下载:
下载:
-
病理性心肌纤维化(myocardial fibrosis, MF)是常见的心血管病理生理表现，存在于多种心血管疾病，具体机制尚不明确，减轻心肌纤维化可能成为缓解房颤等多种心血管疾病治疗的有效靶点[1-4]，但目前心肌纤维化的治疗尚缺乏有效治疗策略。研究表明，Rho/ROCK/JNK途径调节多种关键细胞功能，可以介导细胞凋亡、增殖、分化等，而抑制JNK和TGFβ/Smad途径可改善2型糖尿病大鼠的心肌纤维化，使RhoA/ROCK/JNK成为预防心肌纤维化的潜在治疗靶点[5- 6]。黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ, AS-Ⅳ）是从中药黄芪中提取出的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎症、降低血糖等多重药理作用, 并且AS-Ⅳ通过抑制ROS/Caspase-1/GSDMD信号通路可减轻心肌梗死诱导的心肌纤维化和心脏重塑[7-9]。本研究采用异丙肾上腺素诱导小鼠心肌纤维化，探讨黄芪甲苷对心肌纤维化的改善作用以及对ROCK/JNK信号的调控作用。
-
6周龄健康雄性C57/BL小鼠，体质量（20.5±1.1） g，购自空军军医大学实验动物中心[许可证号：SYXK（陕）2019-001]，实验经空军军医大学伦理委员会批准（No.20220262）；Atg5、Beclin-1、LC3 Ⅰ/Ⅱ、ROCK、JNK、GAPDH抗体、黄芪甲苷（美国Sigma-Aldrich公司）；ROCK抑制剂Y-33075（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；异丙肾上腺素（ISO，天津泰泽兴业生物科技有限公司）；BNP试剂盒、结缔组织生长因子（CTGF）试剂盒（美国R＆D Systems公司）；超氧化物阴离子荧光检测探针（DHE，美国ThermoFisher公司）；多功能酶标仪（美国Thermo公司）；Olympus FV2000激光共聚焦显微镜（日本奥林巴斯公司）；小动物超声仪（美国VisualSonics公司）。
-
将60只C57/BL小鼠按照随机数字表法随机分成4组，每组15只，即对照组、心肌纤维化组（MF组）、黄芪甲苷组、黄芪甲苷联合ROCK抑制剂Y-33075组（黄芪甲苷+Y-33075组）。各组以普通饲料喂养，MF组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+Y-33075组于小鼠肩胛间皮下注射异丙肾上腺素（ISO），首次剂量为 5 mg/(kg·d)，后以2.5 mg/(kg·d)，重复给药持续30 d，诱导心肌纤维化模型。对照组于同一部位注射相同体积生理盐水。给药组在造模同时给与药物治疗，黄芪甲苷组按100 mg/(kg·d）腹腔注射黄芪甲苷，黄芪甲苷+Y-33075组分别按100 mg/(kg·d）和10 mg/(kg·d)腹腔注射黄芪甲苷和Y-33075，MF组和对照组腹腔注射等量生理盐水，重复给药持续30 d。
-
各组小鼠经2%异氟烷麻醉后，四肢插上超声仪电极，探头在乳头肌水平位置用M型取样线检测，测量并计算得出左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室舒张期前壁厚度（LVAWd）、左心室舒张末期容积（LVEDV）等指标。
-
固定小鼠，剪开并剥离小鼠颈部皮肤、皮下组织，暴露小鼠颈动脉，剪开快速取血2 ml至EP管中，3000 r/min离心15 min，取上层清亮血清。按照LDH、BNP、CTGF检测试剂盒说明书检测。
-
迅速剪下心脏，冷PBS缓冲液冲洗3遍，洗净血细胞后，以多聚甲醛（40 g/L）固定72 h，石蜡包埋、切片，行Masson、天狼星红染色，在光学显微镜下拍摄染色后的Masson、天狼星红图像并保存，使用Image J软件测定Masson染色中胶原阳性蓝色染色面积与组织总面积比值，即胶原容积分数。
心脏在液氮中快速冷冻，并切成3 μm厚的切片。冷冻组织切片在黑暗潮湿的小室中用DHE反应混合物染色。使用Olympus FV1000激光共聚焦显微镜检查每个样品。使用Image J软件测定切片中二氢乙锭的荧光强度，以评估心肌组织中活性氧簇（ROS）的产生。
-
测定BNP、CTGF、Atg5的表达评估心肌组织纤维化及自噬水平。用TRIzol试剂从组织中分离总RNA，逆转录实验生成cDNA，用BIO-RAD分光光度法测定RNA和cDNA的浓度和纯度，PrimerPremier 6.0软件设计引物并合成（上海吉凯基因有限公司）。在iQ™5 RT-PCR系统中进行PCR扩增，采用2−ΔΔct法对靶基因表达量进行相对定量。各检测基因引物序列由美国复能基因公司提供（见表1）。
表 1 相关引物序列
基因 上游序列(5'-3') 下游序列(5'-3') BNP TAGCCAGTCTCCAGAACAAATCC AAACAACCTCAGCCCGTCA CTGF CAGCATGGACGTTCGTCTG AACCACGGTTTGGTCCTTGG Atg5 CAGAAGCTGTTCCGTCCTGT CCGTGAATCATCACCTGGCT GAPDH AGAACATCATCCCTGCATCC AGTTGCTGTTGAAGTCGC -
各组小鼠心肌组织取相同质量放入离心管中，加入预冷PBS，剪碎心肌组织，4℃ 3000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀中加入含蛋白酶抑制剂的RIPA强裂解液，冰上充分研磨并裂解30 min，4℃ 12000 r/min离心30 min，取上清；BCA法蛋白定量；电泳并用湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，裁剪目的条带，放入对应ROCK（1∶1000）、JNK（1∶1000）、Beclin 1（1∶1000）、LC3 Ⅰ/Ⅱ（1∶1000）、Atg5（1∶1000）和GAPDH抗体（1∶5000）中，4℃摇床孵育过夜；TBST洗脱3次，5 min/次，将目的条带放入山羊抗兔或抗鼠二抗（1∶5000）中室温摇床孵育2 h，TBST洗脱3次，5 min/次，ECL化学发光液避光检测，Image Lab统计灰度值。
