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急性冠脉综合征(ACS)病理基础是冠状动脉粥样硬化斑块破裂或侵袭，继而形成不同程度的阻塞性血栓，抗血小板治疗是其治疗的基础，可降低患者血栓事件的发生率[1]。目前我国临床上普遍使用的口服抗血小板药物包括氯吡格雷和替格瑞洛，这类药物通过抑制血小板表面的ADP P2Y12受体发挥作用。研究表明与氯吡格雷相比，替格瑞洛可降低心血管死亡的发生率且不会增加主要致命性出血的风险[2]。近年来国内外相关指南将替格瑞洛推荐作为急性冠状动脉综合征抗血小板治疗的一线用药，尤其对非ST段抬高型ACS患者建议首选替格瑞洛联合阿司匹林进行抗血小板治疗[3-7]。
替格瑞洛虽不受CYP2C19基因多态性影响，但文献报道与替格瑞洛转运受体、作用靶点以及血小板膜受体相关的基因多态性（如SLCO1B1、UGT2B7、P2Y12、PEAR1、ITGA2B、ITGB3等）可能会影响其某些药动学参数以及药效[8-13]。相关基因多态性是否会影响替格瑞洛在中国ACS患者体内的抗血小板效果尚不清楚。本研究收集ACS患者病例，通过全外显子测序法探讨与替格瑞洛有关的转运蛋白、作用靶点以及血小板膜表面受体相关编码基因的多态性，分析基因多态性与替格瑞洛体内抗血小板聚集效果的相关性，为替格瑞洛的临床个体化用药提供参考。
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选取2018年3月至12月于福建省某三甲医院给予替格瑞洛常规治疗的ACS患者。纳入标准：①诊断为ACS的患者；②年龄≥18周岁，男女不限；③PCI术后阿司匹林100 mg 一天一次、替格瑞洛90 mg一天两次双联抗血小板治疗至少维持1年；④入院后常规给予替格瑞洛抗血小板治疗至少7 d；⑤同意签署知情同意书。排除标准：①免疫缺陷性疾病病史，包括HIV检查结果阳性；②乙肝表面抗原（HBsAg）或丙肝检查结果阳性；③长期使用CYP3A诱导剂、治疗窗狭窄的CYP3A底物、CYP3A抑制剂；④肝功能异常和肾功能异常；⑤收缩压>180 mmHg或舒张压>110 mmHg；⑥存在以下情况：如一个月内进行过大手术，患有中重度肝病，活动性出血，既往颅内出血史，过去6个月内的消化道出血，超敏反应等。
用药方案：入院后常规接受阿司匹林100 mg一天一次、替格瑞洛90 mg一天两次双联抗血小板治疗。
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采集：患者口服替格瑞洛至少7 d后收集清晨空腹静脉血样2.7 ml，测定给药后的ADP血小板聚集率；与上述同一时间采集静脉血样4 ml测定基因。
药物基因组学（PG）血样处理及保存：血样采集后，若无法立即处理，可室温放置8 h，或先置于4 ℃冰箱保存24 h；血样离心条件：7500 r/min，4 ℃，10 min。下层血细胞用滴管移至冻存管中，平均分装成2份（set 1和set 2），贴PG标签。冻存管需标注研究对象信息，统一标注为药物-患者PG-set1/2编号-时间点；冻存管保存于−70 ℃冰箱，待基因检测。
药物效应动力学（PD）血样处理及保存：血样采集后需在10 min～4 h内进行血小板聚集率检测。
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提前制备好富血小板血浆（PRP）、贫血小板血浆（PPP）及ADP诱导剂，放置于−20 ℃冰箱内，实验前5 min复溶备用，每支仅使用1次。通过LBY-NJ4血小板聚集仪（北京泰利康信科技有限公司）检测血小板聚集率。
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依照海普洛斯实验标准处理流程，对收集的血样进行质检、核酸提取、文库制备和上机测序。再依照海普洛斯数据分析标准处理流程，对原始数据进行质控，参考序列比对，去重复，检测以及对变异结果进行下游分析。最后，利用卡方检验原理验证哈迪-温伯格平衡 (HWE)。P>0.05认为符合HWE。应用在线软件SHEsis (http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php) 进行连锁不平衡（LD）分析，D'>0.8且r2>0.8提示两位点间存在明确连锁不平衡。
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①一般资料：性别、年龄、身高、体质量、BMI、吸烟史、饮酒史等；②患病类型：ST段抬高型急性冠脉综合征(STE-ACS)、非ST段抬高型急性冠脉综合征(NSTE-ACS)；③合并疾病：高血压、糖尿病、高脂血症等；④生化指标：血红蛋白含量、血小板计数、凝血四项、血脂等；⑤联合用药：他汀类（Statins）、β-受体拮抗剂(β-blocker)、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)、质子泵抑制剂(PPI)等。
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数据统计分析使用SPSS 24.0软件；计量资料数据用均数±标准差(
$ \bar x \pm s $ )表示，计数资料数据用百分比表示；两组间参数比较采用独立样本t检验，多组间参数的比较采用单因素方差分析，若P<0.05，认为存在显著性差异；将单因素分析中P<0.1的变量进行多因素分析；采用调整混杂因素的线性回归法预测影响替格瑞洛体内抗血小板效果的独立遗传变量。 -
