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脑卒中是当前国内首位致死致残疾病，其中缺血性脑卒中占所有卒中的70%[1]，严重危害人民身体健康。缺血性脑卒中发生后尽可能快的实现缺血半暗带再灌注是治疗的关键[2]，但再灌注会使缺血半暗带区域形成强烈的免疫激活和炎症损伤[3]，可能导致缺血性脑卒中急性损伤期的二次伤害并在远期预后上增加功能恢复难度[4]。日本学者研究显示，血管内治疗后仅有约1/7的患者有较好的90天预后[5]，在我国接受再灌注治疗的患者仍有约1/3会留有终身残疾[6]，因此对脑卒中后神经保护药物的研究显得越来越重要[7]。大量研究表明，神经保护药可通过多种途径抑制致病级联反应达到急性期治疗效果，如尼莫地平、依达拉奉等[8]；也可以在长期治疗和功能恢复中发挥重要作用，包括一些“老药”新用，如右美托咪定、半胱氨酰白三烯受体拮抗剂等[9]，特别是一些活血化瘀功效中药组方及成分，如灯盏生脉胶囊、白果内酯等的研究都取得了一定的进展[10]。课题组前期研究发现：中药红花（Carthami Flos）中的黄酮类化合物菸花苷能够通过促进自噬、抗氧化等对CIRI动物发挥急性期治疗效果[11, 12]，同时菸花苷长期给药可改善CIRI大鼠生存状态[13]，但到目前为止，菸花苷发挥长期保护作用的机制尚不明确。作为延续性工作，本实验重点研究了菸花苷长期给药对CIRI大鼠神经功能的影响，并运用转录组测序等方法对其作用机制进行了初步探索，旨在为将菸花苷应用于促进CIRI大鼠神经功能恢复提供更多实验支撑，也为从传统活血化瘀中药中开发神经保护药物提供借鉴。
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成年雄性Wistar大鼠，体重240±10 g，购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部，许可证号为SCXK（沪）2018-0006。大鼠购入后于学校药学系SPF级动物房内饲养，自由食水，人工照明模拟昼夜变化。实验操作严格遵守动物福利和伦理原则。
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菸花苷注射液和菸花苷空白对照制剂由苏中药业集团股份有限公司生产加工（批号：20200331），菸花苷含量10 mg/ml。Caspase-1多克隆抗体（22915-1-AP）、GSDMD多克隆抗体（20770-1-AP）、NLRP3单克隆抗体（68102-1-Ig）、ASC多克隆抗体（10500-1-AP）均购于武汉三鹰生物科技有限公司，重组Anti-Caspase-11抗体（EPR18628）购于Abcam公司，IL-18多克隆抗体（AF5207）购于碧云天生物科技有限公司。
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直钳、齿镊、线剪等手术器材（上海医疗器械有限公司）；MCAO线栓（250 ～ 280 g，北京西浓科技有限公司）；平衡木装置（江苏赛昂斯生物科技有限公司）；Morris水迷宫泳池及站台（上海玉研科学仪器有限公司）；高速冷冻离心机（3H16RI，湖南赫西仪器装备有限公司）；扫膜仪（Tanon-
5200 ，上海天能科技有限公司）。 -
大鼠饲养至体重270±15 g，采用随机数字表法将大鼠随机分为3组:其中模型组（M）和菸花苷组（Y）大鼠进行CIRI模型的建立，而假手术组（S）大鼠则无脑部损伤。造模后1 h，菸花苷组腹腔注射菸花苷注射液1 ml/kg[14]，模型组与假手术组腹腔注射菸花苷注射液空白对照制剂1 ml/kg，造模后常规饲养并在固定时间给药，第1周1次/日，1周后1次/2日持续至实验周期结束。
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采用MCAO/R法进行模型制备，参考文献并进行一定改进[15]，具体方法如下：术前4 h禁食水，用1%戊巴比妥钠（4 ml/kg，生理盐水配制）腹腔注射麻醉。手术部位常规备皮消毒，仰卧位，将大鼠四肢与前牙用皮筋固定于手术台板。沿颈部正中线作2 cm纵行切口，从气管偏右侧（大鼠的左侧）沿肌纤维走行向下分离，至颜色深红且明显搏动的左颈总动脉，沿该血管向上至颈总动脉分叉，近气管侧为颈外动脉，另一侧即为线栓需要进入的颈内动脉。在距分叉1.5 cm处结扎左颈总动脉近心端，用动脉夹锁闭颈内动脉及颈外动脉近心端。用眼科剪在颈总动脉近心端距分叉口1 cm处剪一斜行小口，将线栓插入左颈总动脉，用缝合线略微固定于颈总动脉，撤掉颈内动脉近心端动脉夹，将线栓缓慢深入颈内动脉直至明显阻力时停止深入（18 ～ 20 mm），撤掉颈外动脉近心端动脉夹并将固定线栓的缝合线牢固打结，逐层缝合结缔组织和皮肤。术后将大鼠放于保温垫上保持其体温至苏醒放入笼中，术后1 h根据分组腹腔注射给药，待大鼠完全苏醒后观察大鼠右前肢无法完全伸展，且大鼠行走时向右侧倾倒或前进时向右侧转圈，此即标志造模成功。术后2 h使用初次剂量1/3的1%戊巴比妥钠进行二次麻醉，将线栓向外抽出1.5 cm形成大脑缺血再灌注损伤。假手术组仅分离血管，不插入线栓。