-
取小鼠左室前壁组织，石蜡包埋、切片、脱蜡、复水，用PBS缓冲溶液洗5次，每次3 min，Triton-X100（2 g/L）处理15 min，PBS液冲洗3次，每次3 min，山羊血清室温封闭1.5 h，PBS液洗3次，每次3 min，每个切片加LC3 Ⅰ/Ⅱ抗体（1∶100）50 μl，4 ℃孵育15 h，PBS液洗5次，每次3 min，暗室内每张切片加荧光二抗（1∶500） 50 μl，PBS液洗5次（3 min/次），避光条件下每张切片加DAPI溶液50 μl，PBS液洗5次，每次3 min，用荧光防淬灭液封片，采集图像。
-
数据采用GraphPad Prism 9.0软件统计和分析。计量资料以（均数±标准差）表示，多组间比较采用单因素方差分析，随后采用Bonferroni校正及post hoc t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
-
与对照组比较，MF组心脏功能明显降低，LVEF、LVEDV显著减小，LVAWd显著增加（P<0.05）；与MF组比较，黄芪甲苷组心脏功能得到明显改善，LVAWd显著减少，LVEF、LVEDV显著增加（P<0.05）；和黄芪甲苷组相比，黄芪甲苷+Y-33075组的LVEF、LVEDV显著降低（P<0.05）。超声结果表明，黄芪甲苷可以改善MF诱发的心脏功能障碍，Y-33075可阻断黄芪甲苷的心肌保护作用（表2）。
表 2 各组小鼠超声测量心功能结果(n=10)
检测项目 对照组 MF组 黄芪甲苷组 黄芪甲苷+
Y-33075组LVEF (%) 72.31±6.27 35.43±8.12* 55.25±7.43^ 40.28±11.36# LVAWd (mm) 1.51±0.03 1.94±0.25* 1.62±0.20^ 1.71±0.18# LVEDV(μl) 57.92±7.23 49.78±9.36* 56.32±6.28^ 50.79±5.46# *P<0.05，与对照组比较； ^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较 与对照组相比，MF组血清中LDH、BNP、CTGF水平显著增加（P<0.05），心肌组织BNP、CTGF的mRNA表达显著增加（P<0.05），Atg5的mRNA表达降低（P<0.05）；与MF组相比，黄芪甲苷组血清LDH、BNP、CTGF水平显著降低（P<0.05），心肌组织BNP、CTGF的mRNA表达减少（P<0.05），Atg5的mRNA表达增加（P<0.05）；黄芪甲苷+Y-33075组血清中LDH、BNP、CTGF水平比黄芪甲苷组显著增加（P<0.05），心肌组织BNP、CTGF的mRNA表达明显增加（P<0.05），Atg5的mRNA表达降低（P<0.05），具体见表3、表4。
表 3 各组小鼠血清LDH、BNP、CTGF水平比较(n=10)
检测项目 对照组 MF组 黄芪甲苷组 黄芪甲苷+Y-33075组 LDH（U/L） 395.25±30.38 1102.43±62.35* 500.89±19.48^ 974.21±101.72# BNP（ng/L） 80.29±12.90 200.61±31.92* 137.33±19.28^ 194.72±26.31# CTGF（ng/L） 121.91±20.25 213.37±29.58* 163.05±10.29^ 189.03±25.42# *P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较 表 4 各组小鼠心肌组织BNP、CTGF、 Atg5的mRNA相对表达量(n=5)
项目 对照组 MF组 黄芪甲苷组 黄芪甲苷+Y-33075组 BNP 1 4.02±0.59* 1.59±0.33^ 3.98±0.49# CTGF 1 1.62±0.23* 0.91±0.37^ 1.54±0.29# Atg5 1 0.53±0.09* 2.56±0.61^ 0.69±0.30# *P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较 -
心肌组织Masson、天狼星红染色检测各组小鼠心肌组织结构、胶原含量及纤维化水平。对照组小鼠心肌组织无纤维化，胶原含量低；MF组可见心肌结构排列紊乱，肌纤维断裂明显，胶原含量高；与MF组相比，黄芪甲苷组肌纤维排列整齐，纤维化程度改善，胶原含量降低；与黄芪甲苷组相比，黄芪甲苷+Y-33075组心肌纤维化程度明显增加，排列紊乱，胶原含量增高(图1)。
图 1 Masson、天狼星红染色检测各组心肌组织纤维化程度（×400, n=5）
黄芪甲苷能够显著减轻脓毒症小鼠心肌组织氧化应激损伤。与对照组相比，MF组小鼠肾组织中ROS生成量显著增加（P<0.05）；与MF组相比，黄芪甲苷组小鼠心肌组织中ROS生成量显著降低（P< 0.05）；而与黄芪甲苷组相比，黄芪甲苷+Y-33075组小鼠ROS生成量显著增加（P < 0.05，图2）。
图 2 DHE染色检测各组小鼠心肌组织氧化应激水平（×400, n=5）
-