本研究共纳入符合要求的受试者75例，63例男性，12例女性，平均年龄为（60.37±11.70）岁，平均体质量指数(BMI)值为（24.48±3.66）kg/m2。表1列出了75例患者的患病类型、合并疾病以及合并用药情况。
表 1 75例急性冠脉综合征患者的临床特征（n=75）
临床因素 均数($ \bar x \pm s $) 例数（n，%） 临床因素 均数($ \bar x \pm s $) 例数（n，%） 患病类型 凝血酶原时间（sec） 11.20±1.46 NSTE-ACS 46（61.3） 凝血酶时间（sec） 18.07±1.67 STE-ACS 29（38.7） 活化部分凝血活酶时间（sec） 28.20±4.07 合并疾病 国际标准化比值（INR） 0.99±.060 糖尿病 24（32.0） 糖化血红蛋白(%) 6.49±1.54 高血压 41（54.7） 合并用药 高脂血症 40（53.3） 质子泵抑制剂 75（100） 吸烟 43（57.3） 他汀类 75（100） 实验室指标 β-受体阻滞剂 50（66.7） 总胆固醇（mmol/L） 4.35±1.12 血管紧张素转化酶抑制剂 55（73.3） 甘油三酯（mmol/L） 1.86±1.44 钙离子通道阻滞剂 15（20.0） 高密度脂蛋白（mmol/L） 1.08±0.27 心功能检测 低密度脂蛋白（mmol/L） 2.87±0.88 左心室射血分数(%) 59.35±7.04 血小板计数(×109/L) 229.95±64.31 血小板功能检测 血红蛋白含量（g/L） 134.55±12.36 MAXADP (%) 9.28±6.32 -
采用MAXADP（即ADP诱导的最大血小板聚集率）反映替格瑞洛的抗血小板效果。当使用的诱导剂为5 μmol/L的ADP时，光学比浊法（LTA）检测到的最大血小板聚集率的治疗范围为MAXADP<50%，当MAXADP>50%时提示血栓形成的风险升高[14]。
本研究入组患者最大血小板聚集率的分布情况如图1所示，结果显示所有患者服用替格瑞洛后的最大血小板聚集率均在治疗范围之内。经K-S检验（Kolmogorov–Smirnov test），最大血小板聚集率基本符合正态分布（P>0.05）。
图 1 最大血小板聚集率的频率分布图（P=0.072）
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根据文献报道确定与替格瑞洛有关的转运蛋白、作用靶点以及血小板膜受体的编码基因[8-13]（基因为SLCO1B1、UGT2B7、P2RY12、PEAR1、ITGA2B、ITGB3），在入组患者全外显子测序的结果中筛选出以上相关编码基因上所有的外显子突变位点以及调控区域突变位点。本研究共筛选出18个突变位点，全部突变均发生在外显子区域。
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将患者各临床因素与最大血小板聚集率进行单因素分析（见表2）。结果表明，与最大血小板聚集率显著相关的是患病类型，STE-ACS患者的最大血小板聚集率较NSTE-ACS患者高（11.73%±5.55% vs 7.74%±6.35%，P=0.007）。这表明STE-ACS患者服用替格瑞洛后抗血小板聚集效果较NSTE-ACS患者差。
表 2 临床因素与LTA测得的最大血小板聚集率的相关性
临床因素 组别 例数
(n)MAXADP
(%，$ \bar x \pm s $)P 性别 男 63 9.01±6.20 0.399 女 12 10.70±7.02 年龄（岁） ≥65岁 30 8.33±6.01 0.294 <65岁 45 9.91±6.51 体质量指数(kg/m2) ≥24 43 9.04±6.15 0.706 <24 32 9.60±6.63 高血压 是 41 10.40±6.08 0.092 否 34 7.93±6.44 糖尿病 是 24 9.20±4.48 0.933 否 51 9.32±7.06 高脂血症 是 40 9.38±6.77 0.888 否 35 9.17±5.88 吸烟 是 43 8.79±6.26 0.437 否 32 9.94±6.44 钙离子通道阻滞剂 是 15 7.07±5.88 0.131 否 60 9.83±6.35 血管紧张素转化酶抑制剂 是 55 9.64±6.42 0.422 否 20 8.30±6.10 β-受体阻滞剂 是 50 8.61±6.52 0.195 否 25 10.63±5.80 患病类型 NSTE-ACS 46 7.74±6.35 0.007* STE-ACS 29 11.73±5.54 注:＊P <0.05，表示临床因素与患者用药后的最大血小板聚集率有显著相关性 其余临床因素与患者用药后的最大血小板聚集率无显著相关性（P>0.05）。为找出更多可能的影响因素，将显著性水平调整为P<0.1，数据显示有高血压病史的ACS患者平均最大血小板聚集率高于无高血压病史者（10.40%±6.08% vs 7.93%±6.44%，P=0.092），这表明合并高血压有可能会对ACS患者服用替格瑞洛后最大血小板聚集率产生一定的影响。
将血小板计数、低密度脂蛋白水平、高密度脂蛋白水平、糖化血红蛋白含量这四个临床因素作为连续变量，与LTA测得的最大血小板聚集率进行双变量单因素相关分析，得到的结果见表3。由表3可以看出，以上4个临床因素与LTA检测的最大血小板聚集率均不存在显著相关性（P>0.05）。
表 3 其他临床指标与LTA测得的最大血小板聚集率之间的相关性
临床因素 r P 血小板计数 0.190 0.102 总胆固醇 0.066 0.577 高密度脂蛋白 0.58 0.621 低密度脂蛋白 −0.76 0.517 糖化血红蛋白(%) 0.083 0.482 -
