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癌症的发病率和病死率呈逐年上升趋势，对大多数癌症的主要治疗方法是手术、放射疗法、化学疗法和免疫疗法。但由于其具有易转移、复发和对放/化疗耐受的产生，使得临床疗效和预后不满意，而传统中药一直被认为是改善肿瘤化疗不良反应的一种新的抗癌药物来源。黄芩的干燥根在我国广泛用于多种疾病的治疗，包括抗癌、抗炎、抗心血管疾病和感染等。研究表明，黄芩素在肿瘤的体外活性实验中效果显著，被认为是治疗肿瘤的潜在药物，推测其作用与黄酮含量有关。据报道，饮食中摄入类黄酮成分与降低癌症风险显著相关[1]。
黄芩素（baicalein，BE），全名5, 6, 7-三羟基-2苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮（图1），是从唇形科植物黄芩的干燥根中分离出来的一种多羟基黄酮类化合物。研究表明，BE是一种多靶点的天然抗肿瘤化合物，目前已提出多种针对植物BE的抗肿瘤作用机制，例如清除氧化自由基、抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，抑制蛋白激酶B（protein kinase B, PKB，又称Akt）或哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）活性、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制其侵袭和表达等。因此，本文旨在结合国内外研究现状，综述BE对肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌等多种肿瘤的药理作用及其机制 [2-3]。
图 1 黄芩素的结构式
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在多种类型的癌症中都发现了分化抑制因子1（inhibitor of diferentiation 1, Id1）蛋白的过表达，包括肺癌。据报道，Src信号通路是Id1表达的必要途径，诱导Id1的表达可促进肺癌细胞的生长和转移，反之，则可显著抑制其细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，Id1是癌症治疗中的潜在分子靶标[4]。Zhao等[4]通过向裸鼠注射A549细胞来建立原位肺癌模型，并评估了黄芩素的抗肿瘤作用以及Id1相关蛋白在体内外的表达。结果表明，黄芩素可以使肿瘤组织体积减小，抑制Id1蛋白、上皮-间质转化(EMT)、间质细胞标志物(N-钙黏蛋白, 波形蛋白)的表达，并且首次证实了黄芩素通过靶向Src/Id1途径抑制原位移植非小细胞肺癌的肿瘤生长。
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Gao等[5]研究了黄芩素对人肺癌细胞A549、SK-LU-1和SK-MES-1的生长和凋亡的影响，发现黄芩素可抑制A549和SK-MES-1细胞的增殖。其中对A549细胞的作用是通过降低细胞周期蛋白（cyclin）A的表达来阻断细胞分裂S期，而对SK-MES-1细胞的作用是通过降低细胞周期蛋白D1的表达阻断细胞分裂的G0/G1期。此外，黄芩素还可通过增加p53和Bax的表达来加快肺癌细胞的凋亡。
BE可通过调节不同类型的细胞周期蛋白(cyclins)和细胞周期依赖性激酶(cyclin dependent kinase，CDKs)水平来抑制细胞周期进展，从而抑制肿瘤细胞的增殖。Su等[6]发现当黄芩素浓度为0、20、40、60、80、100 µmol/ L时，可以抑制A549和H1299细胞的增殖。该小组发现当黄芩素的浓度为80 µmol/ L，持续作用48 h时，其抑制效率最高，推测与细胞增殖相关的细胞周期蛋白D1（CD1）和周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)重组蛋白表达水平的下调有关。据报道，黄芩素通过降低CDK1和CD1以及上调Bax / Bcl-2的比例，阻碍了S期分裂和半胱天冬酶（caspase）-3酶原的活化，抑制非小细胞肺癌H460细胞生长并诱导凋亡[7]。此外，还发现黄芩素可以抑制细胞EMT和Notch信号通路，从而抑制肿瘤细胞的侵袭。