蛋白印迹检测结果提示，与对照组比较，MF组心肌组织中自噬相关蛋白ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ表达水平降低（P<0.05）；与MF组比较，黄芪甲苷组心肌组织ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ表达水平增高（P<0.05）；而与黄芪甲苷组比较，黄芪甲苷+Y-33075组心肌组织ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ表达水平降低（P<0.05），提示黄芪甲苷可以改善MF所致心肌细胞自噬水平的降低，而Y-33075能阻断黄芪甲苷的这一作用（图3）。
图 3 Y-33075阻断黄芪甲苷改善MF所致心肌细胞自噬（n=5）
心肌LC3- I/II免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，MF组LC3-I/II蛋白免疫荧光染色数量显著减少（P>0.05）；与MF组相比，黄芪甲苷组LC3-I/II蛋白染色的数量显著增加（P<0.05）；与黄芪甲苷组相比，黄芪甲苷+Y-33075组LC3-I/II蛋白免疫荧光染色数量显著减少（P<0.05），结果也提示黄芪甲苷可以改善MF诱发的心肌自噬功能障碍，而Y-33075可阻断黄芪甲苷的这一作用（图4）。
图 4 Y-33075阻断黄芪甲苷改善MF所致心肌细胞自噬水平的LC3-I/II免疫荧光染色（×400, n=5）
-
病理性心肌纤维化是由多种因素引起的，这些因素可导致胶原纤维过度沉积，胶原浓度和体积分数显著增强，心肌胶原类型和结构排列紊乱，是房颤等多种慢性心血管疾病进展中的重要病理过程，然而心肌纤维化在分子水平的具体机制尚不清楚[10-13]。研究表明，多种重要机制参与了病理性心肌纤维化的发展过程，其中包括炎症反应、氧化应激、纤维化、细胞死亡等。近年来发现，自噬和泛素-蛋白酶体系统是维持细胞中蛋白稳态的重要途径，研究表明自噬在心肌纤维化过程中起着重要作用[14-16]。然而，自噬与心肌纤维化的相互作用机制尚不十分清楚，自噬及其调节可能成为治疗心肌纤维化的潜在策略。
近年来多项研究发现，一种来源于豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的黄酮类化合物黄芪甲苷，在心血管相关疾病中发挥了重要的保护作用[13-14]。然而，黄芪甲苷能否减轻心肌纤维化及其潜在分子机制还有待进一步探究。
本研究旨在探讨自噬与小鼠心肌纤维化的关系，并阐明了黄芪甲苷通过上调自噬改善MF的保护机制。根据本研究结果发现，心肌细胞自噬抑制参与了MF进展，同时，黄芪甲苷可激活ROCK/JNK通路促进细胞自噬改善MF，结果从一定从程度上阐明了MF的可能作用机制，并辅助探寻预防和治疗心肌纤维化的潜在靶点。
Rho蛋白激酶(ROCK)是丝氨酸蛋白激酶家族成员， Rho/ROCK途径调节多种关键细胞功能，如基因转录、细胞黏附、神经发育、细胞死亡[5-6]。Rho/ROCK的相关研究有助于更好地阐明多种疾病的病理生理过程，而抑制Rho/ROCK也可能成为潜在治疗靶点[17-19]。细胞自噬在心肌纤维化中起着关键作用，ROCK/.JNK具有自噬调控作用[17]。黄芪甲苷的心脏保护作用是通过激活细胞自噬介导[20-21]。本实验结果表明，在MF模型中，ROCK和JNK表达均下调，而黄芪甲苷组ROCK和JNK表达恢复。Y-33075是ROCK的抑制剂，Y-33075处理后可通过阻断ROCK减弱黄芪甲苷对MF的改善作用。因此，通过抑制ROCK/JNK通路，部分消除了黄芪甲苷对MF的改善作用以及黄芪甲苷调控细胞自噬的影响。
综上，本研究的结果表明黄芪甲苷通过激活ROCK/JNK通路促进自噬发挥保护作用，并发现MF与ROCK/JNK通路介导的自噬有关。然而，自噬在MF等不同疾病的特定阶段的具体作用机制仍不十分明确，自噬、MF以及两者之间的关系需要深入研究与进一步探索。
Alleviation of isoproterenol-induced myocardial fibrosis in mice by autophagy regulated by Astragaloside Ⅳ through activating ROCK/JNK pathway
-
摘要:
目的 探讨黄芪甲苷（AS-Ⅳ）激活ROCK/JNK调控自噬，改善异丙肾上腺素（ISO）诱导的小鼠心肌纤维化(MF)的作用及机制。 方法 将小鼠随机分为对照组、ISO诱导心肌纤维化组（MF组）、黄芪甲苷组、黄芪甲苷与Y-33075（ROCK抑制剂）联合组（黄芪甲苷+Y-33075组），重复给药持续30 d后，检测小鼠血清LDH、BNP、CTGF水平，超声检测心功能指标，天狼猩红、Masson染色检测各组小鼠心肌结构及组织纤维化程度， DHE检测各组小鼠心肌组织氧化应激（ROS）水平，蛋白印迹法检测心肌组织ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ表达。 结果 与黄芪甲苷组比较，黄芪甲苷+Y-33075组的EF值降低，心肌纤维化程度增加，血清LDH、BNP、CTGF水平升高，心肌组织ROS水平增高，ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ表达水平表达降低（P<0.05），表明Y-33075能够阻断黄芪甲苷对心肌纤维化的保护作用，并抑制黄芪甲苷对ROCK和JNK的调控。 结论 黄芪甲苷通过激活ROCK/JNK信号促进自噬减轻小鼠心肌纤维化。 Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of astragaloside Ⅳ(AS-Ⅳ) activating ROCK/JNK to regulate autophagy in improving isoproterenol (ISO) induced myocardial fibrosis (MF) in mice. Methods The mice were randomly divided into control operation group (Control group), ISO induced myocardial fibrosis group (MF group), AS-Ⅳ treatment group (AS-Ⅳ group) and combination group of astragaloside IV and Y-33075 (ROCK inhibitor) (astragaloside IV+Y-33075 group). After repeated administration for 30 days. The serum levels of LDH, BNP, CTGF in each group were detected. The cardiac function was detected by ultrasound. Myocardial structure and tissue fibrosis degree in each group were detected by Sirius Red and Masson staining. Oxidative stress (ROS) levels in myocardial tissue of each group were detected by DHE staining and the expression of ROCK, JNK, Atg5, Beclin 1, and LC3 Ⅰ/Ⅱ in myocardial tissue were detected by Western blotting. Results Compared with AS-Ⅳ group, the EF value of AS-Ⅳ+Y-33075 group decreased and the degree of myocardial fibrosis increased (P<0.05). The serum level of LDH, BNP, CTGF increased and the level of ROS in myocardial tissue increased while the expression of ROCK, JNK, Atg5, Beclin 1, LC3 Ⅰ/Ⅱ decreased (P<0.05). Y-33075 could block the protective effect of AS-Ⅳ on myocardial injury induced by MF and inhibit the regulation of AS-Ⅳ on ROCK and JNK. Conclusion AS-Ⅳ could attenuate myocardial fibrosis in mice by activating ROCK/JNK signal and promoting autophagy. -
Key words:
- myocardial fibrosis /
- autophagy /
- ROCK/JNK /
- astragaloside Ⅳ /
- mice
-
卡培他滨是一种新型的氟尿嘧啶类口服药，它是5-氟尿嘧啶（5-FU）的前体药物。卡培他滨口服给药方便、依从性好、疗效确切，是治疗结直肠癌的基石药物，但在治疗过程中产生的不良反应（手足综合征等）极大地影响了患者的治疗。手足综合征（HFS）是卡培他滨引起的不良反应中较为特殊的反应，也是卡培他滨在治疗过程中的药物剂量限制性不良反应，主要表现为皮肤红肿、水泡、出血、疼痛。合并使用环氧合酶、尿素霜、维生素B6、奥美拉唑也不能完全阻断手足综合征的发生[1-3]；合并使用中草药如白芍、桂枝、甘草等可降低手足综合征的发生率[4]。口服卡培他滨的患者手足综合征发生率高达60%[1]，严重降低患者用药依从性，严重手足综合征（约17%）的患者只能减少药物摄入量乃至停止服用药物，影响化疗按期、足量进行[5-6]。明确手足综合征的发生机制和有效干预对卡培他滨安全有效的应用具有重要价值。目前手足综合征模型的建立还没有统一的金标准，本实验尝试用ICR小鼠灌胃卡培他滨后建立手足综合征模型，为卡培他滨致手足综合征模型的建立及机制研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 动物与药品
雄性ICR小鼠，SPF级，5周龄左右，共42只小鼠，小鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。经上海中医药大学动物伦理委员会批准，实验动物伦理审查号为PZSHUTCM210715004。将小鼠随机编号1~42号，对照组ICR小鼠6只，实验组ICR小鼠36只。卡培他滨（商品名希罗达，上海罗氏制药有限公司，规格：0.5 g/片，国药准字号H20073024）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）(国药集团)；离心管（Titan公司）；动物解剖手术器材（瑞沃德公司）；消毒酒精、棉花球、锡箔纸（国药集团）。
1.2 饲养条件与环境
造模前小鼠先饲养1周，保证充足的水源与饲料，42只ICR小鼠自由摄取食物，环境湿度保持区间50%~60%（±5%），控制温度在(23±1) ℃，调节光照为12 h（6: 30至18: 30光照），其余时间为光暗周期。定期观察小鼠培养环境，定期为小鼠更换垫料，清理排泄物。
1.3 给药剂量、方式及周期
卡培他滨0.5 g/片，溶解于10 ml CMC-Na（0.5%）中，制得50 mg/ml悬浊液备用。实验组ICR小鼠（36只），灌胃给药，按275 mg/kg（即小鼠0.15 ml/30g）连续灌胃14 d，2次/d（按照卡培他滨临床给药方案1 250 mg/kg，2次/d的剂量换算）。对照组ICR小鼠（6只），灌胃给予CMC-Na（0.5%）溶液，按照4 ml/kg剂量连续的灌胃14 d，2次/d。
1.4 手足综合征阳性判断标准