将入组的75例患者按照相关突变位点的不同基因型进行分组分析，比较各SNP相应基因型之间平均最大血小板聚集率的差异（见表4）。结果显示18个候选SNPs中SLCO1B1 rs2306283会影响替格瑞洛抗血小板聚集的效果，至少携带一个突变基因G的患者（AG型+GG型）平均最大血小板聚集率显著低于携带野生纯合子AA型的患者（8.07%±6.17% vs 13.88%±6.39%，P=0.042）。其余候选SNPs各基因型与替格瑞洛抗血小板聚集效果均无统计学相关性。这表明SLCO1B1 rs2306283 G 等位基因可能会影响替格瑞洛在体内的转运，进而增强替格瑞洛在体内的抗血小板聚集效果，具体机制有待进一步探究。
表 4 SLCO1B1 rs2306283与LTA测得的最大血小板聚集率的相关性
基因 基因型 例数 MAXADP
(%，$ \bar x \pm s $)P All W比H/V SLCO1B1
rs2306283AA 7 13.88±6.39 0.124 0.042* AG 32 8.58±6.01 GG 36 9.01±6.38 SLCO1B1
rs4149056TT 65 9.60±6.37 − 0.263 TC 10 7.18±5.98 SLCO1B1
rs2291075CC 29 9.50±5.99 0.903 0.810 CT 29 9.42±6.32 TT 17 8.67±7.12 注：All指的是野生纯合型、突变杂合型以及突变纯合型三组基因型间最大血小板聚集率的比较；W比H/V指的是野生纯合型与突变型（突变杂合型+突变纯合型）两组基因型间最大血小板聚集率的比较 -
将单因素相关性分析中得到的P<0.1的因素即高血压、患病类型以及SLCO1B1 rs2306283 G等位基因纳入多因素线性回归模型中，对高血压、患病类型进行调整，得到SLCO1B1 rs2306283 G等位基因对替格瑞洛抗血小板聚集效果的影响程度。具体结果见表5。
表 5 基于3个变量的最大血小板聚集率的多元线性回归
变量 非标准化系数β 标准化系数β t P 高血压 1.791 0.142 1.262 0.221 STE-ACS 3.026 0.235 1.919 0.059 rs2306283（AG+GG） −2.697 −0.125 −1.031 0.306 从表5可知STE-ACS、高血压以及SLCO1B1 rs2306283 G等位基因对最大血小板聚集率影响依次减弱（|β|：0.235>0.142>0.125），但是三者均不会显著影响患者服用替格瑞洛后的最大血小板聚集率（P>0.05），因此，调整高血压、患病类型这两个混杂因素后，SLCO1B1 rs230628 G等位基因并不是影响替格瑞洛抗血小板聚集效果的独立变量。
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全外显子测序结果显示在SLOC1B1基因外显子区域检测到3个可信度较高的突变位点，分别是rs2306283、rs4149056和rs2291075。
一项体外研究表明rs2306283 G等位基因会降低OATP1B1对利福平的转运活性[15-16]。WEN等[17]研究表明SLOC1B1 388A>G（rs2306283）单核苷酸多态性会引起健康中国志愿者匹伐他汀药动学的显著改变：AG+GG组的Cmax、AUC0–48、AUC0–∞显著高于AA组。目前没有文献报道rs2306283单核苷酸多态性是否会影响替格瑞洛的药动学，但本研究数据表明rs2306283单核苷酸多态性会影响ACS患者服用替格瑞洛后抗血小板聚集效果：AG+GG组的血小板聚集率显著低于AA组，即AG+GG组患者服用替格瑞洛后对血小板的抑制作用较强。因此，我们推测SLCO1B1 rs2306283 G等位基因虽不是影响抗血小板聚集效果的独立变量，但可能会影响替格瑞洛在体内的转运，而本研究没有测定替格瑞洛的药动学参数，无法确定上述推测，还需进一步研究。试验结果是否会直接影响服用替格瑞洛患者的主要治疗终点，还需对患者进行长期随访。
在高加索人群中进行的全基因组关联分析表明rs4149056与rs113681054存在连锁不平衡（LD）（r=0.8718）致使OATP1B1的转运活性降低，继而使替格瑞洛以及其活性产物血浆水平升高，但是对替格瑞洛治疗期的疗效或安全性没有显著影响[8]。然而，千人基因组计划数据库显示在103名汉族受试者rs4149056与rs113681054表现出较低程度的LD（r = 0.3808），并且rs113681054以及rs4149056这两个SNP对中国健康年轻男性志愿者替格瑞洛的药动学以及药效学（PK/PD）没有显著影响[9]。虽然本研究显示rs4149056 TT型替格瑞洛抗血小板效果较CT型差，但是不具有显著性差别。
目前没有文献报道rs2291075单核苷酸多态性会影响替格瑞洛的转运。本研究也显示rs2291075各基因型对血小板聚集率没有影响。
综上所述，替格瑞洛的抗血小板效果不受相关基因单核苷酸多态性的影响，这为不宜使用氯吡格雷的基因缺陷患者选择替格瑞洛治疗提供了参考。
Effect of pharmacogenetic polymorphism on the antiplatelet aggregation effect of ticagrelor
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摘要:
目的 在急性冠脉综合征（ACS）患者中开展替格瑞洛的药物基因组学研究，以期发现可以预测替格瑞洛抗血小板聚集效果个体差异的遗传学因素，为患者制定替格瑞洛的个体化用药方案提供参考。 方法 对福建省某院2018年收治的75例符合纳入标准的汉族ACS患者进行DNA检测、血小板功能及聚集率检测。采用全外显子测序法检测入组患者的SLCO1B1、UGT2B7、P2Y12、PEAR1、ITGA2B、ITGB3的单核苷酸多态性。同时收集并记录患者的一般临床资料。通过单因素方差分析、多元线性回归分析等方法，分析替格瑞洛抗血小板效果与基因多态性的相关性。 结果 单因素方差分析结果显示SLCO1B1 rs2306283 G等位基因可影响替格瑞洛抗血小板聚集效果，至少携带一个突变基因G的患者（AG型+GG型）平均最大血小板聚集率显著低于携带野生纯合子AA型的患者（8.07%±6.17%比13.88%±6.39%，P≤0.05）。而调整混杂因素后的多因素回归分析显示SLCO1B1 rs2306283 G等位基因并不是影响替格瑞洛抗血小板聚集效果的独立变量（P>0.05）。 结论 在福建省汉族ACS患者中，与替格瑞洛转运受体、作用靶点以及血小板膜受体相关的基因（包括SLOC1B1、UGT2B7、P2Y12、PEAR1、ITGA2B、ITGB3）单核苷酸多态性不会显著影响替格瑞洛抗血小板聚集效果，这为不宜使用氯吡格雷的基因缺陷患者提供了新的治疗选择。 Abstract:Objective To develop a pharmacogenomics study of ticagrelor in patients with acute coronary syndrome (ACS), identify the genetic factors that can predict individual differences in antiplatelet aggregation effects of ticagrelor, and provide a reference for the development of individualized regimens for ticagrelor. Methods 75 ACS patients of Chinese Han in a hospital in Fujian province in 2018 who met the entry criteria were recruited. The patient was given the tests for platelet function test, platelet aggregation rate and DNA detection. The whole exon sequencing method (WES) was used to detect the single nucleotide polymorphisms of SLO1B1, UGT2B7, P2Y12, PEAR1, ITGA2B and ITGB3. At the same time, the general clinical data of the patients were collected and recorded. The correlation between antiplatelet aggregation effects of ticagrelor and pharmacogenetic polymorphism was analyzed by one-way analysis of variance, multiple linear regression analysis and binary logistic regression analysis. Results One-way analysis of variance showed that SLCO1B1 rs2306283 mutant allele G could affect the antiplatelet aggregation effect of ticagrelor, the average platelet aggregation rate of patients carrying at least one allele G (AG+GG type) was significantly lower than that of wild homozygotes AA patients (8.07%±6.17% vs 13.88%±6.39%, P≤0.05). However, multivariate regression analysis after adjusting for confounding factors showed that SLCO1B1 rs2306283 mutant allele G was not an independent variable affecting the antiplatelet effects of ticagrelor (P>0.05). Conclusion Single nucleotide polymorphisms of genes related to ticagrelor transport receptors, targets, and platelet membrane receptors (including SLO1B1, UGT2B7, P2Y12, PEAR1, ITGA2B, ITGB3) in ACS patients of Han Chinese in Fujian province will not significantly affect the antiplatelet aggregation effect of ticagrelor, which provides a new treatment option for patients with genetic defects who are not suitable for clopidogrel. -