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黄芩素还可以作为肺癌常规化疗药物的增敏剂，Lu等[8]研究发现黄芩素可通过下调miR-424-3p，并靶向作用于PTEN / PI3K / Akt信号途径，来抑制A549和H460细胞的生长和增加顺铂的敏感性。该小组在后期的细胞毒性实验中证实，BE仅对A549和H460细胞呈剂量依赖性，而对正常人支气管上皮细胞毒性较小。Lu等[9]研究表明黄芩素和抗肿瘤药多西他赛联用时，可增加微管的稳定性并阻断细胞周期的进程，从而协同抑制A549细胞和Lewis肺癌细胞的增殖，最终诱导细胞凋亡，并评估其具有较好的安全性和有效性。因此，黄芩素作为一种新型的单用和协同抗肿瘤药时，具有较好的发展前景。
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磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt，也称为蛋白激酶B（PKB），是信号通路的关键分子[10]。PI3K/Akt信号通路参与多种生物过程，例如恶性肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、血管生成、侵入和转移等，同时诱导肝癌细胞凋亡的药物也可能会干扰PI3K / Akt信号通路。BE可通过上调p21和p27的表达，抑制PI3K/Akt通路，阻滞S期和G2/M期的细胞周期，从而抑制Bel-7402细胞的增殖[11]。另一项研究表明，黄芩素可调控PI3K/Akt信号通路，与LY294002联合用药，诱导SMMC-7721细胞凋亡，是治疗包括肝癌在内的多种癌症的有效途径。阻断程序性细胞死亡蛋白配体1（programmed death ligand1, PD-L1）/ 程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein-1, PD-1)途径以防止肿瘤细胞的免疫逃逸是治疗包括肝癌（HCC）在内的多种癌症的有效方法。Ke等[12]发现BE对肝癌细胞除了具有直接的细胞毒性外，还可通过降低信号和激活因子3（STAT3）的活性，进一步下调干扰素-γ（IFN-γ）诱导的PD-L1表达来增强T细胞的免疫应答，以杀死肿瘤细胞。
长非编码RNA已被证实是癌症的治疗靶标，该种编码的过度表达可增强黄芩素在体外抑制肝癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡和迁移，在体内具有抑制肿瘤生长等作用。此外，长非编码RNA还可抑制IκBα磷酸化、NF-κB核易位和活性，增强了黄芩素对NF-κB信号传导的影响。对调节NF-κB信号传导在体内外的抗肝癌作用具有显著效果，所以长非编码RNA和黄芩素联合用药可能是肝癌的潜在治疗策略[13]。
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CD24是一种小的糖基化黏蛋白样细胞表面蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚固附着在细胞膜上。在血液系统恶性肿瘤包括各种实体瘤中都可以观察到CD24的上调，例如神经胶质瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌和前列腺癌等[14]。研究表明，黄芩素可通过下调CD24中的mRNA的表达来抑制肝癌细胞的生长和存活[15]。
人类早期肝损伤，原发性和转移性肝肿瘤以及肿瘤衍生的细胞系的遗传分析证据明确表明，c-Myc失调是肝癌发生和发展的关键改变。Myc位的染色体畸变是晚期人类肝癌中最常见的异常基因，由于c-Myc是细胞周期进程，细胞凋亡和细胞转化的关键调节剂，靶向该基因的药物可能会获得更有效的抗癌作用并改善HCC的治疗。Han等[15]通过高通量筛选了14种植物提取物的抗肝癌能力，结果证实黄芩素是c-Myc表达的最有效抑制剂，可显著降低c-Myc在HCC细胞中的表达，从而诱导HCC细胞凋亡。
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自噬是一种高度受控的过程，可响应癌细胞中的饥饿，代谢应激和细胞毒性等各种类型的刺激[12]。研究发现黄芩素可触发肝癌细胞的保护性自噬，AKT / mTOR途径被称为自噬的关键调节因子，在HepG2细胞中被黄芩素抑制[16]。另一项研究表明，黄芩素通过人肝癌细胞SMMC-7721和Bel-7402的内质网应激诱导自噬[17]。
