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特应性皮炎（AD）是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，在全球疾病负担研究（GBD）中以伤残调整寿命年的率衡量时，其造成的疾病负担在非致命性疾病中居于第15位，在所有疾病和损伤中居于59位[1]，同时AD造成的负担还与一个国家的国内生产总值呈正相关[2]。在过去的几十年里，亚洲国家居民的AD患病率持续上升，AD亦成为中国当前严重的公共卫生问题之一。中国居民AD的发病率逐年增加，儿童和老年人在亚洲五国均具有较高的AD发病风险，且中国居民的AD发病风险随时期的推进而加重[3]。
消风止痒颗粒现行质量标准收载于《部颁标准》中药成方制剂第十五册，标准编号：WS3-B-2975-98，处方中包括防风、蝉蜕、地骨皮、苍术（炒）、亚麻子、当归、地黄、木通、荆芥、石膏和甘草十一味药材[4]。消风止痒颗粒不仅对接触性荨麻疹作用明显，有缓解皮肤红肿，抑制风团之效[5]，还能改善尿毒症患者皮肤瘙痒症状[6]。本研究旨在通过消风止痒颗粒对AD引起的急性瘙痒的缓解作用，探究其可能的作用机制，为中药在止痒方面的研究提供一定的基础和参考依据。
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健康C57BL/6小鼠60只，雄性，体重18~20 g，SPF级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006。饲养条件：室温20～25 ℃，湿度40 %～70 %，标准饲料，动物自由饮食和饮水。
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消风止痒颗粒由烟台东诚大洋制药有限公司提供，批号：Z20113054，规格：每袋3 g，临用前用纯净水配制成所需浓度。卡泊三醇（aladdin，批号：C126438）；卵清蛋白（OVA，SAITONC，批号：A80003）；无水乙醇（aladdin，批号：E111991）；小鼠白三烯C4（LTC4）Elisa试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司，批号：JM-02678M1）；红细胞裂解液（BD，Cat：555899）；FITC 抗小鼠 FcεRIα 抗体（BioLegend，Cat：134305）；PE 抗小鼠 IgE 抗体（BioLegend，Cat：406907）；PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠 CD49b 抗体（Bio Legend，Cat：103519）；APC 抗小鼠 CD200R （OX2R）抗体（BioLegend，Cat：123915）。
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JA2003A型电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；A51119500C型全自动酶标仪（美国Thermo科技公司）；5420型高速离心机（美国Eppendorf公司）；CytoFLEX型流式细胞仪（美国贝克曼公司）。
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参照Wang等的小鼠AD急性瘙痒模型制备方法[7]。8周龄的C57小鼠，每天先用卡泊三醇（0.5 nmol，溶在15 μl的100 %乙醇中）涂抹右侧耳皮肤（右耳内外侧各7.5 μl），然后用卵清蛋白（OVA，5 mg/ml，溶在20 μl磷酸盐缓冲盐水PBS中）进行涂抹（右耳内外侧各10 μl），连续处理10 d（从第0天到第9天）以使小鼠敏感。对照组小鼠先用15 μl乙醇处理，然后用20 μl PBS处理。在第10天，在小鼠右颊皮内注射OVA（2.5 mg/ml，溶在生理盐水中）20 μl进行激发。
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60只雄性C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、模型组、消风止痒颗粒低（7.2 g/kg）和高剂量组（14.4 g/kg）、阳性对照组（孟鲁司特，5 mg/kg）5组，每组12只，适应性饲养1周后开始进行造模。消风止痒颗组低剂量是按体表面积换算方法由人临床使用剂量（15岁以上患者1日分2~3次口服36 g，按60 kg体重计算，即0.6 g/(kg·d)）换算成小鼠剂量（7.2 g/kg），高剂量设为低剂量的2倍，即14.4 g/kg。各组小鼠给药途径均为灌胃给药，各组药物均在给药前现配。消风止痒颗粒低剂量组药物加饮用水后配成1 g/ml浓度, 消风止痒颗粒高剂量组药物加饮用水后配成2 g/ml浓度；阳性对照组孟鲁司特加饮用水后配成0.695 mg/ml浓度，空白对照组用饮用水灌胃，各组小鼠均按7.2 ml/kg体积灌胃给药。各组于激发前12 h及激发前30 min各灌胃给药一次。