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是一种重要的代谢产物，其参与许多生化过程，如能量代谢、基因表达调控、DNA修复等[1, 2]。人体皮肤、血液、肝脏、肌肉和大脑中的NAD+浓度会随着年龄的增长而降低，因此，增强NAD+可能在缓解相关的细胞功能和整体健康受损方面发挥关键作用[3]。烟酰胺单核苷酸（NMN）是NAD+生物合成的前体。体内外研究表明，补充NMN可以提高NAD+水平[4]。NMN可以缓解各种心脑血管疾病的发展，包括中风[5]、心力衰竭[6]和心肌缺血等[7]。此外，NMN还与改善线粒体功能和潜在的抗衰老益处有关[8]。几项临床试验探索了NMN补充剂的有效性和安全性（标识号：NCT04228640[9]，NCT04823260[10]，UMIN000036321[11]）[8]，证明了其对心血管保护的潜力。然而，NMN的研究仍然缺乏大规模可靠的人体试验数据，特别是关于其治疗高血压等特定疾病的疗效问题。虽然早期研究显示了一些有希望的结果，但需要更广泛的基础研究和临床试验来证实其在不同患者群体中的疗效和安全性。
高血压是一系列健康问题的重要危险因素，包括心脏、肾脏疾病以及中风等脑血管疾病[12]，影响着全世界数百万人[13]。高血压的危险在于，随着时间的推移会导致靶器官损伤，发生如动脉粥样硬化、肾功能衰竭、心力衰竭和中风等疾病。高血压的发生与衰老和肥胖等因素有关，而这两者都源自于NAD+缺乏。因此，NAD+已成为高血压的潜在治疗靶点。
目前关于NMN对高血压的影响研究相对有限。只有一项临床前实验表明NMN可以降低血管紧张素II（Ang II）诱导的高血压小鼠的血压[14]。另有一项临床研究表明，补充NMN可以降低高血压患者的血压（标识号：NCT04903210[14]）。然而，目前的证据不足以将NMN开发为抗高血压药物，特别是其缺乏较为全面的临床前药效评价。因此需要更严格的研究来确定NMN是否能作为高血压治疗药物。自发性高血压大鼠（SHR）是一种遗传性高血压模型动物，常用于评估抗高血压药物[15-17]。双肾双夹（2K2C）大鼠是一种实验性易卒中肾血管性高血压模型动物，这些大鼠在术后2周内100%发生高血压[15, 16]，也常用于评估抗高血压药物。本次研究中，我们采用单次胃瘘给药和长期药物饲料喂养方式给予受试大鼠NMN治疗，观察NMN对原发性和继发性高血压大鼠模型的血压和器官损伤的影响。此外，我们还观察了终身给药NMN对2K2C大鼠模型死亡率和寿命的影响[15]。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（160~180 g）购于上海必凯科翼生物科技有限公司。2K2C大鼠由SD大鼠双侧肾动脉嵌套0.2 mm内径的U型银夹制作而成。雄性SHR（250~290 g）购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
所有大鼠均饲养于独立通气笼盒（IVC）系统中，饲养温度为24±2°C，相对湿度为40%~60%，照明时间为8:00~20:00，自由饮食和饮水（特定情况除外）。本实验研究严格遵守实验动物福利等伦理原则。
1.2 实验试剂和仪器
NMN（批号2021046B）由尚科生物医药（上海）有限公司提供，氯沙坦钾（Losartan）（批号LOSB-4-06210326）由浙江美诺华药业股份有限公司提供，戊巴比妥钠购于德国Merck公司，注射用青霉素钠购于山东鲁抗医药股份有限公司，肝素钠（批号H3v60）购于上海博光生物科技有限公司，EVG弹力纤维染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。
U型银夹（0.2 mm内径）、血压与心率分析系统（型号MPA-HBBS）购于上海奥尔科特生物科技有限公司，聚乙烯导管购于法国Biotrol公司。
1.3 实验方法
1.3.1 实验分组和治疗方案
NMN单次给药治疗研究：包括SHR和2K2C大鼠两种模型，在各自模型实验中，大鼠均被随机分配为对照组（蒸馏水）和NMN给药组（200 mg/kg），并通过胃瘘导管给药。
NMN长期给药（4周）治疗研究：包括SHR和2K2C大鼠两种模型，在各自模型实验中，大鼠均被随机分配为对照组（普通饲料）和NMN给药组[药物饲料，等效NMN剂量200 mg/（kg·d）]。
生存时间观察研究：采用2K2C大鼠模型，实验包括假手术组（正常SD大鼠，普通饲料）和2K2C造模组，2K2C造模组大鼠再被随机分为模型组（普通饲料）、氯沙坦给药组[药物饲料，等效剂量20 mg/（kg·d）]和NMN给药组[药物饲料，等效剂量200 mg/（kg·d）]。
1.3.2 2K2C大鼠模型制备
2K2C模型是通过在正常SD大鼠的两个肾动脉上放置0.2 mm尺寸的银夹后造成的高血压模型，参考本教研室文献及方案[16,17]。简言之，SD大鼠用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，腹部切口，轻轻翻转肾脏，游离出肾动脉后放上内径为0.2 mm的U形银夹。在另一侧肾脏重复相同步骤。小心复位肾脏和周围组织。假手术的大鼠进行相同的操作至游离血管步骤，但不放置U形银夹。以上步骤完成后，滴加青霉素，缝合。然后将大鼠放在电热毯上，苏醒后送回IVC系统笼。
1.3.3 胃瘘给药操作方法