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在第2、4、8周进行3轮悬尾偏转实验[16]。将大鼠尾中段处固定在距地面垂直高度30 cm的实验架上，分别记录大鼠头部及躯干向左、右两侧偏转的次数，偏离中轴线10°以上计为偏转1次，每轮实验记录10次。正常大鼠会随机向左侧或者右侧进行偏转并试图攀爬，而CIRI大鼠由于一侧肢体的偏瘫及肌力减弱，向另一侧进行偏转的几率会大大提高。
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在第2、4、8周进行3轮平衡木实验[17]。取长2 m、宽2.5 cm、距地面高度50 cm的木条为平衡木，一端为大鼠躲避处放置黑色方盒，另一端为大鼠起步处。每轮实验测试前每只大鼠训练3次，每次间隔2小时；训练完毕后观察大鼠从起步处经过平衡木进入躲避处的过程，记录大鼠通过平衡木的情况并按以下标准进行打分。
平衡木评分标准 得分 通过平衡木，无踩空、跌倒 0分 通过平衡木，踩空、跌倒机会小于50% 1分 通过平衡木，踩空、跌倒机会大于50% 2分 通过平衡木，对侧后肢出现拖行 3分 不能通过平衡木，但能保持平衡不摔落 4分 不能在平衡木上保持平衡，伴有摔落 5分 -
由同一名操作人员在第2、4、8周进行3轮水迷宫实验[18]。本实验使用直径1.8 m的圆形水池，水温25±2 ℃，站台为高0.4 m、直径12 cm的圆形板，水深约0.43 m，即水位高度超过站台平面约3 cm，并在池壁四个方位上方1 m高处悬挂显著的远距离视觉参照物。每轮前5天站台放于池中固定位置，大鼠入水后找寻并记忆站台位置，第6天撤掉站台进行空间探索实验测试大鼠的空间记忆能力，记录大鼠在90 s内穿过之前站台位置的次数。
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8周后脱颈处死大鼠，断头取脑，吸除表面水分后将脑组织冷冻硬化，切除嗅球、脑干、小脑等部位，将大脑切成厚度均等的6片，放入2% TTC染液37 ℃水浴染色10 min，4%多聚甲醛溶液固定5 min后拍照，白色或缺如则计为梗死萎缩区，正常组织显示为红色部分。利用ImageJ软件进行图像处理，按公式计算梗死萎缩区体积百分比=[（患侧梗死体积+萎缩体积）/健侧半脑体积]×100%，其中萎缩体积=健侧半脑体积−患侧半脑体积。
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造模8周后，提取总RNA，在RNA总量超过1 μg的基础上，以浓度超过35 ng/μl的标准，进行库的建立，并确保OD 260/280≥1.8，OD 260/230≥1.0。分离所需的mRNA后加入碎片缓冲液，使mRNA随机分裂为300bp的小片段。反转录合成cDNA，利用PCR技术扩增15 cycles，2%琼脂糖胶回收目的条带并进行精确定量，借助cBot系统通过大规模分子簇的方式达到荧光信号检测强度，IlluminaNovaseq6000平台测序，读长控制在2×150 bp。对所得数据库数据进行筛选过滤，基因差异表达分析。
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采用Western-blot法检测各组大鼠脑组织缺血半暗带中Caspase-1、Caspase-11、GSDMD-N、NLRP3、ASC、IL-18蛋白表达。参考相关文献取缺血半暗带区域作为样品[19]，取适量样品加入RIPA裂解液进行研磨裂解，12 000 r/min、4 ℃离心取上清液，BCA法定量蛋白浓度，浓度均一化后进行蛋白变性作为待测样品。经电泳、转膜、漂洗、封闭、漂洗，一抗（Caspase-1，1∶10 000、Caspase-11,1∶4 000、GSDMD,1∶800、NLRP3,1∶800、ASC,1∶10 000、IL-18，1∶1 000、GAPDH，1∶15 000）4 ℃孵育16 h，漂洗后二抗（1∶15 000）25 ℃孵育1 h，再次漂洗后加入ECL发光液，在凝胶成像分析系统中成像。