1.4.1 小鼠手足综合征观察
取ICR小鼠的后足跖部皮肤组织，用生理盐水冲洗并擦干，以多聚甲醛（4%）对小鼠组织进行固定，石蜡包埋切片，使用苏木精-伊红对小鼠组织染色（H&E染色），使用普通光镜（比例尺5 μm）检测（注：染色呈现蓝色的为表皮层，该层位于淡粉色的角质层和淡蓝色的真皮层之间）。每天肉眼观察，若小鼠出现足跖部特征性改变，立即拍照并记录手足综合征发生时间，每3 d拍照记录小鼠足跖部皮肤变化情况。
1.4.2 小鼠体重观察
实验组与对照组自由饲养1周后称重，记录原始体重，灌胃给药后每3 d对所有实验小鼠称重一次并记录体重变化。
1.4.3 手足综合征阳性参考标准
标准参考美国国家癌症研究所（NCI）关于手足综合征的分级规定，建模实验中若实验小鼠足跖部的皮肤呈现了红色斑块、组织肿胀、角质层脱屑、溃疡、角质层厚度明显增加及其他明显体征者均可判定为手足综合征阳性。
1.5 样本收集方案
1.5.1 手足综合征阳性ICR小鼠的血浆和足趾部皮肤组织样本制备
对于手足综合征阳性的小鼠，在出现手足综合征后，经眼眶采样，用1.5 ml离心管（肝素钠抗凝）取血约0.5 ml，12 000 r/min离心10 min，收集血浆约0.25 ml，置于−80 ℃冰箱冷冻保存。采集小鼠血样后按照实验动物伦理要求规范处死小鼠，用手术剪取小鼠手足部皮肤，生理盐水冲洗后用锡纸包裹住样本并标号。所有样本置于−80 ℃冰箱冷冻保存，所有操作在1 h内完成。
1.5.2 手足综合征阴性ICR小鼠的血浆和足趾部皮肤组织样本制备
小鼠经过14 d给药未出现手足综合征阳性反应，则认定该类小鼠为造模失败小鼠，在第15天对该类小鼠统一进行眼眶采血和足趾部皮肤组织样本收集，方法同“1.5.1”。对照组小鼠在第15天收集样本，方法同“1.5.1”。
1.6 统计分析
数据采用平均值±标准差（mean±SD）表示，组与组之间根据数据分布状态比较采用学生t检验或秩检验，P<0.05认为有统计学差异。制图采用Excel或Graphpad 8.0软件。
2. 结果与讨论
2.1 小鼠体重变化及生存状态
通过对比对照组与实验组ICR小鼠体重变化，发现对照组ICR小鼠，灌胃14 d后，体重明显增加；而实验组ICR小鼠，灌胃14 d后，体重明显降低。表1和图1 为14 d内ICR小鼠的体重变化，实验过程中实验组小鼠死亡3只。
表 1 实验周期内小鼠体重变化情况（m/g，$ \bar{x}\pm s $ ）组别 n 0 d 7 d 14 d 对照组 6 28.54±0.71 32.56±0.88 34.66±1.07 实验组 33 29.07±0.76 26.84±1.74*** 23.15±2.31*** *** P<0.001，与对照组比较。 2.2 小鼠手足综合征病理观察
与对照组ICR小鼠相比，19只实验组小鼠的足底皮肤明显出现红斑、肿涨并出现少许水泡（图2），认为该小鼠出现手足综合征，按照伦理要求将小鼠处死，收集足底皮肤组织样本和血浆样本。
2.3 小鼠足底皮肤H&E染色
将ICR小鼠四肢皮肤用4%多聚甲醛固定后进行H&E染色（因苏木精呈碱性，细胞核内的染色质与胞质内的核酸显紫蓝色；伊红呈酸性，细胞质和细胞外基质中的成分显红色），如图3显示。与正常ICR小鼠相比，手足综合征阳性小鼠皮肤表皮层增厚，角质层呈现粉红色，真皮层呈现浅蓝色，表皮层处在二者之间呈现蓝色。发生HFS小鼠皮肤颗粒层变薄，基底层和棘层间细胞数量减少。正常小鼠角质层明显较薄。
2.4 小鼠手足综合征发生率
ICR小鼠共39只（对照组6只，实验组33只），19只实验组ICR小鼠出现手足综合征阳性症状，发生率为57.58%。实验组ICR小鼠灌胃给药1周，出现手足综合征阳性小鼠与未出现手足综合征小鼠相比：实验组小鼠足底皮肤颜色变深（深红色），少量小鼠四肢掌心有透明水泡样组织出现；在灌胃给药10 d后，实验组小鼠出现手足综合征阳性症状，四肢出现了红斑、脱屑、水泡（红斑出现最多，脱屑其次，水泡最少）等情况。
2.5 卡培他滨及其代谢产物暴露浓度分析
将收集的血浆样本按照前期报道的方法进行卡培他滨及其5种代谢产物（5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、去氧氟尿苷、5'-氟-2'-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮[7]）定量（ng/ml，mean±SD）。结果发现，发生手足综合征小鼠与未发生手足综合征小鼠相比，卡培他滨浓度(ng/ml)分别为(58.08±44.54)和(39.23±26.98)，5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷浓度(ng/ml)分别为(
6047.42 ±3331.94 )和(4442.77 ±2140.44 )，去氧氟尿苷浓度(ng/ml)分别为(2899.28 ±1821.15 )和(2018.81 ±1037.86 )，5'-氟-2'-脱氧尿苷浓度(ng/ml)分别为(112.89±36.85) 和(122.23±19.16)，5-氟尿嘧啶浓度(ng/ml)分别为(46.86±23.08)和(38.33±20.62)，5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮浓度(ng/ml)分别为(24.45±14.79)和(27.34±17.84)。卡培他滨及其代谢产物在发生和未发生手足综合征小鼠体内暴露水平均无明显差异（P>0.05，图4）。
图 4 卡培他滨及其代谢产物暴露浓度分析注：Cap：卡培他滨；5-DFCR：5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷；5-DFUR：去氧氟尿苷；2-DFUR：5'-氟-2'-脱氧尿苷；5-FU：5-氟尿嘧啶；FUH2：5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮。3. 讨论