用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，腹部区域脱毛并消毒，自剑突下沿腹部中间切口2 cm，使用无菌棉签将胃轻轻拉出，于近幽门段并且避开血管作荷包预缝合，预留区域内戳出小孔，迅速将胃瘘导管缠有胶布端插入胃内，拉紧预缝合线固定导管，经背部皮下牵引至颈后穿出并固定。随后，将胃瘘导管以大鼠马甲方式固定于背部防止动物清醒后抓咬。手术完成后，动物于电热毯上保温至复苏。
1.3.4 清醒自由活动测量血压
参考本教研室文献及方案[15, 16]，用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，左侧腹股沟区域脱毛并消毒，并沿股动脉方向切开皮肤，暴露股动脉。游离出一段股动脉，插入特制的PE测压导管，导管前端依次穿行过股动脉、髂总动脉并最后进入腹主动脉，此时测得血压为腹主动脉血压，导管的另一端沿皮下穿行至颈部背侧皮肤后穿出，用自制马甲固定，缝合伤口。术后，大鼠饲养于测量系统笼里适应环境，自由饮食和饮水。24 h后，测压导管连接压力传感器，经MPA-HBBS数据分析系统处理后将压力信号转化为血压波形显示在电脑屏幕上。同时以0.3 ml/h的速率连续输注25 U/ml肝素钠，以防止测压过程中凝血。
NMN单次给药实验中，大鼠股动脉插管手术后次日上午9:00开启测量系统，连续记录血压和心率信号。12:00，通过胃管给予相应的药物（NMN或蒸馏水）。连续记录24 h血压和心率变化（取给药前1 h的数据作为基础血压和心率）。NMN长期给药实验中，NMN给药组和对照组的大鼠同样使用上述方法进行血压和心率测量，并连续记录2 h。
1.3.5 器官大体形态学和病理形态学分析
在完成血压和心率测量后，大鼠再次麻醉并迅速打开胸腔，用4 ℃预冷的生理盐水对大鼠进行心脏灌注。取出脑、肝脏、心脏、肾脏和主动脉（从左锁骨下动脉分支到横膈膜段），测量器官重量，以及主动脉长度、左心室壁厚度、肾皮质和髓质厚度。随后，将脑、心脏、主动脉、和肾脏用4%多聚甲醛固定，并进行病理形态学分析，包括EVG、苏木素-伊红（HE）和Masson染色[18]。
1.3.6 统计学分析
所有实验数据均以“均值±标准误（mean±SEM）”表示。使用GraphPad Prism 10软件进行统计分析。使用非配对Student-t检验进行组间比较，生存曲线使用Log-rank检验分析。以P<0.05为具有统计学差异。
2. 结果
2.1 单次NMN治疗未降低SHR的血压和器官损伤程度
SHR是一种原发性高血压大鼠模型，单次给予200 mg/kg NMN后，2 h内，NMN给药组和溶剂对照组的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率没有显著差异（图1：A-D）。对NMN给药后2 h和24 h内的区间血压进行测量分析，两组的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率均值也没有显著差异（图1：E-H）。
图 1 单次NMN治疗对SHR的血压、心率及靶器官损伤的影响（n=5）A-D. 单次给药后2 h内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率的动态测量值；E-H. 单次给药前和给药后2、24 h区间内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率平均值；I. 脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量；J. 主动脉重量与长度比；K. 左心室壁厚度；L. 肾皮质与髓质厚度比；M. 脑血管EVG染色、心脏Masson染色、主动脉和肾脏HE染色的代表图高血压还可导致心室肥大、主动脉增厚、肾脏皮质萎缩等靶器官损伤。进一步比较两组大鼠的器官损伤程度，与溶剂对照组相比，NMN给药组的脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的器官相对重量没有显著变化（图1：I）。同时，两组在主动脉重量与长度比、左心室壁厚度和肾皮质与髓质厚度比方面也没有显著差异（图1：J-L）。
对脑血管进行EVG染色，两组大鼠的弹力纤维均清晰、完整，没有发生显著的病理损伤；对心脏进行Masson染色，也没有发现NMN可以改善血管周围的胶原纤维分布；对主动脉和肾脏进行HE染色，同样没有发现NMN减轻主动脉厚度或改善肾小球萎缩等病变（图1：M）。这些结果表明，在SHR模型中，单次给药NMN对血压或器官保护方面没有治疗作用。
2.2 长期NMN治疗未降低SHR的血压和器官损伤程度
高血压是一种慢性疾病，进一步在SHR模型上长期给予NMN药物饲料喂养4周，等效剂量为200 mg/（kg·d），以评估其对血压和器官损伤的影响。与对照组相比，长期NMN药物饲料治疗组的大鼠体重没有显著变化，但第4周时，NMN给药组大鼠的进食量显著增加（图2：A-B）。NMN药物饲料喂养4周后，对照组和NMN给药组的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率均没有显著差异（图2：C-F）。
比较两组大鼠的器官损伤程度，与NMN单次给药治疗的结果相似，NMN药物饲料治疗4周依然没有显著的靶器官保护作用（图2：G-K）。这些结果表明，在SHR模型中，NMN长期给药也没有降低血压或器官保护作用。
2.3 单次NMN治疗未降低2K2C大鼠的血压和器官损伤程度