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瘙痒行为在第10天上午8点至11点之间进行。测试前2 d将右侧脸颊备皮，测试前1 d（即第9天）将动物在测试室中适应60 min。测试当天给药30 min后在小鼠右颊皮内注射OVA（2.5 mg/ml，溶在0.9 %生理盐水中）20 μl进行激发，录像60 min，记数30~60 min小鼠抓挠次数。抓挠的定义是前脚或后脚直接对背部、脸颊或耳朵进行连续抓挠的情况，当这种情况在鼠将前爪或后爪离开或放在嘴巴为计数1次。
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在小鼠瘙痒行为学实验结束后，每组随机取6只小鼠进行眼眶取血，在离心管中4 ℃静置2 h后，3 000 r/min离心10 min，取上清液到新的离心管中备用。血清样本按Elisa试剂盒操作说明书进行实验。
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外周血淋巴细胞样本制备：每组各取3只小鼠，腹主动脉取血于抗凝管中（500 μl左右），每个样品加入1 ml红细胞裂解液，室温孵育15 min，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，再次加入1 ml红细胞裂解液，室温孵育15 min，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液后加入1 ml PBS重悬离心，得到外周血淋巴细胞。抗体孵育：各样品管外周血淋巴细胞用300 μl的PBS重悬，每管加入1 μl抗体，4 ℃孵育30 min，流式细胞仪进样检测。
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实验数据以均值±标准差（
$ \bar{x} $ ±s）表示，采用GraphPad Prism软件进行统计处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行差异的显著性检验。P<0.05为差异具有统计学意义。 -
空白对照组小鼠无明显的急性抓挠行为，模型组小鼠激发后出现明显的抓挠行为，模型组抓挠次数均值为56次，与模型组相比，各给药组均不同程度显著减少小鼠抓挠次数（P<0.05），阳性对照组为34次、消风止痒颗粒低剂量组为42次、消风止痒颗粒高剂量组为23次，结果见图1。消风止痒颗粒能明显减少小鼠抓挠次数，改善小鼠AD急性瘙痒症状。
图 1 小鼠激发后30~60 min内的抓挠次数（n=10，
$ \bar{x} $ ±s） -
与空白对照组相比，模型组小鼠血清中白三烯含量明显升高（P<0.001）；各给药组相较于模型组小鼠血清中白三烯含量均显著下降（P<0.05），结果见图2。结果表明，消风止痒颗粒能显著降低AD小鼠血清中白三烯水平，降低炎症水平。
图 2 激发后小鼠血清中白三烯水平（n=6，
$ \bar{x} $ ±s） -
模型组小鼠血液中CD49b+细胞和FceRla+细胞以及CD200R+细胞的比例显著高于空白对照组（P<0.05），消风止痒颗粒高剂量组与模型组相比较，能明显降低CD49b+细胞和FceRla+细胞以及CD200R+细胞的比例（P<0.05），结果如图3～图5所示。CD49b和FceRla以及CD200R为嗜碱性粒细胞表面抗原[7]，两者升高表明小鼠血液中嗜碱性粒细胞比例升高，而消风止痒颗粒能降低由特异性皮炎引起增多的嗜碱性粒细胞，减少炎症反应，进而减轻瘙痒症状。
图 3 CD49b+细胞的流式细胞结果（n=3，
$ \bar{x} $ ±s）
图 4 FceRla+细胞的流式细胞结果（n=3，
$ \bar{x} $ ±s）
图 5 CD200R+细胞的流式细胞结果（n=3，
$ \bar{x} $ ±s） -
AD是一种以皮肤持续瘙痒为特征的复发性、慢性、非感染性炎症性皮肤病。其发病机制是多种因素共同作用的结果，涉及表皮屏障功能受损、免疫异常、宿主遗传因素和环境因素的相互作用。表皮的最外层，角质层和颗粒层的紧密连接形成蛋白质和脂质屏障，防止皮肤种水分的流失、微生物病原体的入侵，以及过敏原、毒素和刺激物引起的炎症反应。AD发生后，皮肤屏障受损，表皮分化蛋白（特别是聚丝蛋白）和紧密连接蛋白表达减少，脂质，特别是长链脂肪酸和神经酰胺缺乏。由于抗菌肽（AMP）对环境病原体（包括金黄色葡萄球菌）的反应不足，使皮肤对微生物的屏障作用也被削弱[8]。国内外报道中，皮肤源性瘙痒动物模型是药物止痒研究实验最常使用的类型，由于不同药物作用机制、疾病生理病理特征不同，使用的模型也不尽相同。近年来，越来越多的新品系、新技术、新途径应用于皮肤源性急慢性瘙痒动物模型的建立，为机制研究提供基础，同时也出现了更加经济、造模周期短和更符合疾病生理病理特征等优势动物模型，如同时使用4-氨基吡啶（4-AP）和组胺能更好地诱发动物瘙痒行为，AD的卡泊三醇模型操作更简便，瘙痒更明显，并且具备更多 AD 临床特征[9]。本研究造模时参考Wang等的方法[7]，在小鼠皮内注射OVA激发后的30~60 min内，小鼠出现明显的抓挠行为，说明该方法能很好的诱发小鼠瘙痒行为。通过对各组小鼠30 min内抓挠次数的统计，发现消风止痒颗粒给药后能显著减少小鼠急性瘙痒后的抓挠次数，说明口服消风止痒颗粒能减轻AD后急性瘙痒的症状。