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取大鼠脑组织10 mg加入适量PBS溶液，研磨后低温离心取上清液，按照ELISA试剂盒说明书配置梯度浓度标准品溶液，按顺序滴加样品及各反应液，显色反应终止后，使用酶标仪测定450 nm处OD值，根据标准曲线计算各样品IL-1β、IL-18浓度。
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应用ImageJ软件对脑组织TTC切片的照片、Western-blot图片进行图像处理，统计学分析及数据处理使用GraphPad Prism 8.0.1进行。实验数据采用（
$\bar {\mathrm{X}} $ ±SE）表示，大鼠神经行为学数据使用双因素方差分析，TTC切片及Western-blot数据应用单因素方差分析方法， P<0.05表示差异有统计学意义。 -
在第2、4、 8周对大鼠的神经功能进行多角度评价，其中悬尾偏转实验中模型组大鼠的对侧偏转率明显高于菸花苷组（P<0.000 1）（图1A）；平衡木实验中模型组大鼠的评分始终高于菸花苷组（P<0.05）（图1B）；水迷宫实验中模型组大鼠90 s时间内穿台次数明显少于菸花苷组（P<0.05）（图1C）。以上实验显示菸花苷长期给药能够一定程度上改善CIRI大鼠的偏瘫及肌力减弱情况，提高肢体平衡性、空间学习和记忆能力。
图 1 造模后第2、4、8周大鼠神经功能评价
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TTC染色显示模型组大鼠脑组织明显变小且左侧萎缩缺如体积超60%（P<0.01）；菸花苷组大鼠脑梗死萎缩体积同模型组相比减少约25%（P<0.01）（图2A、2B、2C）。提示CIRI长期发展会导致大鼠脑组织梗死萎缩，菸花苷长期给药能减轻大鼠脑组织梗死萎缩状况。
图 2 造模8周后大鼠脑组织外观
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以总表达量为基础，利用TPM进行数据分析，以 |log2fc|>1， p adjust<0.05为显著差异标准，统计分析组间的差异基因（DEGs）。模型组对假手术组DEGs
2816 个，其中上调1900个，下调916个；菸花苷组对模型组DEGs 1 546个，其中上调343个，下调1 203个；具有反转效应的DEGs 1 416个，其中上调290个，下调1 126个（图3A、3B）。
图 3 转录组测序组间DEGs
分析1 416个反转效应DEGs，基因数在前20位的GO功能注释条目与生物学过程（BP）和细胞组成（CC）相关的基因较多，主要参与生物调节、细胞过程、细胞组分（图3C）。通过KEGG功能富集分析，发现1 416个DEGs主要富集在NOD样受体信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、Toll样受体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等通路中（图3D），其中NOD样受体信号通路是显著性最高的信号通路，参与细胞炎症、细胞死亡过程的重要通路之一。
如表1所示， NOD样受体信号通路中GSDMD、IL-18、NLRP3等基因富集度较高，而这些基因在细胞焦亡过程均有参与，结合图3A中所标注的焦亡相关基因表达情况，推测脑缺血再灌注损伤可能与细胞焦亡有关，且菸花苷可能对细胞焦亡过程产生一定的抑制作用。
表 1 菸花苷治疗CIRI大鼠KEGG筛选的通路和富集基因
通路名称 通路显著性（P值） 富集基因 NOD样受体信号通路 6.05×10−7 NF-κB、IL-18、Caspase8
NLRP3、GSDMD、Caspase4肿瘤坏死因子受体信号通路 1.12×10−6 NF-κB、p38、Bcl3、TNFR1、
TNFR2、Ccl2、、Caspase8Toll样受体信号通路 3.66×10−6 NF-κB、p38、Caspase8
TLR3、TLR4、TLR7丝裂原活化蛋白激酶信号通路 5.73×10−6 NF-κB 、P38、TNFR、IL-1R -
根据转录组数据结果，采用Western-blot方法检测脑缺血半暗带中Caspase-1、Caspase-11、GSDMD-N、NLRP3、ASC、IL-18蛋白的表达情况（ASC的基因型为PYCARD，Caspase-11与Caspase-4同源）。结果显示模型组表达水平显著高于假手术组（P<0.01），菸花苷组显著低于模型组（P<0.05）（图4）。提示菸花苷长期给药能够降低CIRI大鼠细胞焦亡相关蛋白的表达量。
