PPI网络。
1.5 KGEE通路分析
利用KEGG数据库（https://www.keg g.jp/）查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。筛选各中药KEGG通路中相关基因富集情况，并利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图。
2. 结果
2.1 活血化瘀类中药有效成分及对应靶点的获取
按照要求从TCMSP数据库中筛选出各中药有效成分，删除重复项，共有94种有效成分（supplementary materials table S1）。其中丹参有效活性成分达到65个，而泽兰有效活性成分只有2个。未能发现七味活血化瘀药共同有效成分，但β-谷固醇为川牛膝、红花、桃仁、泽兰所共有，槲皮素为川牛膝、红花、王不留行、益母草所共有，是涉及活血化瘀类中药最多的2种有效成分（supplementary materials table S2）。与此同时，我们找到了七味中药所共有的19个作用靶点（表1），包括孕酮受体（progesterone receptor）、前列腺素G/H合成酶1（prostaglandin G/H synthase 1）、前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2）、凋亡调节剂Bcl-2（apoptosis regulator Bcl-2）、核受体共激活剂（nuclear receptor coactivator 2）等。
表 1 七种活血化瘀中药共有的19个靶点序号 蛋白名称 基因名称 靶点标识码 1 钠通道蛋白5型亚基 SCN5A TAR00070 2 前列腺素G/H合成酶1 PTGS1 TAR00006 3 Beta-2型肾上腺素受体 ADRB2 TAR00261 4 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3 CHRM3 TAR00016 5 孕酮受体 PGR TAR00209 6 半胱天冬酶3 CASP3 TAR04087 7 热休克蛋白HSP 90 HSP90 TAR00444 8 钾电压门控通道亚家族H成员2 KCNH2 TAR00037 9 凋亡调节剂Bcl-2 BCL2 TAR00086 10 PKA催化亚基C-alpha PRKACA TAR00699 11 半胱天冬酶9 CASP9 TAR04090 12 γ-氨基丁酸受体亚基α-1 GABRA1 TAR00309 13 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1 CHRM1 TAR00038 14 前列腺素G/H合酶2 PTGS2 TAR00094 15 转录因子AP-1 JUN,FOS TAR00414 16 磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基，γ亚型 PIK3CG TAR00491 17 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2 CHRM2 TAR00210 18 核受体共激活剂2 NCOA2 TAR03276 19 维甲酸受体RXR-alpha RARA TAR00158 2.2 EM相关靶点确认
利用人类基因数据库查找EM作用靶点，与七味中药有效成分对应靶点进行比对，发现红花所含相关靶点数量最多，达到103个；而桃仁、泽兰所含相关靶点数量最少，为14个（图1A）；王不留行所含相关靶点占有效成分作用靶点比例最高，为54.7%；而桃仁最低，为29.8%（图1B）。经过去重处理后，七味中药所含EM相关靶点共119个（supplementary materials table S3）。利用Cytoscape3.6.0软件进行成分－靶点网络分析，获得图2，其中共计216个节点，其中黄色节点为活血化瘀药有效活性成分，而蓝色节点代表EM相关靶点。利用软件自带分析功能，对于网络各节点度值进行分析，网络中某些节点度值较高，提示该节点为网络中的关键节点（supplementary materials table S4）。在各中药所含有效成分中，槲皮素展现出极高的连接度（度值=87），远超其他有效成分，而其余较高连接度值依次是木犀草素（度值=43）、山柰酚（度值=33）、黄芩素（度值=23）、丹参酮A（度值=20）、花生四烯酸（度值=20）、β-谷固醇（度值=18）。中药是一个多有效成分的复杂系统，一个有效成分可作用于多个靶点，协同作用于某种疾病的治疗。而在靶点的分析中，较高连接度的靶点可能在EM的治疗作用中起着重要的作用。前列腺素G/H合酶2(PTGS2，度值=82）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1，度值=39）两者拥有最高的度值，是临床上炎性疾病治疗的主要靶点；核受体辅活化子2（NCOA2，度值=35）、核受体辅活化子1（NCOA1，度值=34)紧跟其后，同样在各炎症通路中作用显著；凝血酶(度值=31）是临床上治疗出血的重要靶点，直接作用于血液凝固过程的最后一环；Mu-type阿片受体（OPRM1，度值=30）则涉及到中枢镇痛功能。上述靶点均和EM症状及病机之间有着密切的关系。
图 1 七味活血化瘀中药EM相关靶点数量及所占比例A.基于OB≥30%和DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点个数；B.基于OB≥30%、DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点的比例2.3 PPI网络的构建与分析