尽管嗜碱性粒细胞是哺乳动物体内最不常见的粒细胞群体，但在许多人类疾病中，如过敏性疾病、器官排斥反应、自身免疫疾病及癌症，都有发现其积累。例如，嗜碱性粒细胞被认为与过敏性接触性皮炎、AD、药物过敏反应、超敏反应、哮喘、大疱性类天疱疮、狼疮肾炎、克罗恩病、皮肤和肾脏同种异体移植反应以及急性和慢性骨髓性白血病的发病机制有关[10]。还有许多研究表明，在急性AD、慢性IgE介导的皮炎、气道炎症和嗜酸性粒细胞性食管炎疾病中，嗜碱性粒细胞在诱导TH2细胞因子介导的炎症中发挥重要作用[11-13]。本研究通过流式细胞术检测了小鼠血清中CD49b+和FceRla+细胞的比例，发现口服消风止痒颗粒能明显减少由AD诱导增加的嗜碱性粒细胞，说明消风止痒颗粒是通过降低小鼠血清中嗜碱性粒细胞数量来达成缓解瘙痒的效果。此外，有研究报道，AD患者的病变皮肤或尿液中检测到多种前列腺素和白三烯，如PGE2、LTB4和CysLTE4[14, 15]，提示前列腺素和白三烯可能参与AD 症状的发展。在OVA诱导的小鼠AD模型中，抓挠行为诱导中性粒细胞向皮肤浸润，浸润的中性粒细胞产生的LTB4作用于中性粒细胞和Th 2细胞上表达的BLT1，促进其向皮肤浸润[16]。有文献报道了作为白三烯拮抗剂的孟鲁司特可治疗AD，本实验选用了孟鲁司特作为特异性阳性对照药[17]。在分离小鼠血清后，检测了血清中白三烯含量，结果发现，消风止痒颗粒能明显降低AD小鼠血清中白三烯水平，说明消风止痒颗粒口服后改善AD小鼠瘙痒症状的机制可能与降低血清中白三烯水平有关。
综上所述，本研究证实了消风止痒颗粒能够改善AD小鼠的急性瘙痒症状，其机制可能与减少小鼠血液中嗜碱性粒细胞数量及血清中白三烯水平相关。本研究为将来进一步进行消风止痒颗粒在AD急性瘙痒方面的研究提供了深入的实验与理论依据。
Therapeutic effect of Xiaofeng Zhiyang granules on acute itching in mice with atopic dermatitis by decreasing leukotriene
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摘要:
目的 建立小鼠特应性皮炎急性瘙痒模型，研究消风止痒颗粒的止痒作用及其机制探讨。 方法 采用诱导法制备特应性皮炎小鼠模型。小鼠每天先后用卡泊三醇和卵清蛋白（OVA）涂抹右耳致敏10 d，然后在小鼠右颊皮内注射OVA进行激发，致使小鼠出现急性瘙痒，记录小鼠激发后30~60 min的抓挠次数。实验分为5组：空白对照组、模型组、消风止痒颗粒低剂量组（7.2 g/kg）和高剂量组（14.4 g/kg）、阳性对照组（孟鲁司特5 mg/kg）。各组于激发前12 h及30 min各灌胃给药一次。通过Elisa检测小鼠血清中白三烯水平，通过流式细胞术检测血液中嗜碱性粒细胞比例及激活状态。 结果 小鼠经致敏和激发后出现明显的抓挠行为，模型组小鼠激发后30~60 min内抓挠次数均值为56次，消风止痒颗粒低和高剂量组小鼠抓挠次数均值分别为42次和23次，较模型组均显著降低（P<0.05）。消风止痒颗粒低、高剂量组血清中白三烯水平和嗜碱性粒细胞比例与模型组比较，均明显降低（P<0.05）。 结论 消风止痒颗粒对小鼠特应性皮炎急性瘙痒具有一定治疗作用，作用机制与其降低特应性皮炎小鼠血清中白三烯水平和降低嗜碱性粒细胞比例有关。 Abstract:Objective To establish a mice model of atopic dermatitis with acute itching and investigate the antipruritic effect and its mechanism of Xiaofeng Zhiyang granules（XFZYG）. Methods A mice model of atopic dermatitis was prepared by induction method. Mice were sensitized by calcipotriol and ovalbumin (OVA) applying to the right ear daily for 10 days, and then stimulated by OVA injected intradermally into the right cheek to resulting in acute itching. These mice were divided into 5 groups: blank control group, model group, low dose (7.2 g/kg) and high dose (14.4 g/kg) of XFZYG, and positive control group (montelukast 5 mg/kg). Drugs were administered by gavage at 12 h and 30 min before stimulation. The leukotriene