图 4 大鼠脑组织焦亡相关蛋白表达情况
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利用ELISA法对炎症因子IL-1β、IL-18进行了测定，结果显示模型组IL-1β、IL-18释放量相较于假手术组明显增加（P<0.001），菸花苷组IL-1β、IL-18释放量比模型组明显降低（P<0.05）。表明菸花苷能够抑制因CIRI导致的脑组织炎症因子IL-1β、IL-18释放量升高。
图 5 大鼠脑组织炎症因子IL-1β、IL-18释放量
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目前神经保护药物的实验研究更多集中于缺血性脑卒中的急性损伤期治疗，对缺血性脑卒中长期治疗和慢性恢复的研究相对较少[20]。本实验以菸花苷对CIRI大鼠的长期治疗和功能恢复研究为重点，对CIRI大鼠神经运动能力及脑组织外观形态进行了观察分析，结果表明，菸花苷能显著改善CIRI大鼠的神经运动功能，提高长期治疗和功能恢复效果，明显减少脑梗死萎缩体积，抑制脑缺血后梗死区域进一步扩大并改善梗死区域坏死萎缩的状况。
缺血性脑卒中涉及到细胞凋亡、铁死亡和细胞焦亡等多种病理机制[21]，其中细胞焦亡是一种依赖半胱天冬酶（caspase）的炎症性细胞死亡形式，在缺血性脑卒中神经损伤中扮演了重要角色[22]。细胞焦亡过程中GSDMD蛋白被活化caspase剪切为具有活性的GSDMD-N， GSDMD-N聚合并在细胞膜上形成孔道导致细胞膜破裂伴随细胞内IL-1β、IL-18等炎症因子释放增加[23]，进一步促进炎症反应的发生和神经细胞的死亡。有研究表明，通过抑制细胞焦亡可以有效促进CIRI后的神经功能恢复[24, 25]。本实验首次将菸花苷促进缺血性脑卒中的长期恢复与其抑制细胞焦亡联系起来，利用转录组测序及蛋白免疫印记等方法对细胞焦亡相关基因和蛋白的表达水平进行了测定，数据显示菸花苷能够降低NOD样受体信号通路中细胞焦亡关键基因的表达量并使焦亡相关蛋白的表达水平以及炎症因子的释放量明显下降，表明菸花苷能够抑制细胞焦亡及其引起的炎症反应。
综上，菸花苷能减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，显著促进CIRI大鼠的长期功能恢复，该作用可能与抑制大鼠脑组织细胞焦亡有关。随着对菸花苷治疗缺血性脑卒中研究的不断深入，其对缺血性脑卒中缺血再灌注损伤的长期保护作用及机制将被进一步阐释。
Effects of long-term administration of nicotiflorin on neurological function in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury
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摘要:
目的 探讨菸花苷长期给药对脑缺血再灌注损伤（CIRI）大鼠神经功能恢复的促进作用。 方法 建立CIRI模型，梗阻1 h后腹腔注射给药，持续给药8周，并在第2、4、8周进行悬尾偏转实验、平衡木实验及水迷宫实验，8周后TTC染色观察大脑梗死萎缩体积，用转录组测序筛选差异基因（DEGs）并分析富集通路，采用Western-blot法和ELISA法对细胞焦亡相关蛋白及炎症因子IL-1β和IL-18进行了测定。 结果 菸花苷长期给药能显著降低CIRI大鼠的对侧偏转率和平衡木实验评分，提高水迷宫实验中的穿台次数（P<0.05），减小脑梗死萎缩体积（P<0.01），对大鼠神经功能的恢复有明显促进作用。转录组测序发现，菸花苷组大鼠脑组织中细胞焦亡相关信号通路中的基因表达显著下调（P<0.05）， Western-blot和ELISA实验显示，菸花苷降低了caspase-1、GSDMD-N等焦亡相关蛋白的表达水平，同时，炎症因子IL-1β、IL-18的释放量明显降低（P<0.05），表明菸花苷能够抑制细胞焦亡这一炎性过程。 结论 菸花苷对CIRI大鼠神经功能恢复具有长期促进作用，该作用可能与菸花苷能够抑制细胞焦亡有关。 