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基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）是乳腺癌细胞侵袭和迁移的关键蛋白酶。黄芩素可通过抑制MMP-2和MMP-9的活性（通过抑制Akt途径）来显著抑制细胞迁移和侵袭，这两种酶是乳腺癌细胞的重要因子[18]。Wang等[19]证实了这一点，BE可通过抑制MMP-2和MMP-9的激活和表达来介导MDA-MB-231细胞的侵袭性。MDA-MB-231细胞中的MAPK/MMP信号传导有助于潜在的侵袭机制，这表明MAPK信号传导是高度侵袭性乳腺癌细胞的潜在标志和治疗靶标。Chen等[20]发现BE可明显抑制17β-雌二醇（E2）和GPR30激动剂(G-1)诱导的乳腺癌细胞侵袭以及基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达和激活。Gao等[21]报道了黄芩素通过抑制组织特异性核机制结合蛋白1（special AT-rich binding protein1，SATB1）的表达来抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭性。SATB1在许多实体肿瘤中高表达，被认为是抗肿瘤药物的重要靶分子之一。
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上皮-间质转化（EMT）是乳腺癌细胞在迁移和侵袭过程中发挥作用的关键步骤。Chung等[22]报道了黄芩素可抑制乳腺癌上皮细胞的上皮-间质转化从而起到抗乳腺癌作用。另外一项研究表明，黄芩素不仅可直接作用于乳腺癌细胞还可通过调节乳腺癌巨噬细胞的极化和上皮-间质转化（EMT）来抑制乳腺癌细胞生长，为BE用于乳腺癌以及其他癌症的治疗提供了新的见解[23]。Ma等[24]的研究则表明黄芩素可通过下调SATB1和Wnt/β-catenin途径来抑制EMT，进一步抑制体内外人乳腺癌MDA-MB-231细胞的转移，也有研究指出，黄芩素可通过下调MDA-MB-231乳腺癌细胞中的Cyr61和LOXL-2的表达来抑制EMT[25]。
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细胞衰老是一个正常的二倍体细胞停止分裂和生长停滞，但仍能存活、代谢并具有独特的转录谱和基因调控特征的生物学过程。对衰老细胞产生的分子机制及其分子调控的进一步了解，将为设计新的癌症疫苗或治疗方法开辟新的途径。丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路与许多生理效应有关，包括细胞凋亡，细胞增殖和衰老。MAPK信号通路在调节细胞周期再进入和致癌性RAS诱导的衰老中起重要作用[26]。黄芩素可诱导人结肠癌细胞特异性MAPK p38和ERK1/2信号通路的选择性调控，从而可控制肿瘤细胞周期阻滞、凋亡和衰老的分子过程。核因子E2相关因子（nuclear factor erythroid-derived factor2-related factor，Nrf2）与抗氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）结合构成Nrf2/ARE通路。可启动下游多个抗氧化、抗肿瘤、抗炎蛋白、解毒酶等的表达，是机体抵御各种氧化应激的重要保护通路。Havermann等[19]发现，黄芩素通过激活Hct116人结肠癌细胞中Nrf2/ARE通路和秀丽隐杆线虫中SKN-1基因的应激反应而发挥抗肿瘤作用。Wang等[27]则证明钌-黄芩素复合物可通过激活p-53依赖性细胞凋亡，调节AKT/mTOR和WNT/β-catenin的信号通路发挥化学治疗作用，并能通过诱导细胞凋亡来减少大鼠结肠组织中的ACF多样性和增生性病变。Su等[28]研究发现黄芩素使孕酮诱导的蜕膜蛋白DEPP和DNA损伤诱导45（Gadd45a）的表达上调，通过在Gadd45a和JNK/p38之间形成正反馈环，促进MAPK的激活，可明显引起人结肠癌细胞的凋亡。总的来说，这些发现确定了黄芩素是一种具有较好发展前景的治疗结肠癌的抗肿瘤药。