体内药物暴露水平同药物疗效和不良反应密切相关。目前药物暴露水平常用的参数有曲线下面积（AUC）、稳态浓度（css）、峰浓度（cmax）、谷浓度（cmin）等。有研究发现[8]，根据5-FU的AUC调整给药剂量后，患者血液系统出现3~4级不良反应发生率从之前的17.5%下降为 7.6%（P<0.05），黏膜炎的发生率也从5%降低为0%（P<0.01），总生存时间显著增加，从原来的16个月延长到22个月（P<0.01）。因此，5-FU在体内浓度可能成为预测疗效及不良反应的潜在预警生物标志物之一[9-10]。本研究中未发现卡培他滨及其代谢产物同手足综合征具有相关性，但Daher Abdi在20名75岁以上老年患者中发现，卡培他滨及其代谢产物在发生手足综合征患者体内暴露水平明显较高[11]，但体外研究表明，5-FU同手足综合征无明显关联[12]。另有研究表明，手足皮肤局部较高表达的胸苷磷酸化酶可产生局部较高浓度的5-FU，同卡培他滨引发的手足综合征密切相关[13]。总之，卡培他滨引发手足综合征的机制仍需进一步研究。
在卡培他滨致手足综合征模型的建立方面，黎鹏等灌胃给予SD大鼠200~400 mg/d，2次/d，用药1~2周（1周后停药3 d），建立了卡培他滨致手足综合征模型，并认为200 mg/kg的剂量，灌胃2周可较好地建立手足综合征模型（造模成功率77.5%）[14]。但有研究显示，卡培他滨在大鼠体内的代谢过程与人体不同，因大鼠体内胞苷脱胺酶活性较低，5-DFCR通过糖基化生成其他产物，产生的5-FU较少，而卡培他滨在小鼠体内的代谢过程与人体基本相同，可能是最好的动物模型[15-16]；Hiromoto [3]等利用ICR小鼠，灌胃给予200 mg/kg，1次/d，5次/周的方法建立手足综合征模型，3周建立手足综合征模型，但成功率未报道。He和Chen等给予ICR小鼠灌胃200 mg/kg，1次/d，连续灌胃30 d后，6只小鼠中仅有1只未发生手足综合征[17]。前期预实验中，采用灌胃200 mg/kg，2次/d的方法在ICR小鼠上建立手足综合征模型，灌胃1周后，6只小鼠仅有1只发生手足综合征。因此，根据临床卡培他滨用药剂量（1 250 mg/kg，2次/d）换算小鼠剂量为275 mg/kg，2次/d，既缩短了给药时间，又提高了建模成功率（57.6%），且较少有小鼠死亡（3只）。
4. 小结
本实验成功建立了卡培他滨致手足综合征的ICR小鼠模型，在给药时长、造模成功率方面均有一定优势。卡培他滨及其代谢产物在小鼠体内暴露浓度同手足综合征发生可能无关。手足综合征的发生机制仍需进一步研究。
-
图 1 Masson、天狼星红染色检测各组心肌组织纤维化程度（×400, n=5）
A. Masson染色代表性图像；B.天狼星红染色代表性图像；C.各组心肌组织胶原容积分数；*P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
图 2 DHE染色检测各组小鼠心肌组织氧化应激水平（×400, n=5）
A.DHE染色代表性图像；B.各组心肌组织活性氧簇表达水平统计图；*P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
图 3 Y-33075阻断黄芪甲苷改善MF所致心肌细胞自噬（n=5）
A. ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ和GAPDH的免疫印迹图；B-G. ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ和GAPDH的表达水平；*P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
图 4 Y-33075阻断黄芪甲苷改善MF所致心肌细胞自噬水平的LC3-I/II免疫荧光染色（×400, n=5）
A. LC3-I/II、DAPI和Merge的免疫荧光染色图像；B. LC3-I/II相对荧光强度统计图；*P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
表 1 相关引物序列
基因 上游序列(5'-3') 下游序列(5'-3') BNP TAGCCAGTCTCCAGAACAAATCC AAACAACCTCAGCCCGTCA CTGF CAGCATGGACGTTCGTCTG AACCACGGTTTGGTCCTTGG Atg5 CAGAAGCTGTTCCGTCCTGT CCGTGAATCATCACCTGGCT GAPDH AGAACATCATCCCTGCATCC AGTTGCTGTTGAAGTCGC 
下载: 导出CSV
表 2 各组小鼠超声测量心功能结果(n=10)
检测项目 对照组 MF组 黄芪甲苷组 黄芪甲苷+
Y-33075组LVEF (%) 72.31±6.27 35.43±8.12* 55.25±7.43^ 40.28±11.36# LVAWd (mm) 1.51±0.03 1.94±0.25* 1.62±0.20^ 1.71±0.18# LVEDV(μl) 57.92±7.23 49.78±9.36* 56.32±6.28^ 50.79±5.46# *P<0.05，与对照组比较； ^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
下载: 导出CSV
表 3 各组小鼠血清LDH、BNP、CTGF水平比较(n=10)