Abstract:Objective To explore the promoting effect of long-term administration of nicotiflorin on the recovery of neurological function in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury （CIRI）. Methods The CIRI model was established and nicotiflorin was injected intraperitoneally after 1 hour of obstruction for 8 weeks. Tail suspension deflection experiment, balance beam experiment and water maze test were performed in the 2nd, 4th and 8th weeks. After 8 weeks, TTC staining was used to observe the volume of infarct atrophy, transcriptome sequencing was employed to screen differential expressed genes （DEGs） and highly enriched pathways were analyzed, Western-bloting and ELISA were used to assess proteins expression related to the pyroptosis pathway and inflammatory cytokines IL-1β and IL-18. Results By long-term administration of nicotiflorin, the contralateral deflection rate were significantly reduced and beam experiment score of CIRI rats was balanced, the number of crossing the platform in water maze test was increased （P<0.05）, the volume of cerebral infarction atrophy was decreased （P<0.01）, which significantly promoted the recovery of neurological function in rats. Transcriptome sequencing found that the expression of genes in the pyroptosis-related signaling pathways in the brain tissue of rats in the nicotiflorin group was significantly down-regulated （P<0.05）. Western-blot and ELISA experiments showed that nicotiflorin reduced the expression levels of caspase-1 and GSDMD-N and other pyroptosis-related proteins, and at the same time, the release of inflammatory factors IL-1β and IL-18 was significantly reduced （P<0.05）, indicating that nicotiflorin could inhibit the inflammatory process of pyroptosis. Conclusion Nicotiflorin exhibited a significant long-term promotion effect on the recovery of neurological function in CIRI rats, which potentially attributed to its ability to inhibit pyroptosis. -