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据相关研究报道，黄芩素通过活化caspase依赖的线粒体途径并抑制Akt磷酸化，从而诱导T24膀胱癌细胞凋亡。更具体地说，黄芩素通过阻断G1/S期的细胞周期进程来抑制T24细胞的生长，并通过激活caspase-9和caspase-3、下调B淋巴细胞瘤2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)的表达和上调Bcl2-associated X的蛋白(Bax)的表达来诱导膀胱癌细胞的凋亡[29]。黄芩素还可通过下调miRNA-106来抑制JNK和MEK / ERK通路，从而抑制T24细胞的增殖和迁移，并诱导其凋亡。这项研究为黄芩素在膀胱癌的治疗中提供了新的调节机制，有助于确定膀胱癌治疗的新靶标。
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活性氧(ROS)作为一类具有高度生物活性的分子，在肿瘤中得到了广泛的研究。癌细胞通常比正常细胞表现出更高水平的ROS，这主要是由于它们的代谢增加、致癌基因激活和线粒体功能障碍。过量的活性氧浓度会导致各种类型的细胞死亡。最近一项研究表明，黄芩素可刺激膀胱癌5637细胞内ROS的生成，并且ROS的产生与凋亡细胞线粒体功能紊乱呈正相关[30]。
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黄芩是我国重要的中药材，在中国及其亚洲其他国家都有广泛的应用。通过其活性成分和对不同类型癌症的抗肿瘤机制的研究进展，将为癌症治疗提供新的潜在策略。本文综述了黄芩素的多种作用机制，包括阻断细胞周期，诱导凋亡，抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，增强化学治疗剂的作用，触发自噬细胞死亡等。近年来，黄芩素的临床前研究取得了令人鼓舞的进展，但仍需要进一步研究以改善其生物学作用。我们有理由相信黄芩素可能会被开发为一种新型的抗癌药，可以单独使用或与化学治疗药联合使用，从而改善癌症患者的用药多样性，减少癌症患者的痛苦和提高癌症患者的生存周期。
New advances in baicalein's antitumor effects and mechanisms
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摘要: 黄芩素（baicalein, BE）是来源于黄芩干燥根中的有效成分，在结构上属于多羟基黄酮类化合物，具有多种药理活性。其中，黄芩素的抗肿瘤作用受到广泛的关注，它可以通过诱导肿瘤细胞凋亡和侵袭，抑制肿瘤血管生成，清除自由基等来发挥抗肿瘤作用。结合近年来国内外研究现状，对黄芩素在其抗肿瘤作用及其机制研究作一综述，为寻找开发潜在的新型抗肿瘤药物提供理论依据。Abstract: Baicalein (BE) is an active ingredient derived from the root of Scutellaria baicalensis Georgi. It is a polyhydroxyflavonoid in structure and has many biological activities. Among them, the antitumor effects of baicalein have received widespread attention. It exerts anti-tumor effects by inducing tumor cell apoptosis and invasion, inhibiting tumor angiogenesis, and eliminating free radicals. This article reviews the most recent research works of baicalein in its anti-tumor effects and mechanisms. It is aimed to provide a theoretical basis for the search and development of potential new anti-tumor drugs.