利用STRING软件构建靶点PPI网络，图中包含119个节点，505条边，所有节点平均度值为8.49，具体见图3。根据“度值>均值”筛选出PPI网络中关键节点56个（supplementary materials table S6），前9位关键节点，平均度值为88，见表2，与PPI网络74%节点存在相互作用关系，提示它们在网络调控中起着关键作用，可能是活血化瘀药物治疗EM的关键所在。
表 2 PPI网络中关键节点节点名称 度值 节点名称 度值 节点名称 度值 ALB 97 IL6 92 PTGS2 83 AKT1 95 TNF 86 CASP3 80 VEGFA 94 MAPK8 83 MAPK1 80 2.4 KEGG通路分析
利用KEGG数据库查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。整理各中药KEGG通路相关基因富集情况，发现七味中药共有信号通路44条（supplementary materials table S5），筛选出与EM密切相关的19条通路（表3）。从表3中，不难发现，19条通路涉及性激素、炎症、细胞调亡以及血管生成等各个方面，其中炎症相关通路达到7条，为所有通路中最多。利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图，根据图4可知，在系列通路中，泽兰与桃仁作用均弱于其他五味中药。而在PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路中，多味中药靶点存在高度富集，红花在PI3K-Akt信号通路中显著富集，远超该药其他通路，值得注意。
表 3 七味活血化瘀中药的19条KEGG通路序号 标识码 信号通路名称 类别 1 hsa04151 PI3K-Akt信号通路 炎症相关 2 hsa04668 TNF信号通路 炎症相关 3 hsa04657 IL-17信号通路 炎症相关 4 hsa04625 C型凝集素受体信号通路 炎症相关 5 hsa04064 NF-κB信号通路 炎症相关 6 hsa04115 p53信号通路 炎症相关 7 hsa00590 花生四烯酸代谢 炎症相关 8 hsa01522 内分泌抵抗 激素相关 9 hsa04915 雌激素信号通路 激素相关 10 hsa04919 甲状腺激素信号通路 激素相关 11 hsa04921 催产素信号通路 激素相关 12 hsa04210 细胞凋亡 细胞凋亡 13 hsa04071 鞘脂信号通路 细胞凋亡 14 hsa01521 EGFR酪氨酸激酶抑制剂拮抗 血管相关 15 hsa04370 VEGF信号通路 血管相关 16 hsa01521 血小板活化 血管相关 17 hsa04722 神经营养蛋白信号通路 疼痛相关 18 hsa04725 胆碱能突触 疼痛相关 19 hsa04726 血清素能突触 疼痛相关 3. 讨论
本研究采用网络药理学的研究方法，从TCMSP数据库中提取出了94个符合标准的成分，通过VENE图去重以及分析网络图的拓扑特性后，发现槲皮素为四味活血化瘀药所共有，与83种EM相关靶点存在关联。现代研究表明，槲皮素具有抑制炎症、血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖的作用，通过抗氧化作用诱导细胞凋亡，还可通过雌激素受体，调控受体下游多种底物及信号通路而调节雌激素[6-7]。木犀草素与41种EM靶点相关联，具有抗炎、抗纤维化、抑制血管生成等作用[8]。EM发生发展过程中慢性炎症反应一直贯穿始终，且存在纤维化病变，木犀草素或在EM治疗中有一定作用[9-10]。
通过VENE图，发现七味中药共有作用靶点19个，部分共有靶点与Cytoscape网络图以及PPI网络中关键节点高度对应，进一步强调了该部分共有靶点在EM中的作用。如PTGS2，该靶点所调控环氧合酶（COX-2）的高表达会导致细胞的高增殖性、高侵袭性，诱导血管生成从而加重EM的疼痛和不孕症状[11]。NCOA2、NCOA1的水平异常与EM的进展关联密切。趋化因子参与子宫内膜异位种植过程中趋化、黏附、侵袭、血管形成及细胞生长分化等多个重要环节[12]。Xiu等发现，在分泌期，NCOA1和趋化因子CXCL12在异位子宫内膜中的表达明显高于正常子宫内膜；活化血小板对异位内膜具有促炎、促血管生成的作用，促使异位内膜细胞的侵袭和增殖[13-14]，子宫内膜基质细胞可分泌F2，以密集依赖的方式诱导血小板活化和聚集，从而影响EM的进展[15-16] 。VEGFA可促进新生血管形成并使血管通透性增加，陈晓莉等[17]研究表明，内异症组血清和腹腔液VEGF水平明显高于对照组，且重度患者腹腔液中VEGF水平高于轻度患者，VEGF在EMT患者血管生成中起促进性作用,在血清与腹腔液中的高表达与疾病发生发展相关。尉伟东等[18]发现CASP3蛋白在异位内膜和在位内膜中的评分明显低于正常对照组，caspase-3的水平下降提示内膜细胞活性下降，促使子宫内膜细胞自发性凋亡增加以及凋亡信号敏感性增强，诱导或加重EM。