2K2C大鼠模型是继发性高血压的实验室模型，通过2K2C手术造模后，大鼠血压明显升高[16]，进一步研究了在2K2C大鼠模型中单次给药200 mg/kg NMN的治疗效果。与SHR模型中观察到的结果一致，与对照组相比，单次给药NMN后2 h或24 h内对血压和心率没有影响（图3：A-H）。2K2C大鼠单次服用NMN后，脑、心脏、肾脏和主动脉等组织的形态学评估和病理染色也没有显示出任何器官保护作用（图3：I-M）。这些结果表明，在2K2C模型中，单次给药NMN对血压或器官保护方面也没有显著影响。
图 3 单次NMN治疗对2K2C大鼠的血压、心率和器官损伤的影响（n=5）A-D. 单次给药后2 h内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率的实时测量值；E-H. 单次给药前和给药后2、24 h区间内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率平均值；I. 脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量；J. 主动脉重量与长度比；K. 左心室壁厚度；L. 肾皮髓质厚度比；M. 脑血管EVG染色、心脏Masson染色、主动脉和肾脏HE染色的代表图2.4 长期NMN未降低2K2C大鼠的血压和器官损伤程度
在2K2C模型中长期给予NMN 200 mg/（kg·d），与对照组相比，长期NMN治疗组的体重没有显著变化，尽管第4周的进食量明显减少（图4：A-B）。连续给予NMN 4周后，测量两组大鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率，没有观察到显著差异（图4：C-F）。形态学评估，包括脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量；主动脉重量与长度比；左心室壁厚度、和肾皮质与髓质厚度比；结合EVG、Masson和HE染色，两组之间没有显著差异（图4：G-K）。这些结果表明，在2K2C模型中，长期给药NMN对血压或器官保护也没有显著影响。
图 4 长期NMN治疗对2K2C大鼠的血压和心率的影响（n=5）A.体重；B. 进食量；C-F. 长期给药4周后的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率；G. 脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量；H. 主动脉重量与长度比；I. 左心室壁厚度；J. 肾皮髓质厚度比；K. 脑血管EVG染色、心脏Masson染色、主动脉和肾脏HE染色的代表图*P<0.05，NMN给药组与对照组比较。2.5 长期NMN治疗未延长2K2C大鼠的存活时间
NMN在多种病理生理过程中起着重要作用[10]。进一步考察终身服用NMN是否可以延长2K2C高血压大鼠的存活时间。治疗期间，各组大鼠的体重或进食量没有显著差异（图5：A-B）。与假手术组相比，2K2C模型大鼠的存活时间显著减少，经氯沙坦治疗后，2K2C大鼠的存活时间显著延长。而NMN治疗的2K2C大鼠生存曲线与模型组没有显著差异（图5C）。以上结果表明，在2K2C模型中，NMN没有延长高血压大鼠存活时间的作用。
图 5 长期NMN治疗对2K2C大鼠存活时间的影响（n=25~27）A. 体重；B. 进食量；C. 生存曲线***P<0.001，与假手术组比较；###P<0.001，与模型组比较；▲▲P<0.01，NMN给药组与氯沙坦给药组比较，C图中均使用Log-rank检验方法。3. 讨论
本研究使用两种成熟的高血压大鼠模型：SHR和2K2C大鼠模型，探讨了NMN对高血压的可能影响。研究结果表明，在上述模型中，单次或长期NMN治疗均未显示出显著的抗高血压和保护器官损伤作用，也没有延长生存时间的作用。
高血压对健康存在重大威胁，会导致严重的并发症，如心脏疾病、中风和慢性肾病等。抗高血压治疗在高血压的管理中至关重要。氯沙坦是一种经典的抗高血压药物，能够特异性拮抗血管紧张素II的AT1型受体，并在2K2C和易卒中自发性高血压大鼠（SHR-SP）模型中被证明存在降低血压，减轻器官损伤，延长存活时间的作用[15, 19]。因此，我们选择氯沙坦作为阳性对照药物，它显著延长了高血压大鼠的存活时间。相比之下，NMN并没有延长高血压大鼠的存活时间。此外，在2K2C大鼠和SHR模型中，无论是单次治疗还是长期治疗，NMN对高血压和器官损伤都没有影响。
在最近的一项研究中，在AngⅡ诱导的高血压小鼠模型中证明了NMN有抗高血压和器官保护作用[14]。有几个因素可能导致我们的发现与该团队的发现之间存在差异，如动物模型、给药方案、NMN给药时间和血压测量方法的变化，特别是所用模型之间的差异，SHR和2K2C大鼠模型更广泛地用于评估抗高血压药物的效果。我们使用了与该团队近似的药物剂量进行单次和长期给药来评估NMN药效，但该团队只研究了长期给药。此外，实验动物的血压测量方法可能是观察到结果差异的重要原因。在本研究中，我们采用更为准确的清醒自由活动大鼠血压测定方法，而该团队采用了非侵入性尾套法。总的来说，我们直接评估了NMN对SHR和2K2C大鼠经典高血压模型中高血压和器官损伤的影响，发现NMN对高血压大鼠的血压和器官损伤没有治疗作用。
同时，氯沙坦的降血压作用已多次被我们证实，例如，在2K2C模型上，长期给药氯沙坦4周，收缩压降低约40 mmHg[15]，并且氯沙坦的降压作用被国内外广泛证明。因此研究NMN治疗对血压的影响实验中，不设氯沙坦阳性药对照组。而前期我们未证明过氯沙坦对大鼠寿命的影响，因此选择氯沙坦作为阳性对照药物，发现它显著延长了高血压大鼠的存活时间。