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Key words:
- baicalein /
- anti-tumor /
- mechanism
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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是一种重要的代谢产物，其参与许多生化过程，如能量代谢、基因表达调控、DNA修复等[1, 2]。人体皮肤、血液、肝脏、肌肉和大脑中的NAD+浓度会随着年龄的增长而降低，因此，增强NAD+可能在缓解相关的细胞功能和整体健康受损方面发挥关键作用[3]。烟酰胺单核苷酸（NMN）是NAD+生物合成的前体。体内外研究表明，补充NMN可以提高NAD+水平[4]。NMN可以缓解各种心脑血管疾病的发展，包括中风[5]、心力衰竭[6]和心肌缺血等[7]。此外，NMN还与改善线粒体功能和潜在的抗衰老益处有关[8]。几项临床试验探索了NMN补充剂的有效性和安全性（标识号：NCT04228640[9]，NCT04823260[10]，UMIN000036321[11]）[8]，证明了其对心血管保护的潜力。然而，NMN的研究仍然缺乏大规模可靠的人体试验数据，特别是关于其治疗高血压等特定疾病的疗效问题。虽然早期研究显示了一些有希望的结果，但需要更广泛的基础研究和临床试验来证实其在不同患者群体中的疗效和安全性。
高血压是一系列健康问题的重要危险因素，包括心脏、肾脏疾病以及中风等脑血管疾病[12]，影响着全世界数百万人[13]。高血压的危险在于，随着时间的推移会导致靶器官损伤，发生如动脉粥样硬化、肾功能衰竭、心力衰竭和中风等疾病。高血压的发生与衰老和肥胖等因素有关，而这两者都源自于NAD+缺乏。因此，NAD+已成为高血压的潜在治疗靶点。
目前关于NMN对高血压的影响研究相对有限。只有一项临床前实验表明NMN可以降低血管紧张素II（Ang II）诱导的高血压小鼠的血压[14]。另有一项临床研究表明，补充NMN可以降低高血压患者的血压（标识号：NCT04903210[14]）。然而，目前的证据不足以将NMN开发为抗高血压药物，特别是其缺乏较为全面的临床前药效评价。因此需要更严格的研究来确定NMN是否能作为高血压治疗药物。自发性高血压大鼠（SHR）是一种遗传性高血压模型动物，常用于评估抗高血压药物[15-17]。双肾双夹（2K2C）大鼠是一种实验性易卒中肾血管性高血压模型动物，这些大鼠在术后2周内100%发生高血压[15, 16]，也常用于评估抗高血压药物。本次研究中，我们采用单次胃瘘给药和长期药物饲料喂养方式给予受试大鼠NMN治疗，观察NMN对原发性和继发性高血压大鼠模型的血压和器官损伤的影响。此外，我们还观察了终身给药NMN对2K2C大鼠模型死亡率和寿命的影响[15]。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（160~180 g）购于上海必凯科翼生物科技有限公司。2K2C大鼠由SD大鼠双侧肾动脉嵌套0.2 mm内径的U型银夹制作而成。雄性SHR（250~290 g）购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
所有大鼠均饲养于独立通气笼盒（IVC）系统中，饲养温度为24±2°C，相对湿度为40%~60%，照明时间为8:00~20:00，自由饮食和饮水（特定情况除外）。本实验研究严格遵守实验动物福利等伦理原则。
1.2 实验试剂和仪器
NMN（批号2021046B）由尚科生物医药（上海）有限公司提供，氯沙坦钾（Losartan）（批号LOSB-4-06210326）由浙江美诺华药业股份有限公司提供，戊巴比妥钠购于德国Merck公司，注射用青霉素钠购于山东鲁抗医药股份有限公司，肝素钠（批号H3v60）购于上海博光生物科技有限公司，EVG弹力纤维染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。
U型银夹（0.2 mm内径）、血压与心率分析系统（型号MPA-HBBS）购于上海奥尔科特生物科技有限公司，聚乙烯导管购于法国Biotrol公司。
1.3 实验方法
1.3.1 实验分组和治疗方案
NMN单次给药治疗研究：包括SHR和2K2C大鼠两种模型，在各自模型实验中，大鼠均被随机分配为对照组（蒸馏水）和NMN给药组（200 mg/kg），并通过胃瘘导管给药。