利用KEGG数据库，找到了七味活血化瘀药共有EM相关通路19条，涉及性激素、炎症、细胞凋亡以及血管生成等方面。所有通路中，炎症通路达到36%。其中PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路是靶点富集最多的通路，提示活血化瘀药主要通过抗炎作用来对EM起治疗作用。与正常女性相比，EM患者的子宫内膜在位和异位内膜细胞的PI3K表达增加，AKT磷酸化水平升高，证实PI3K/AKT信号通路可影响EM进展[19]。EM是一种雌激素依赖性疾病，呈现出慢性炎症反应，多种炎性因子参与其病理过程，包括NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-17等[20]。许丽华等[21]通过实验发现，EM患者血清及腹腔液中TNF-α水平显著高于对照组。EM患者Ⅲ和Ⅳ期血清和腹腔液中TNF-α水平均高于Ⅰ和Ⅱ期，证实了TNF-α与子宫内膜异位症的发生发展密切相关,有助于子宫内膜异位症的诊断。IL-1家族在EM发生发展中作用显著，与正常女性相比，EM患者静脉血中IL-1β浓度显著增高。不仅仅是IL-1β，研究显示，IL-1β前体蛋白（proIL-1β）也可以加重炎症反应，EM患者腹腔液中IL-1β、proIL-1β水平均高于健康女性。IL-1家族细胞因子的损伤，导致EM患者腹腔免疫机制的紊乱，局部以及全身IL-1β、IL-18调控机制的缺陷，使得内膜组织的侵袭性以及生长性大幅增加，从而导致EM[22-24]。炎症相关通路的高富集也与之前网络图中TNF、IL-6等炎性相关靶点的高度值相对应，进一步强调了活血化瘀药物通过抗炎作用治疗EM的作用机制。细胞凋亡是一种独特的程序性细胞死亡，细胞的有效清除而不会引起炎症反应，EM特征为异位内膜细胞凋亡率下降。与健康女性子宫内膜相比，EM异位内膜抗凋亡因子表达增加，促凋亡因子表达减少，证实了细胞凋亡在EM的发病中确有作用，并和炎症反应存在一定关联[25]。EM发生发展过程中亦伴随着血管生成增多以及局部病灶周期性出血，EM患者异位内膜血管内皮生长因子(VEGF)表达量增高，抗血管生成因子(sFlt-1)表达量下降，证实VEGF信号通路、血小板激活通路均参与此过程，与前面靶点分析也形成呼应[26-27] 。脑源性神经营养因子是各种慢性疾病中慢性疼痛形成和维持的调节因子，EM伴有疼痛的患者血清和腹膜液中神经营养因子浓度明显高于无疼痛EM患者[28]。利用KEGG通路分析，可以发现活血化瘀药对于炎症、凋亡、疼痛、血管生成等相关通路均具备调控作用，进一步强调了临床上活血化瘀药对于EM的治疗价值。
综上所述，活血化瘀中药可通过多靶点、多通路协同作用方式对EM进行治疗，体现了中医药治疗疾病特色。上述七味中药中，桃仁、泽兰对于EM的作用低于其余活血化瘀药，而红花、益母草在EM治疗体系中，EM相关靶点高于其余中药，可能会起到更好的疗效，在临床上可尝试推广使用。本研究从网络药理学角度出发，根据活血化瘀中药有效成分和作用靶点，在一定程度上对活血化瘀中药治疗EM进行了机制的解析，为指导临床用药提供了一定的依据。但本研究仅仅基于TCMSP数据库，利用计算机软件从理论上对活血化瘀中药治疗EM作用机制做了探析，还需要通过实验和临床实践来进一步证实，而且还需要扩大活血化瘀药物探究范围，结合临床实际，深入剖析活血化瘀药共同点与差异之处。
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表 1 TGC检测时间程序
时间（t/min） 流速（ml/min） 功能 LC1 LC2 辅助流动相 0.01～0.80 1.00 1.20 2.00 脑脊液样品于LC1中富集 0.81～3.49 1.00 1.20 0.01 目标物在LC1中初步分离 3.50～5.50 1.00 1.20 0.01 LC1与LC2串联，目标物洗脱至LC2 5.51～11.00 1.50 1.20 0.01 目标物在LC2中洗脱分离，清洗泵反向冲洗LC1 
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表 2 脑脊液中测定TGC浓度的精密度与准确度(%)
浓度（ng/ml） 日内（n=5） 日间（n=3） 准确度 RSD 准确度 RSD 225.0 100.31 ± 2.83 2.82 98.80 ± 0.95 0.96 450.0 104.58 ± 2.19 2.09 103.51 ± 2.72 2.63 900.0 106.51 ± 2.06 1.94 101.82 ± 4.28 4.20 64.5 105.04 ± 2.47 2.35 99.01 ± 2.05 2.08
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表 3 脑脊液中TGC在不同温度条件下的稳定性
样品浓度（ng/ml） 室温放置4 h 进样器放置6 h 反复冻融3次 冰冻放置1周 平均浓度（ng/ml） RSD（%） 平均浓度（ng/ml） RSD（%） 平均浓度（ng/ml） RSD（%） 平均浓度（ng/ml） RSD（%） 64.5 68.67 ± 2.93 4.27 65.52 ± 1.52 2.32 65.01 ± 1.43 2.20 68.56 ± 3.06 4.46 225 223.16 ± 5.06 2.27 221.62 ± 2.45 1.11 224.72 ± 4.50 2.00 222.99 ± 5.40 2.42 450 452.44 ± 9.11 2.01 459.04 ± 13.45 2.93 464.03 ± 8.39 1.81 459.68 ± 8.25 1.80 900 885.14 ± 15.09 1.70 881.32 ± 13.36 1.52 888.13 ± 13.80 1.55 899.79 ± 10.13 1.13
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