关于文中NMN剂量的选择，目前，NMN在各种人群中通常用作营养保健品，剂量范围为50~150 mg/d[20]。小鼠常用NMN剂量为300 mg/kg，对应大鼠剂量约为200 mg/kg，对应人（70 kg）剂量为33 mg/kg；临床试验剂量最大一般设为900 mg/d[21]，因此，上述剂量已是较大剂量，若再尝试加大剂量没有实际应用价值，故未设计再高剂量组。
综上，本研究评估了单次和长期NMN治疗对SHR和2K2C大鼠模型中高血压和器官损伤的影响。结果表明，NMN对高血压大鼠的血压、器官损伤和寿命均没有影响，这些发现为NMN的未来临床研究提供了有价值的见解和参考。
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表 1 75例急性冠脉综合征患者的临床特征（n=75）
临床因素 均数( $ \bar x \pm s $ )例数（n，%） 临床因素 均数( $ \bar x \pm s $ )例数（n，%） 患病类型 凝血酶原时间（sec） 11.20±1.46 NSTE-ACS 46（61.3） 凝血酶时间（sec） 18.07±1.67 STE-ACS 29（38.7） 活化部分凝血活酶时间（sec） 28.20±4.07 合并疾病 国际标准化比值（INR） 0.99±.060 糖尿病 24（32.0） 糖化血红蛋白(%) 6.49±1.54 高血压 41（54.7） 合并用药 高脂血症 40（53.3） 质子泵抑制剂 75（100） 吸烟 43（57.3） 他汀类 75（100） 实验室指标 β-受体阻滞剂 50（66.7） 总胆固醇（mmol/L） 4.35±1.12 血管紧张素转化酶抑制剂 55（73.3） 甘油三酯（mmol/L） 1.86±1.44 钙离子通道阻滞剂 15（20.0） 高密度脂蛋白（mmol/L） 1.08±0.27 心功能检测 低密度脂蛋白（mmol/L） 2.87±0.88 左心室射血分数(%) 59.35±7.04 血小板计数(×109/L) 229.95±64.31 血小板功能检测 血红蛋白含量（g/L） 134.55±12.36 MAXADP (%) 9.28±6.32 
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表 2 临床因素与LTA测得的最大血小板聚集率的相关性
临床因素 组别 例数
(n)MAXADP
(%，$ \bar x \pm s $ )P 性别 男 63 9.01±6.20 0.399 女 12 10.70±7.02 年龄（岁） ≥65岁 30 8.33±6.01 0.294 <65岁 45 9.91±6.51 体质量指数(kg/m2) ≥24 43 9.04±6.15 0.706 <24 32 9.60±6.63 高血压 是 41 10.40±6.08 0.092 否 34 7.93±6.44 糖尿病 是 24 9.20±4.48 0.933 否 51 9.32±7.06 高脂血症 是 40 9.38±6.77 0.888 否 35 9.17±5.88 吸烟 是 43 8.79±6.26 0.437 否 32 9.94±6.44 钙离子通道阻滞剂 是 15 7.07±5.88 0.131 否 60 9.83±6.35 血管紧张素转化酶抑制剂 是 55 9.64±6.42 0.422 否 20 8.30±6.10 β-受体阻滞剂 是 50 8.61±6.52 0.195 否 25 10.63±5.80 患病类型 NSTE-ACS 46 7.74±6.35 0.007* STE-ACS 29 11.73±5.54 注:＊P <0.05，表示临床因素与患者用药后的最大血小板聚集率有显著相关性
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表 3 其他临床指标与LTA测得的最大血小板聚集率之间的相关性
临床因素 r P 血小板计数 0.190 0.102 总胆固醇 0.066 0.577 高密度脂蛋白 0.58 0.621 低密度脂蛋白 −0.76 0.517 糖化血红蛋白(%) 0.083 0.482
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表 4 SLCO1B1 rs2306283与LTA测得的最大血小板聚集率的相关性
基因 基因型 例数 MAXADP
(%，$ \bar x \pm s $ )P All W比H/V SLCO1B1
rs2306283AA 7 13.88±6.39 0.124 0.042* AG 32 8.58±6.01 GG 36 9.01±6.38 SLCO1B1
rs4149056TT 65 9.60±6.37 − 0.263 TC 10 7.18±5.98 SLCO1B1
rs2291075CC 29 9.50±5.99 0.903 0.810 CT 29 9.42±6.32 TT 17 8.67±7.12 注：All指的是野生纯合型、突变杂合型以及突变纯合型三组基因型间最大血小板聚集率的比较；W比H/V指的是野生纯合型与突变型（突变杂合型+突变纯合型）两组基因型间最大血小板聚集率的比较
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表 5 基于3个变量的最大血小板聚集率的多元线性回归
变量 非标准化系数β 标准化系数β t P 高血压 1.791 0.142 1.262 0.221 STE-ACS 3.026 0.235 1.919 0.059 rs2306283（AG+GG） −2.697 −0.125 −1.031 0.306
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