NMN长期给药（4周）治疗研究：包括SHR和2K2C大鼠两种模型，在各自模型实验中，大鼠均被随机分配为对照组（普通饲料）和NMN给药组[药物饲料，等效NMN剂量200 mg/（kg·d）]。
生存时间观察研究：采用2K2C大鼠模型，实验包括假手术组（正常SD大鼠，普通饲料）和2K2C造模组，2K2C造模组大鼠再被随机分为模型组（普通饲料）、氯沙坦给药组[药物饲料，等效剂量20 mg/（kg·d）]和NMN给药组[药物饲料，等效剂量200 mg/（kg·d）]。
1.3.2 2K2C大鼠模型制备
2K2C模型是通过在正常SD大鼠的两个肾动脉上放置0.2 mm尺寸的银夹后造成的高血压模型，参考本教研室文献及方案[16,17]。简言之，SD大鼠用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，腹部切口，轻轻翻转肾脏，游离出肾动脉后放上内径为0.2 mm的U形银夹。在另一侧肾脏重复相同步骤。小心复位肾脏和周围组织。假手术的大鼠进行相同的操作至游离血管步骤，但不放置U形银夹。以上步骤完成后，滴加青霉素，缝合。然后将大鼠放在电热毯上，苏醒后送回IVC系统笼。
1.3.3 胃瘘给药操作方法
用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，腹部区域脱毛并消毒，自剑突下沿腹部中间切口2 cm，使用无菌棉签将胃轻轻拉出，于近幽门段并且避开血管作荷包预缝合，预留区域内戳出小孔，迅速将胃瘘导管缠有胶布端插入胃内，拉紧预缝合线固定导管，经背部皮下牵引至颈后穿出并固定。随后，将胃瘘导管以大鼠马甲方式固定于背部防止动物清醒后抓咬。手术完成后，动物于电热毯上保温至复苏。
1.3.4 清醒自由活动测量血压
参考本教研室文献及方案[15, 16]，用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，左侧腹股沟区域脱毛并消毒，并沿股动脉方向切开皮肤，暴露股动脉。游离出一段股动脉，插入特制的PE测压导管，导管前端依次穿行过股动脉、髂总动脉并最后进入腹主动脉，此时测得血压为腹主动脉血压，导管的另一端沿皮下穿行至颈部背侧皮肤后穿出，用自制马甲固定，缝合伤口。术后，大鼠饲养于测量系统笼里适应环境，自由饮食和饮水。24 h后，测压导管连接压力传感器，经MPA-HBBS数据分析系统处理后将压力信号转化为血压波形显示在电脑屏幕上。同时以0.3 ml/h的速率连续输注25 U/ml肝素钠，以防止测压过程中凝血。
NMN单次给药实验中，大鼠股动脉插管手术后次日上午9:00开启测量系统，连续记录血压和心率信号。12:00，通过胃管给予相应的药物（NMN或蒸馏水）。连续记录24 h血压和心率变化（取给药前1 h的数据作为基础血压和心率）。NMN长期给药实验中，NMN给药组和对照组的大鼠同样使用上述方法进行血压和心率测量，并连续记录2 h。
1.3.5 器官大体形态学和病理形态学分析
在完成血压和心率测量后，大鼠再次麻醉并迅速打开胸腔，用4 ℃预冷的生理盐水对大鼠进行心脏灌注。取出脑、肝脏、心脏、肾脏和主动脉（从左锁骨下动脉分支到横膈膜段），测量器官重量，以及主动脉长度、左心室壁厚度、肾皮质和髓质厚度。随后，将脑、心脏、主动脉、和肾脏用4%多聚甲醛固定，并进行病理形态学分析，包括EVG、苏木素-伊红（HE）和Masson染色[18]。
1.3.6 统计学分析
所有实验数据均以“均值±标准误（mean±SEM）”表示。使用GraphPad Prism 10软件进行统计分析。使用非配对Student-t检验进行组间比较，生存曲线使用Log-rank检验分析。以P<0.05为具有统计学差异。
2. 结果
2.1 单次NMN治疗未降低SHR的血压和器官损伤程度
SHR是一种原发性高血压大鼠模型，单次给予200 mg/kg NMN后，2 h内，NMN给药组和溶剂对照组的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率没有显著差异（图1：A-D）。对NMN给药后2 h和24 h内的区间血压进行测量分析，两组的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率均值也没有显著差异（图1：E-H）。