卡培他滨是一种新型的氟尿嘧啶类口服药，它是5-氟尿嘧啶（5-FU）的前体药物。卡培他滨口服给药方便、依从性好、疗效确切，是治疗结直肠癌的基石药物，但在治疗过程中产生的不良反应（手足综合征等）极大地影响了患者的治疗。手足综合征（HFS）是卡培他滨引起的不良反应中较为特殊的反应，也是卡培他滨在治疗过程中的药物剂量限制性不良反应，主要表现为皮肤红肿、水泡、出血、疼痛。合并使用环氧合酶、尿素霜、维生素B6、奥美拉唑也不能完全阻断手足综合征的发生[1-3]；合并使用中草药如白芍、桂枝、甘草等可降低手足综合征的发生率[4]。口服卡培他滨的患者手足综合征发生率高达60%[1]，严重降低患者用药依从性，严重手足综合征（约17%）的患者只能减少药物摄入量乃至停止服用药物，影响化疗按期、足量进行[5-6]。明确手足综合征的发生机制和有效干预对卡培他滨安全有效的应用具有重要价值。目前手足综合征模型的建立还没有统一的金标准，本实验尝试用ICR小鼠灌胃卡培他滨后建立手足综合征模型，为卡培他滨致手足综合征模型的建立及机制研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 动物与药品
雄性ICR小鼠，SPF级，5周龄左右，共42只小鼠，小鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。经上海中医药大学动物伦理委员会批准，实验动物伦理审查号为PZSHUTCM210715004。将小鼠随机编号1~42号，对照组ICR小鼠6只，实验组ICR小鼠36只。卡培他滨（商品名希罗达，上海罗氏制药有限公司，规格：0.5 g/片，国药准字号H20073024）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）(国药集团)；离心管（Titan公司）；动物解剖手术器材（瑞沃德公司）；消毒酒精、棉花球、锡箔纸（国药集团）。
1.2 饲养条件与环境
造模前小鼠先饲养1周，保证充足的水源与饲料，42只ICR小鼠自由摄取食物，环境湿度保持区间50%~60%（±5%），控制温度在(23±1) ℃，调节光照为12 h（6: 30至18: 30光照），其余时间为光暗周期。定期观察小鼠培养环境，定期为小鼠更换垫料，清理排泄物。
1.3 给药剂量、方式及周期
卡培他滨0.5 g/片，溶解于10 ml CMC-Na（0.5%）中，制得50 mg/ml悬浊液备用。实验组ICR小鼠（36只），灌胃给药，按275 mg/kg（即小鼠0.15 ml/30g）连续灌胃14 d，2次/d（按照卡培他滨临床给药方案1 250 mg/kg，2次/d的剂量换算）。对照组ICR小鼠（6只），灌胃给予CMC-Na（0.5%）溶液，按照4 ml/kg剂量连续的灌胃14 d，2次/d。
1.4 手足综合征阳性判断标准
1.4.1 小鼠手足综合征观察
取ICR小鼠的后足跖部皮肤组织，用生理盐水冲洗并擦干，以多聚甲醛（4%）对小鼠组织进行固定，石蜡包埋切片，使用苏木精-伊红对小鼠组织染色（H&E染色），使用普通光镜（比例尺5 μm）检测（注：染色呈现蓝色的为表皮层，该层位于淡粉色的角质层和淡蓝色的真皮层之间）。每天肉眼观察，若小鼠出现足跖部特征性改变，立即拍照并记录手足综合征发生时间，每3 d拍照记录小鼠足跖部皮肤变化情况。
1.4.2 小鼠体重观察
实验组与对照组自由饲养1周后称重，记录原始体重，灌胃给药后每3 d对所有实验小鼠称重一次并记录体重变化。
1.4.3 手足综合征阳性参考标准
标准参考美国国家癌症研究所（NCI）关于手足综合征的分级规定，建模实验中若实验小鼠足跖部的皮肤呈现了红色斑块、组织肿胀、角质层脱屑、溃疡、角质层厚度明显增加及其他明显体征者均可判定为手足综合征阳性。
1.5 样本收集方案
1.5.1 手足综合征阳性ICR小鼠的血浆和足趾部皮肤组织样本制备
对于手足综合征阳性的小鼠，在出现手足综合征后，经眼眶采样，用1.5 ml离心管（肝素钠抗凝）取血约0.5 ml，12 000 r/min离心10 min，收集血浆约0.25 ml，置于−80 ℃冰箱冷冻保存。采集小鼠血样后按照实验动物伦理要求规范处死小鼠，用手术剪取小鼠手足部皮肤，生理盐水冲洗后用锡纸包裹住样本并标号。所有样本置于−80 ℃冰箱冷冻保存，所有操作在1 h内完成。
1.5.2 手足综合征阴性ICR小鼠的血浆和足趾部皮肤组织样本制备
小鼠经过14 d给药未出现手足综合征阳性反应，则认定该类小鼠为造模失败小鼠，在第15天对该类小鼠统一进行眼眶采血和足趾部皮肤组织样本收集，方法同“1.5.1”。对照组小鼠在第15天收集样本，方法同“1.5.1”。
1.6 统计分析
数据采用平均值±标准差（mean±SD）表示，组与组之间根据数据分布状态比较采用学生t检验或秩检验，P<0.05认为有统计学差异。制图采用Excel或Graphpad 8.0软件。
2. 结果与讨论
2.1 小鼠体重变化及生存状态
通过对比对照组与实验组ICR小鼠体重变化，发现对照组ICR小鼠，灌胃14 d后，体重明显增加；而实验组ICR小鼠，灌胃14 d后，体重明显降低。表1和图1 为14 d内ICR小鼠的体重变化，实验过程中实验组小鼠死亡3只。