检测项目 对照组 MF组 黄芪甲苷组 黄芪甲苷+Y-33075组 LDH（U/L） 395.25±30.38 1102.43±62.35* 500.89±19.48^ 974.21±101.72# BNP（ng/L） 80.29±12.90 200.61±31.92* 137.33±19.28^ 194.72±26.31# CTGF（ng/L） 121.91±20.25 213.37±29.58* 163.05±10.29^ 189.03±25.42# *P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
下载: 导出CSV
表 4 各组小鼠心肌组织BNP、CTGF、 Atg5的mRNA相对表达量(n=5)
项目 对照组 MF组 黄芪甲苷组 黄芪甲苷+Y-33075组 BNP 1 4.02±0.59* 1.59±0.33^ 3.98±0.49# CTGF 1 1.62±0.23* 0.91±0.37^ 1.54±0.29# Atg5 1 0.53±0.09* 2.56±0.61^ 0.69±0.30# *P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
下载: 导出CSV
-
[1] LIU J Y, LI W, DENG K Q, et al. The E3 ligase TRIM16 is a key suppressor of pathological cardiac hypertrophy[J]. Circ Res, 2022, 130(10): 1586-1600. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.318866 [2] YUAN J, LIU H B, GAO W, et al. MicroRNA-378 suppresses myocardial fibrosis through a paracrine mechanism at the early stage of cardiac hypertrophy following mechanical stress[J]. Theranostics, 2018, 8(9): 2565-2582. doi: 10.7150/thno.22878 [3] DENG K Q, ZHAO G N, WANG Z H, et al. Targeting transmembrane BAX inhibitor motif containing 1 alleviates pathological cardiac hypertrophy[J]. Circulation, 2018, 137(14): 1486-1504. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.117.031659 [4] ZHAO G J, ZHAO C L, OUYANG S, et al. Ca2+-dependent NOX5 (NADPH oxidase 5) exaggerates cardiac hypertrophy through reactive oxygen species production[J]. Hypertension, 2020, 76(3): 827-838. doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.120.15558 [5] ZHOU H, LI Y J, WANG M, et al. Involvement of RhoA/ROCK in myocardial fibrosis in a rat model of type 2 diabetes[J]. Acta Pharmacol Sin, 2011, 32(8): 999-1008. doi: 10.1038/aps.2011.54 [6] KANLAYA R, THONGBOONKERD V. Persistent Escherichia coli infection in renal tubular cells enhances calcium oxalate crystal-cell adhesion by inducing ezrin translocation to apical membranes via Rho/ROCK pathway[J]. Cell Mol Life Sci, 2022, 79(7): 381. doi: 10.1007/s00018-022-04414-y [7] FENG H, ZHU X Y, TANG Y, et al. Astragaloside Ⅳ ameliorates diabetic nephropathy in db/db mice by inhibiting NLRP3 inflammasome-mediated inflammation[J]. Int J Mol Med, 2021, 48(2): 164. doi: 10.3892/ijmm.2021.4996 [8] 底雪梅, 袁曜晖, 张超, 等. 黄芪甲苷抑制U937巨噬细胞CCL18表达及其作用机制研究[J]. 药学实践杂志, 2019, 37(1): 32-36, 41. [9] ZHANG X, QU H, YANG T, et al. Astragaloside Ⅳ attenuate MI-induced myocardial fibrosis and cardiac remodeling by inhibiting ROS/caspase-1/GSDMD signaling pathway[J]. Cell Cycle, 2022, 21(21): 2309-2322. doi: 10.1080/15384101.2022.2093598 [10] CHEN Y M, GE Z W, HUANG S X, et al. Delphinidin attenuates pathological cardiac hypertrophy via the AMPK/NOX/MAPK signaling pathway[J]. Aging, 2020, 12(6): 5362-5383. doi: 10.18632/aging.102956 [11] LIU W J, WANG G, ZHANG C C, et al. MG53, A novel regulator of KChIP2 and Ito, f, plays a critical role in electrophysiological remodeling in cardiac hypertrophy[J]. Circulation, 2019, 139: 2142-2156. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.029413 [12] LIN H B, NAITO K, OH Y, et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance[J]. Circulation, 2020, 142(23): 2240-2258. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.119.041213 [13] LI P L, LIU H, CHEN G P, et al. STEAP3 (Six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3) inhibits pathological cardiac hypertrophy[J]. Hypertension, 2020, 76(4): 1219-1230. doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.120.14752 [14] WU X Q, LIU Z M, YU X Y, et al. Autophagy and cardiac diseases: therapeutic potential of natural products[J]. Med Res Rev, 2021, 41(1): 314-341. doi: 10.1002/med.21733 [15] VANHOUTTE D, SCHIPS T G, VO A, et al. Thbs1 induces lethal cardiac atrophy through PERK-ATF4 regulated autophagy[J]. Nat Commun, 2021, 12(1): 3928. doi: 10.1038/s41467-021-24215-4 [16] TONG M M, SAITO T, ZHAI P Y, et al. Alternative mitophagy protects the heart against obesity-associated cardiomyopathy[J]. Circ Res, 2021, 129(12): 1105-1121. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.319377 [17] DENG Z H, JIA Y M, LIU H F, et al. RhoA/ROCK pathway: implication in osteoarthritis and therapeutic targets[J]. Am J Transl Res, 2019, 11(9): 5324-5331. [18] WANG Z H, REN D B, ZHENG P. The role of Rho/ROCK in epileptic seizure-related neuronal damage[J]. Metab Brain Dis, 2022, 37(4): 881-887. doi: 10.1007/s11011-022-00909-6 [19] DIETERLE M P, HUSARI A, STEINBERG T, et al. Role of mechanotransduction in periodontal homeostasis and disease[J]. J Dent Res, 2021, 100(11): 1210-1219. doi: 10.1177/00220345211007855 [20] GUO M, XU J M, WANG S W, et al. Asiaticoside reduces autophagy and improves memory in a rat model of dementia through mTOR signaling pathway regulation[J]. Mol Med Rep, 2021, 24(3): 645. doi: 10.3892/mmr.2021.12284 [21] LI Y C, WANG H H, ZHANG R, et al. Antitumor activity of asiaticoside against multiple myeloma drug-resistant cancer cells is mediated by autophagy induction, activation of effector caspases, and inhibition of cell migration, invasion, and STAT-3 signaling pathway[J]. Med Sci Monit, 2019, 25: 1355-1361. doi: 10.12659/MSM.913397 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 3892
- HTML全文浏览量: 1552
- PDF下载量: 18
- 被引次数: 0