levels in the serum of the mice were measured by Elisa and the basophil ratio and activation status in the blood were measured by flow cytometry. Results The mean number of scratches in the model group was 56 between 30 min and 60 min after stimulation, while the mean number of scratches in the low and high dose of XFZYG groups were 42 and 23 respectively, which were significantly lower than those in the model group （P<0.05）. The serum leukotriene levels and the proportion of basophils in the low and high dose of XFZYG groups were significantly lower than those in the model group (P<0.05). Conclusion XFZYG had certain therapeutic effect on acute itching of atopic dermatitis in mice, and the mechanism of its action was related to the reduction of leukotriene level and basophil ratio in serum of mice with atopic dermatitis . -
Key words:
- Xiaofeng Zhiyang granule /
- atopic dermatitis /
- pruritus /
- basophil /
- leukotriene
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肾指海绵属（Reniochalina）海绵为寻常海绵纲（Demospongiae）软海绵目（Halichondrida）小轴海绵科（Axinellidae）的海洋多细胞动物。目前，针对该属海绵进行的化学成分研究主要包括甾类[1]、低极性化合物（如脂肪酸类、邻苯二甲酸类、烃类）[2]、炔醇[3]和环肽[4]等类型。其中，环肽reniochalistatins A-E由我们课题组获得，而环八肽reniochalistatin E因对人骨髓瘤细胞RPMI-8226的IC50值为4.90 μmol/L，已有两个团队采用不同策略对其完成全合成[5-6]。
为进一步高效挖掘肾指海绵中的潜在新型活性环肽，课题组基于环肽类化合物质谱响应度好，灵敏度高，二级质谱中存在明显的氨基酸单元碎裂的b和y特征离子，以质谱为导向，继续追踪分离该属海绵中的环肽类成分。最终，分离鉴定了3个环七肽（图1），并对它们进行了初步细胞毒活性评价。
1. 材料和方法
1.1 仪器与试剂
600、700 MHz核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；Xevo G2-XS QTOF质谱仪（美国Waters公司）；质谱引导的自动纯化系统（美国Waters公司）；Acquity UPLC高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Interchim PuriFlash 450中压色谱仪（法国Interchim公司）；SK5200H型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；BT224S电子天平（德国Sartorius公司）；EYELAN-1000型旋转蒸发仪（日本东京理化公司）；低温高速离心机（美国Thermo Fisher公司）；XBridge C18半制备型液相色谱柱（10 mm × 250 mm, 5 μm，美国Waters公司）；ODS柱色谱填料（日本YMC公司）；Sephadex-LH20柱色谱填料（瑞典Pharmacia公司）；色谱级试剂（德国Merck公司）；分析纯试剂（上海化学试剂公司）；氘代试剂（美国Cambridge Isotope公司）。
1.2 海绵样本
海绵样本由课题组颜益珍老师于2021年4月采集自中国南海永乐群岛附近海域（25~30 m深度）。样本呈橙黄色，质地较硬。经课题组杨琪博士鉴定为Reniochalina属海绵。凭证标本（编号：212604）现保存于上海交通大学医学院附属仁济医院海洋药物实验室。
1.3 分步萃取
将干重78.5 g的海绵剪碎成块，先后加入等体积甲醇、二氯甲烷-甲醇（V/V = 1∶1）分别超声提取3~5次，每次30 min，合并提取液经减压浓缩得粗提物23.7 g。先将粗提物混悬于90%的甲醇水中，用等体积石油醚萃取3~5次，再将90%的甲醇水层加水稀释至60%，用等体积二氯甲烷萃取3~5次，合并萃取液经减压浓缩得二氯甲烷层浸膏1.2 g，其经LC-MS分析确认富含潜在的大分子量环肽。而60%的甲醇水层稀释至30%后再用乙酸乙酯萃取，经LC-MS检测已无大分子量环肽。故通过质谱导向的分步萃取，潜在的大分子量环肽主要分布于二氯甲烷层。