表 1 实验周期内小鼠体重变化情况（m/g，$ \bar{x}\pm s $ ）组别 n 0 d 7 d 14 d 对照组 6 28.54±0.71 32.56±0.88 34.66±1.07 实验组 33 29.07±0.76 26.84±1.74*** 23.15±2.31*** *** P<0.001，与对照组比较。 2.2 小鼠手足综合征病理观察
与对照组ICR小鼠相比，19只实验组小鼠的足底皮肤明显出现红斑、肿涨并出现少许水泡（图2），认为该小鼠出现手足综合征，按照伦理要求将小鼠处死，收集足底皮肤组织样本和血浆样本。
2.3 小鼠足底皮肤H&E染色
将ICR小鼠四肢皮肤用4%多聚甲醛固定后进行H&E染色（因苏木精呈碱性，细胞核内的染色质与胞质内的核酸显紫蓝色；伊红呈酸性，细胞质和细胞外基质中的成分显红色），如图3显示。与正常ICR小鼠相比，手足综合征阳性小鼠皮肤表皮层增厚，角质层呈现粉红色，真皮层呈现浅蓝色，表皮层处在二者之间呈现蓝色。发生HFS小鼠皮肤颗粒层变薄，基底层和棘层间细胞数量减少。正常小鼠角质层明显较薄。
2.4 小鼠手足综合征发生率
ICR小鼠共39只（对照组6只，实验组33只），19只实验组ICR小鼠出现手足综合征阳性症状，发生率为57.58%。实验组ICR小鼠灌胃给药1周，出现手足综合征阳性小鼠与未出现手足综合征小鼠相比：实验组小鼠足底皮肤颜色变深（深红色），少量小鼠四肢掌心有透明水泡样组织出现；在灌胃给药10 d后，实验组小鼠出现手足综合征阳性症状，四肢出现了红斑、脱屑、水泡（红斑出现最多，脱屑其次，水泡最少）等情况。
2.5 卡培他滨及其代谢产物暴露浓度分析
将收集的血浆样本按照前期报道的方法进行卡培他滨及其5种代谢产物（5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、去氧氟尿苷、5'-氟-2'-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮[7]）定量（ng/ml，mean±SD）。结果发现，发生手足综合征小鼠与未发生手足综合征小鼠相比，卡培他滨浓度(ng/ml)分别为(58.08±44.54)和(39.23±26.98)，5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷浓度(ng/ml)分别为(
6047.42 ±3331.94 )和(4442.77 ±2140.44 )，去氧氟尿苷浓度(ng/ml)分别为(2899.28 ±1821.15 )和(2018.81 ±1037.86 )，5'-氟-2'-脱氧尿苷浓度(ng/ml)分别为(112.89±36.85) 和(122.23±19.16)，5-氟尿嘧啶浓度(ng/ml)分别为(46.86±23.08)和(38.33±20.62)，5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮浓度(ng/ml)分别为(24.45±14.79)和(27.34±17.84)。卡培他滨及其代谢产物在发生和未发生手足综合征小鼠体内暴露水平均无明显差异（P>0.05，图4）。
图 4 卡培他滨及其代谢产物暴露浓度分析注：Cap：卡培他滨；5-DFCR：5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷；5-DFUR：去氧氟尿苷；2-DFUR：5'-氟-2'-脱氧尿苷；5-FU：5-氟尿嘧啶；FUH2：5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮。3. 讨论
体内药物暴露水平同药物疗效和不良反应密切相关。目前药物暴露水平常用的参数有曲线下面积（AUC）、稳态浓度（css）、峰浓度（cmax）、谷浓度（cmin）等。有研究发现[8]，根据5-FU的AUC调整给药剂量后，患者血液系统出现3~4级不良反应发生率从之前的17.5%下降为 7.6%（P<0.05），黏膜炎的发生率也从5%降低为0%（P<0.01），总生存时间显著增加，从原来的16个月延长到22个月（P<0.01）。因此，5-FU在体内浓度可能成为预测疗效及不良反应的潜在预警生物标志物之一[9-10]。本研究中未发现卡培他滨及其代谢产物同手足综合征具有相关性，但Daher Abdi在20名75岁以上老年患者中发现，卡培他滨及其代谢产物在发生手足综合征患者体内暴露水平明显较高[11]，但体外研究表明，5-FU同手足综合征无明显关联[12]。另有研究表明，手足皮肤局部较高表达的胸苷磷酸化酶可产生局部较高浓度的5-FU，同卡培他滨引发的手足综合征密切相关[13]。总之，卡培他滨引发手足综合征的机制仍需进一步研究。