图 1 单次NMN治疗对SHR的血压、心率及靶器官损伤的影响（n=5）A-D. 单次给药后2 h内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率的动态测量值；E-H. 单次给药前和给药后2、24 h区间内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率平均值；I. 脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量；J. 主动脉重量与长度比；K. 左心室壁厚度；L. 肾皮质与髓质厚度比；M. 脑血管EVG染色、心脏Masson染色、主动脉和肾脏HE染色的代表图高血压还可导致心室肥大、主动脉增厚、肾脏皮质萎缩等靶器官损伤。进一步比较两组大鼠的器官损伤程度，与溶剂对照组相比，NMN给药组的脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的器官相对重量没有显著变化（图1：I）。同时，两组在主动脉重量与长度比、左心室壁厚度和肾皮质与髓质厚度比方面也没有显著差异（图1：J-L）。
对脑血管进行EVG染色，两组大鼠的弹力纤维均清晰、完整，没有发生显著的病理损伤；对心脏进行Masson染色，也没有发现NMN可以改善血管周围的胶原纤维分布；对主动脉和肾脏进行HE染色，同样没有发现NMN减轻主动脉厚度或改善肾小球萎缩等病变（图1：M）。这些结果表明，在SHR模型中，单次给药NMN对血压或器官保护方面没有治疗作用。
2.2 长期NMN治疗未降低SHR的血压和器官损伤程度
高血压是一种慢性疾病，进一步在SHR模型上长期给予NMN药物饲料喂养4周，等效剂量为200 mg/（kg·d），以评估其对血压和器官损伤的影响。与对照组相比，长期NMN药物饲料治疗组的大鼠体重没有显著变化，但第4周时，NMN给药组大鼠的进食量显著增加（图2：A-B）。NMN药物饲料喂养4周后，对照组和NMN给药组的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率均没有显著差异（图2：C-F）。
比较两组大鼠的器官损伤程度，与NMN单次给药治疗的结果相似，NMN药物饲料治疗4周依然没有显著的靶器官保护作用（图2：G-K）。这些结果表明，在SHR模型中，NMN长期给药也没有降低血压或器官保护作用。
2.3 单次NMN治疗未降低2K2C大鼠的血压和器官损伤程度
2K2C大鼠模型是继发性高血压的实验室模型，通过2K2C手术造模后，大鼠血压明显升高[16]，进一步研究了在2K2C大鼠模型中单次给药200 mg/kg NMN的治疗效果。与SHR模型中观察到的结果一致，与对照组相比，单次给药NMN后2 h或24 h内对血压和心率没有影响（图3：A-H）。2K2C大鼠单次服用NMN后，脑、心脏、肾脏和主动脉等组织的形态学评估和病理染色也没有显示出任何器官保护作用（图3：I-M）。这些结果表明，在2K2C模型中，单次给药NMN对血压或器官保护方面也没有显著影响。
图 3 单次NMN治疗对2K2C大鼠的血压、心率和器官损伤的影响（n=5）A-D. 单次给药后2 h内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率的实时测量值；E-H. 单次给药前和给药后2、24 h区间内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率平均值；I. 脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量；J. 主动脉重量与长度比；K. 左心室壁厚度；L. 肾皮髓质厚度比；M. 脑血管EVG染色、心脏Masson染色、主动脉和肾脏HE染色的代表图2.4 长期NMN未降低2K2C大鼠的血压和器官损伤程度
在2K2C模型中长期给予NMN 200 mg/（kg·d），与对照组相比，长期NMN治疗组的体重没有显著变化，尽管第4周的进食量明显减少（图4：A-B）。连续给予NMN 4周后，测量两组大鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率，没有观察到显著差异（图4：C-F）。形态学评估，包括脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量；主动脉重量与长度比；左心室壁厚度、和肾皮质与髓质厚度比；结合EVG、Masson和HE染色，两组之间没有显著差异（图4：G-K）。这些结果表明，在2K2C模型中，长期给药NMN对血压或器官保护也没有显著影响。