1.4 追踪分离
基于环肽类化合物分子量大的特点，通过两次Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，并采用质谱定位追踪的方式将潜在环肽富集。第一次以二氯甲烷-甲醇（V/V = 1∶1）为洗脱剂，二氯甲烷层浸膏经凝胶柱色谱分离得到组分Fr.A ~ Fr.C。第二次以正己烷-二氯甲烷-甲醇（V/V/V = 4∶5∶1）为洗脱剂，富含潜在大分子量环肽的Fr.B经凝胶柱色谱分离得到亚组分Fr.B1 ~ Fr.B5。其中，Fr.B2 ~ Fr.B4先后经中压ODS柱色谱分离（紫外监测波长设为210 nm，以甲醇-水为流动相，以流速15 ml/min在10 h内梯度洗脱10% ~ 100%），通过质谱定位追踪分别获得一系列精细组分。
上述精细组分经质谱引导的自动纯化系统制备获得环肽单体。质谱条件：质量扫描范围m/z 100~1250，锥孔电压 15 V，ES+模式下扫描采集数据。色谱条件：以半制备型C18柱为固定相，以乙腈-水（含0.1% 甲酸）为流动相，以流速6 ml/min进行梯度洗脱。其中，Fr.B2-27在32 min内线性梯度洗脱40%~48%获得化合物1（2.7 mg, tR=21 min）；Fr.B4-5在52 min内线性梯度洗脱20%~23%获得化合物2（3.3 mg, tR=36 min）；Fr.B2-11在32 min内线性梯度洗脱30%~40%获得化合物3（3.4 mg, tR=18 min）。
2. 结构鉴定
化合物1：无色结晶固体，茚三酮显色阴性。HRESIMS给出准分子离子峰m/z 768.4661 [M+H]+ (calcd 768.4660)，确定其分子量为767。结合1H和13C-NMR谱确定其分子式为C40H61N7O8，计算不饱和度为14。1D NMR谱图给出典型的肽类化合物特征信号。其中，1H NMR谱显示有5个低场区的酰胺氨基质子信号(δH 9.45, 8.90, 8.71, 7.23, 7.16)，7个α-次甲基质子信号(δH 4.69, 4.32, 4.16, 4.12, 4.03, 3.89, 3.51)。13C NMR谱提示有7个酰胺羰基碳信号(δC 171.6, 171.1, 170.9, 170.8, 170.6, 169.6, 168.5)，7个α-次甲基碳信号(δC 60.7, 60.6, 59.2, 55.4, 55.1, 55.0, 54.1)。由此推断该化合物可能为七肽。结合2D NMR谱图，确定该七肽由两个脯氨酸残基、一个亮氨酸残基、两个异亮氨酸残基、一个苯丙氨酸残基和一个丝氨酸残基组成。残基连接顺序由HMBC、ROESY相关信号和ESI-MS/MS质谱数据确定，绝对构型由高级Marfey法确定[7-8]。综上，该化合物结构为cyclo-(L-Pro-L-Ser-L-Phe-L-Ile-L-Leu-L-Pro-L-Ile)。将核磁共振数据归属如下：1H NMR (700 MHz, DMSO-d6) δH 9.45 (1H, d, J = 8.4 Hz, 36-NH), 8.90 (1H, br s, 7-NH), 8.71 (1H, d, J = 6.6 Hz, 25-NH), 7.23 (1H, d, J = 10.3 Hz, 19-NH), 7.16 (1H, d, J = 4.8 Hz, 10-NH), 7.31 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-13, H-17), 7.25 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-14, H-16), 7.20 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-15), 4.69 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-2), 4.39 (1H, m, H-34a), 4.32 (1H, dd, J = 11.0, 8.4 Hz, H-36), 4.16 (1H, m, H-10), 4.12 (1H, t, J = 10.5 Hz, H-19), 4.03 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-31), 3.89 (1H, t, J = 7.1 Hz, H-7), 3.57 (1H, m, H-34b), 3.51 (1H, m, H-25), 3.50 (1H, m, H-5a), 3.49 (1H, m, H-8a), 3.47 (1H, m, H-8b), 3.36 (1H, m, H-5b), 3.13 (1H, dd, J = 13.1, 2.8 Hz, H-11a), 2.84 (1H, dd, J = 13.0, 9.5 Hz, H-11b), 2.38 (1H, m, H-3a), 2.18 (1H, td, J = 12.7, 4.3 Hz, H-26a), 2.08 (1H, m, H-32a), 2.05 (1H, m, H-37), 2.01 (1H, m, H-33a), 1.92 (1H, m, H-3b), 1.90 (1H, m, H-4a), 1.79 (1H, m, H-33b), 1.73 (1H, m, H-32b), 1.55 (1H, m, H-26b), 1.53 (1H, m, H-39a), 1.52 (1H, m, H-4b), 1.43 (1H, m, H-20), 1.42 (2H, m, H-22a, H-27), 1.15 (1H, m, H-39b), 1.09 (1H, m, H-22b), 0.87 (3H, m, H-21), 0.85 (3H, m, H-29), 0.83 (6H, m, H-23, H-38), 0.82 (3H, m, H-28), 0.75 (3H, t, J = 7.3 Hz, H-40)；13C NMR (175 MHz, DMSO-d6) δC 171.6 (C-30), 171.1 (C-35), 170.9 (C-9), 170.8 (C-1), 170.6 (C-24), 169.6 (C-18), 168.5 (C-6), 136.9 (C-12), 129.9 (C-13, C-17), 127.9 (C-14, C-16), 126.4 (C-15), 60.7 (C-31), 60.6 (C-2, C-8), 59.2 (C-19), 55.4 (C-7), 55.1 (C-10), 55.0 (C-36), 54.1 (C-25), 48.2 (C-34), 46.3 (C-5), 37.0 (C-11, C-26), 36.7 (C-20), 34.8 (C-37), 30.8 (C-3), 29.4 (C-32), 24.7 (C-27, C-33), 24.2 (C-22), 23.9 (C-39), 23.2 (C-29), 22.2 (C-4), 20.8 (C-28), 14.9 (C-40), 14.5 (C-23), 10.1 (C-38), 9.5 (C-21)。以上数据与文献[9]基本一致，故将化合物1鉴定为stylopeptide 1。
化合物2：无色无定形粉末，茚三酮显色阴性。HRESIMS给出准分子离子峰m/z 770.4102 [M+H]+ (calcd 770.4089)，确定其分子量为769。结合1H和13C-NMR谱确定其分子式为C38H55N7O10，计算不饱和度为15。1D NMR谱图给出典型的肽类化合物特征信号。其中，1H NMR谱显示有5个低场区的酰胺氨基质子信号(δH 8.77, 8.43, 8.33, 8.03, 7.55)，7个α-次甲基质子信号(δH 4.53, 4.38, 4.34, 4.28, 4.05, 4.03, 3.99)。13C NMR谱提示有7个酰胺羰基碳信号(δC 172.6, 172.4, 170.6, 170.5, 170.3, 170.0, 169.9)，7个α-次甲基碳信号(δC 62.5, 60.4, 57.5, 56.9, 51.6, 49.9, 47.4)。据此推断该化合物可能为七肽。结合2D NMR谱图，确定该七肽由两个脯氨酸残基、一个亮氨酸残基、一个酪氨酸残基、一个天冬氨酸残基、一个丙氨酸残基和一个异亮氨酸残基组成。残基连接顺序由HMBC、ROESY相关信号和ESI-MS/MS质谱数据确定，绝对构型由高级Marfey法确定。综上，该化合物结构为cyclo-(L-Pro-L-Asp-L-Tyr-L-Pro-L-Ile-L-Ala-L-Leu)。将核磁共振数据归属如下：1H NMR (700 MHz, DMSO-d6) δH 8.77 (1H, br s, 31-NH), 8.43 (1H, d, J = 7.5 Hz, 11-NH), 8.33 (1H, br s, 25-NH), 8.03 (1H, s, 7-NH), 7.55 (1H, d, J = 6.5 Hz, 34-NH), 6.97 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-14, H-18), 6.66 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-15, H-17), 4.53 (1H, m, H-7), 4.38 (1H, m, H-31), 4.34 (1H, m, H-20), 4.28 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-34), 4.05 (1H, m, H-11), 4.03 (1H, m, H-2), 3.99 (1H, m, H-25), 3.63 (1H, m, H-5a), 3.56 (1H, m, H-5b), 3.26 (2H, m, H-8a, H-23a), 2.99 (1H, m, H-12a), 2.88 (1H, m, H-12b), 2.83 (1H, m, H-8b), 2.59 (1H, m, H-23b), 