在卡培他滨致手足综合征模型的建立方面，黎鹏等灌胃给予SD大鼠200~400 mg/d，2次/d，用药1~2周（1周后停药3 d），建立了卡培他滨致手足综合征模型，并认为200 mg/kg的剂量，灌胃2周可较好地建立手足综合征模型（造模成功率77.5%）[14]。但有研究显示，卡培他滨在大鼠体内的代谢过程与人体不同，因大鼠体内胞苷脱胺酶活性较低，5-DFCR通过糖基化生成其他产物，产生的5-FU较少，而卡培他滨在小鼠体内的代谢过程与人体基本相同，可能是最好的动物模型[15-16]；Hiromoto [3]等利用ICR小鼠，灌胃给予200 mg/kg，1次/d，5次/周的方法建立手足综合征模型，3周建立手足综合征模型，但成功率未报道。He和Chen等给予ICR小鼠灌胃200 mg/kg，1次/d，连续灌胃30 d后，6只小鼠中仅有1只未发生手足综合征[17]。前期预实验中，采用灌胃200 mg/kg，2次/d的方法在ICR小鼠上建立手足综合征模型，灌胃1周后，6只小鼠仅有1只发生手足综合征。因此，根据临床卡培他滨用药剂量（1 250 mg/kg，2次/d）换算小鼠剂量为275 mg/kg，2次/d，既缩短了给药时间，又提高了建模成功率（57.6%），且较少有小鼠死亡（3只）。
4. 小结
本实验成功建立了卡培他滨致手足综合征的ICR小鼠模型，在给药时长、造模成功率方面均有一定优势。卡培他滨及其代谢产物在小鼠体内暴露浓度同手足综合征发生可能无关。手足综合征的发生机制仍需进一步研究。
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图 1 造模后第2、4、8周大鼠神经功能评价
A.大鼠悬尾垂吊实验中大鼠对侧偏转率；B.大鼠在平衡木实验中评分；C.大鼠水迷宫实验中90 s内通过原站台位置的次数n=10；**P<0.01，**P<0.01，****P<0.000 1，与假手术组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.000 1，与模型组比较。
图 2 造模8周后大鼠脑组织外观
A.大鼠完整脑组织外观形态图；B.大鼠大脑切片TTC染色图；C.大鼠脑组织梗死体积n=6；****P<0.000 1，与假手术组比较；##P<0.01，与模型组比较。
图 4 大鼠脑组织焦亡相关蛋白表达情况
A.NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD-N、ASC、IL-18蛋白条带；B.NLRP3 蛋白相对表达量；C.Cas-1 蛋白相对表达量；D.Cas-11 蛋白相对表达量；E.GSDMD-N蛋白相对表达量；F.ASC蛋白相对表达量；G.IL-18蛋白相对表达量n=4； **P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1，与假手术组比较；#P<0.05，##P<0.01，，###P<0.001与模型组比较。
图 5 大鼠脑组织炎症因子IL-1β、IL-18释放量
A.炎症因子IL-1β的释放量；B.炎症因子IL-18的释放量n=5； ***P<0.001,与假手术组比较；#P<0.05，与模型组比较。
平衡木评分标准 得分 通过平衡木，无踩空、跌倒 0分 通过平衡木，踩空、跌倒机会小于50% 1分 通过平衡木，踩空、跌倒机会大于50% 2分 通过平衡木，对侧后肢出现拖行 3分 不能通过平衡木，但能保持平衡不摔落 4分 不能在平衡木上保持平衡，伴有摔落 5分 
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表 1 菸花苷治疗CIRI大鼠KEGG筛选的通路和富集基因
通路名称 通路显著性（P值） 富集基因 NOD样受体信号通路 6.05×10−7 NF-κB、IL-18、Caspase8
NLRP3、GSDMD、Caspase4肿瘤坏死因子受体信号通路 1.12×10−6 NF-κB、p38、Bcl3、TNFR1、
TNFR2、Ccl2、、Caspase8Toll样受体信号通路 3.66×10−6 NF-κB、p38、Caspase8
TLR3、TLR4、TLR7丝裂原活化蛋白激酶信号通路 5.73×10−6 NF-κB 、P38、TNFR、IL-1R
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