图 4 长期NMN治疗对2K2C大鼠的血压和心率的影响（n=5）A.体重；B. 进食量；C-F. 长期给药4周后的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率；G. 脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量；H. 主动脉重量与长度比；I. 左心室壁厚度；J. 肾皮髓质厚度比；K. 脑血管EVG染色、心脏Masson染色、主动脉和肾脏HE染色的代表图*P<0.05，NMN给药组与对照组比较。2.5 长期NMN治疗未延长2K2C大鼠的存活时间
NMN在多种病理生理过程中起着重要作用[10]。进一步考察终身服用NMN是否可以延长2K2C高血压大鼠的存活时间。治疗期间，各组大鼠的体重或进食量没有显著差异（图5：A-B）。与假手术组相比，2K2C模型大鼠的存活时间显著减少，经氯沙坦治疗后，2K2C大鼠的存活时间显著延长。而NMN治疗的2K2C大鼠生存曲线与模型组没有显著差异（图5C）。以上结果表明，在2K2C模型中，NMN没有延长高血压大鼠存活时间的作用。
图 5 长期NMN治疗对2K2C大鼠存活时间的影响（n=25~27）A. 体重；B. 进食量；C. 生存曲线***P<0.001，与假手术组比较；###P<0.001，与模型组比较；▲▲P<0.01，NMN给药组与氯沙坦给药组比较，C图中均使用Log-rank检验方法。3. 讨论
本研究使用两种成熟的高血压大鼠模型：SHR和2K2C大鼠模型，探讨了NMN对高血压的可能影响。研究结果表明，在上述模型中，单次或长期NMN治疗均未显示出显著的抗高血压和保护器官损伤作用，也没有延长生存时间的作用。
高血压对健康存在重大威胁，会导致严重的并发症，如心脏疾病、中风和慢性肾病等。抗高血压治疗在高血压的管理中至关重要。氯沙坦是一种经典的抗高血压药物，能够特异性拮抗血管紧张素II的AT1型受体，并在2K2C和易卒中自发性高血压大鼠（SHR-SP）模型中被证明存在降低血压，减轻器官损伤，延长存活时间的作用[15, 19]。因此，我们选择氯沙坦作为阳性对照药物，它显著延长了高血压大鼠的存活时间。相比之下，NMN并没有延长高血压大鼠的存活时间。此外，在2K2C大鼠和SHR模型中，无论是单次治疗还是长期治疗，NMN对高血压和器官损伤都没有影响。
在最近的一项研究中，在AngⅡ诱导的高血压小鼠模型中证明了NMN有抗高血压和器官保护作用[14]。有几个因素可能导致我们的发现与该团队的发现之间存在差异，如动物模型、给药方案、NMN给药时间和血压测量方法的变化，特别是所用模型之间的差异，SHR和2K2C大鼠模型更广泛地用于评估抗高血压药物的效果。我们使用了与该团队近似的药物剂量进行单次和长期给药来评估NMN药效，但该团队只研究了长期给药。此外，实验动物的血压测量方法可能是观察到结果差异的重要原因。在本研究中，我们采用更为准确的清醒自由活动大鼠血压测定方法，而该团队采用了非侵入性尾套法。总的来说，我们直接评估了NMN对SHR和2K2C大鼠经典高血压模型中高血压和器官损伤的影响，发现NMN对高血压大鼠的血压和器官损伤没有治疗作用。
同时，氯沙坦的降血压作用已多次被我们证实，例如，在2K2C模型上，长期给药氯沙坦4周，收缩压降低约40 mmHg[15]，并且氯沙坦的降压作用被国内外广泛证明。因此研究NMN治疗对血压的影响实验中，不设氯沙坦阳性药对照组。而前期我们未证明过氯沙坦对大鼠寿命的影响，因此选择氯沙坦作为阳性对照药物，发现它显著延长了高血压大鼠的存活时间。
关于文中NMN剂量的选择，目前，NMN在各种人群中通常用作营养保健品，剂量范围为50~150 mg/d[20]。小鼠常用NMN剂量为300 mg/kg，对应大鼠剂量约为200 mg/kg，对应人（70 kg）剂量为33 mg/kg；临床试验剂量最大一般设为900 mg/d[21]，因此，上述剂量已是较大剂量，若再尝试加大剂量没有实际应用价值，故未设计再高剂量组。
综上，本研究评估了单次和长期NMN治疗对SHR和2K2C大鼠模型中高血压和器官损伤的影响。结果表明，NMN对高血压大鼠的血压、器官损伤和寿命均没有影响，这些发现为NMN的未来临床研究提供了有价值的见解和参考。
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