2.22 (1H, m, H-3a), 2.10 (1H, m, H-21a), 1.87 (1H, m, H-4a), 1.77 (1H, m, H-4b), 1.68 (1H, m, H-35a), 1.67 (2H, m, H-21b, H-26), 1.58 (1H, m, H-35b), 1.57 (1H, m, H-3b), 1.55 (1H, m, H-36), 1.54 (1H, m, H-22a), 1.53 (1H, m, H-28a), 1.24 (1H, m, H-22b), 1.16 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-32), 1.10 (1H, m, H-28b), 0.86 (3H, d, J = 5.8 Hz, H-37), 0.82 (3H, m, H-38), 0.80 (6H, m, H-27, H-29); 13C NMR (175 MHz, DMSO-d6) δC 172.6 (C-1), 172.4 (C-24), 172.1 (C-9), 170.6 (C-19), 170.5 (C-10), 170.3 (C-6), 170.0 (C-33), 169.9 (C-30), 155.9 (C-16), 129.6 (C-14, C-18), 127.8 (C-13), 115.1 (C-15, C-17), 62.5 (C-2), 60.4 (C-20), 57.5 (C-31), 56.9 (C-34), 51.6 (C-7), 49.9 (C-11), 47.4 (C-25), 47.0 (C-5), 45.7 (C-23), 40.4 (C-35), 36.1 (C-8), 35.4 (C-12, C-26), 30.4 (C-3), 29.5 (C-21), 25.1 (C-4), 24.7 (C-36), 24.3 (C-28), 22.9 (C-37), 21.4 (C-38), 20.9 (C-22), 15.1 (C-32), 14.9 (C-29), 10.9 (C-27)。以上数据与文献[10]基本一致，故将化合物2鉴定为hymenamide D。
化合物3：无色无定形粉末，茚三酮显色阴性。HRESIMS给出准分子离子峰：m/z 767.4468 [M+H]+ (calcd 767.4456)，确定其分子量为766。结合1H和13C-NMR谱确定其分子式为C39H58N8O8，计算不饱和度为15。1D NMR谱图给出典型的肽类化合物特征信号。其中，1H NMR谱显示有5个低场区的酰胺氨基质子信号(δH 8.80, 8.13, 7.98, 7.95, 7.25)，7个α-次甲基质子信号(δH 4.65, 4.28, 4.24, 4.19, 4.14, 3.89, 3.83)。13C NMR谱提示有7个酰胺羰基碳信号(δC 171.4, 171.1, 170.9, 170.3, 170.2, 170.1, 169.6)，7个α-次甲基碳信号(δC 62.3, 61.5, 60.2, 57.1, 55.2, 51.0, 49.3)。据此推断该化合物可能为七肽。结合ESI-MS/MS质谱数据确定其氨基酸残基组成为两个脯氨酸残基、一个亮氨酸残基、一个苯丙氨酸残基、一个天冬酰胺残基和两个缬氨酸残基，残基连接顺序为cyclo-(Pro-Asn-Val-Pro-Leu-Val-Phe)。通过高级Marfey法确定所有氨基酸残基均为L构型。将核磁共振数据归属如下：1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δH 8.80 (1H, d, J = 5.4 Hz, 21-NH), 8.13 (1H, d, J = 9.5 Hz, 32-NH), 8.01 (1H, s, 9-NH2), 7.98 (1H, d, J = 8.5 Hz, 11-NH), 7.95 (1H, d, J = 6.1 Hz, 7-NH), 7.28 (1H, m, 9-NH2), 7.25 (3H, m, 27-NH, H-35, H-39), 7.18 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-37), 7.14 (2H, d, J = 7.6 Hz, H-36, H-38 ), 4.65 (1H, m, H-7), 4.28 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-32), 4.24 (1H, m, H-16), 4.19 (1H, m, H-21), 4.14 (1H, t, J = 8.6 Hz, H-27), 3.89 (1H, t, J = 8.6 Hz, H-2), 3.83 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-11), 3.75 (1H, m, H-5a), 3.46 (2H, m, H-5b, H19a), 3.26 (1H, m, H19b), 3.06 (1H, m, H-8a), 2.94 (3H, m, H-8b, H33a, H33b), 2.34 (1H, m, H-17a), 2.19 (2H, m, H-3a, H12), 2.02 (1H, m, H-28), 1.96 (1H, m, H-18a), 1.85 (1H, m, H-4a), 1.71 (2H, m, H-18b, H-23), 1.61 (1H, m, H-22a), 1.46 (1H, m, H-4b), 1.23 (1H, m, H-17b), 1.19 (1H, m, H-22b), 0.99 (1H, m, H-3b), 0.92 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-13), 0.89 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-14), 0.86 (6H, d, J = 6.7 Hz, H-29, H-30), 0.84 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-25), 0.79 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-24); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δC 172.5 (C-9), 171.4 (C-26), 171.1 (C-20), 170.9 (C-31), 170.3 (C-1), 170.2 (C-15), 170.1 (C-10), 169.6 (C-6), 138.4 (C-34), 128.9 (C-35, C-39), 128.1 (C-36, C-38), 126.2 (C-37), 62.3 (C-2), 61.5 (C-11), 60.2 (C-16), 57.1 (C-27), 55.2 (C-32), 51.0 (C-21), 49.3 (C-7), 47.6 (C-5), 45.8 (C-19), 37.9 (C-22), 37.0 (C-33), 35.5 (C-8), 30.5 (C-17), 30.1 (C-28), 29.5 (C-12), 29.2 (C-3), 25.1 (C-4), 24.2 (C-23), 23.3 (C-24), 21.3 (C-18), 20.6 (C-25), 19.7 (C-13), 18.7 (C-14, C-29), 18.3 (C-30)。以上数据与文献[11]基本一致，故将化合物3鉴定为axinastatin 2。
3. 活性测试
采用CCK-8法初步评估化合物对6种人肿瘤细胞株（A2780、HCT-8、HepG2、NCI-H460、SW480、PC-9）的体外细胞毒活性。主要步骤为：取对数生长期的细胞制成细胞悬液，约4×103个细胞/孔接种至96孔板内，每组设3个复孔。过夜培养后，各株细胞分别加入20 μmol/L化合物，并设对照组（顺铂）和空白组（DMSO），继续孵育48 h。随后，避光情况下每孔加入10 µl CCK-8溶液。孵育0.5 ~ 2 h后，450 nm处测其吸光度，每株细胞测3次以上，并计算其细胞活力（%）。对于肿瘤细胞生长抑制率大于50%的化合物，进一步测试其活性剂量依赖关系。结果显示，化合物1对NCI-H460、HepG2、PC-9、HCT-8、A2780和SW480均具细胞毒性，IC50值分别为6.09、9.31、13.24、14.31、14.38和17.26 μmol/L。
4. 讨论
环肽具有许多独特的生化和治疗特性，目前已有抗生素类达托霉素、止痛剂齐考诺肽、抗肿瘤药帕瑞肽等环肽类药物获批用于临床[12]。海绵是环肽类化合物的重要多产来源，然而，其体内环肽因含量低微、紫外吸收不佳、核磁灵敏度差等，特异识别和定向获取极富挑战。将质谱高灵敏度、高准确度和高选择性的技术优势与环肽独特的质谱碎裂模式有机结合，有助于提高环肽发现的通量和选择性。
本研究以质谱为导向，追踪分离肾指海绵中的潜在新颖活性环肽，分离鉴定出3个环七肽，它们均为首次从该属海绵分离获得。此外，本研究还发现化合物1对多种人肿瘤细胞株具有中等抑制活性。而有趣的是，早期由George R. Pettit课题组分离获得的源于Stylotella属和Phakellia属海绵的同一化合物1，其抑制P388小鼠白血病细胞生长的能力却相差十倍以上[9, 13]。这可能与天然来源环肽能与某些仅生物方法才能检测到的微量强活性抗肿瘤物结合[9, 13]，或不同溶剂环境致使环肽分子构象发生改变有关[14]。化合物2先后发现于Hymeniacidon属[10]和Stylissa属[15-16]海绵，对多种肿瘤细胞株开展的活性试验显示其无明显细胞毒性。化合物3此前发现于Axinella属海绵，其对小鼠P388细胞和一系列人肿瘤细胞具有较强的体外细胞毒性[11]。
不同种属的海绵能够产生相同类型的环肽分子，同一类型的环肽分子表现出不同的细胞毒活性，可能和与海绵共生互作的微生物相关。本研究进一步丰富了肾指海绵中环肽类化合物的多样性，也为研究特征结构类型的海洋天然产物提供了新思路、新方法。
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