下载:
下载:
-
肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是以肝内细胞外基质（extracellular matrix protein，ECM）过度沉积和纤维瘢痕形成为特征的慢性肝病，在世界范围内具有较高的发病率和病死率，持续发展导致肝硬化、肝癌的发生[1]。肝纤维化发病机制复杂，病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、胆汁淤积性肝病等均可能导致慢性肝炎症，并最终导致肝纤维化[2]。然而，除肝移植外，目前尚无有效治疗肝纤维化的方法，针对肝纤维化早期识别和治疗对于预防相关负面后果至关重要。鉴于肝脏是人体最大的器官和主要代谢枢纽，探讨肝纤维化的代谢特征有望发现新的标志物和治疗靶点。
二氢丹参酮Ⅰ（dihydrotanshinone I，DHI）是中药丹参中的亲脂性成分，被认为是一种潜在的治疗肝纤维化的药物，其肝脏保护作用、抗癌作用、抗流感活性、抗炎作用等生物学功能已多次报道[3-5]。在本课题组前期扶正化瘀方抗肝纤维化机制研究中发现DHI是扶正化瘀胶囊的重要药效物质基础，也在细胞活性实验中证明其能显著抑制细胞活性发挥抗肝纤维化作用[6]。然而，DHI对肝纤维化治疗作用的体内药效及机制尚不明确。本研究利用肝脏代谢组学方法研究肝纤维化密切相关的生物标志物，探索肝纤维化相关病理过程，同时采用DHI进行干预，研究其对肝纤维化的治疗作用及作用机制，为肝纤维化早期诊断、有效治疗提供科学依据。
-
METTLER AE240 型电子天平（瑞士梅特勒公司）；FRESCO17台式冷冻离心机 (Thermo Fisher，美国)；DZG-6020真空干燥箱 (上海益恒实验仪器公司)；Agilent 1290 Infinity 液相色谱仪、Agilent 6538 Q-TOF/MS 质谱仪、Micro17高速离心机（Thermo Fisher Scientific，美国）；HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，2.5μm）(Waters，美国)。
-
DHI（纯度 98%，上海一飞生物科技有限公司）；硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA，东京化成工业株式会社)；甲醇、乙腈（均为色谱纯，德国Merck公司），甲酸（色谱纯，ROE scientific INC，美国）；水为实验室制备的超纯水，其他试剂均为分析纯。
-
SD大鼠，雄性，质量(200～250 g)，共28只，购自中国科学院上海实验动物中心，合格证号：SCXK(沪)2012-0002。饲养于海军军医大学实验动物中心，遵循动物实验的标准操作规范。饲养条件：温度（22±2）℃，相对湿度40%～60%，12 h昼夜交替循环的条件下笼养。
-
将28只雄性SD大鼠随机分为4组：正常组、肝纤维化模型组、DHI低剂量组和DHI高剂量组，每组7只。24 h适应性饲养后，除正常组外，模型组及不同用药剂量干预组每周3次腹腔注射200 mg/kg TAA，持续给TAA造模8周；同时，自第5周起，按照给药剂量持续给药4周：正常组、模型组，每日给予生理盐水10 ml/kg；DHI低剂量组，每日给予DHI15 mg/kg；DHI高剂量组，每日给予30 mg/kg。
-
最后一次给药24 h后，采用脊椎脱臼法处死大鼠。快速切除肝脏后，用0 ℃生理盐水冲洗并立即放于液氮中快速冷冻，储存于−80 ℃冰箱直至分析。
-
将冻存的肝脏组织置于室温自然解冻，取约100 mg肝脏样本于匀浆管中，加入800μl甲醇，在60 Hz下充分匀浆至没有纤维颗粒，4 ℃离心15 min（14 500×g）后取上清液置于1.5 ml的离心管中，氮气吹干。在上述氮气吹干的样品残渣中加入300 μl含内标甲醇涡旋30 s（内标为L-2-氯苯丙氨酸，浓度为5 μg/ml），每个样品取10μl混匀作为质量控制样品。
-
色谱条件：Agilent 1290 Infinity UHPLC，色谱柱：Waters XSelect HSS T3 column色谱柱，柱温：30 ℃；进样量：3 μl；流动相A：含0.1 %甲酸的水，流动相B：含0.1 %甲酸的乙腈。流速：0.4 ml/min；梯度洗脱条件：0～2 min，2 %B，2～17 min，2 %～98 % B，17～19 min，98 %B。质谱条件：Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF/MS，离子源：电喷雾（ESI）离子源，正、负离子检测模式；干燥气温度：350 ℃，干燥气体流量：11 L/min；碎裂电压：120 V；毛细管电压：4 000 V（ESI+）/3 500 V（ESI-）；质谱扫描范围：50～1 500 m/z。
-
将采集的质谱数据转换为mzData格式文件，然后通过R软件XCMS程序将质谱数据转化为含有保留时间、质核比、峰强度的数据矩阵。保留频数超过80%的质核比数据，并对所有峰面积以内标峰面积和肝组织质量进行归一化处理。
-
将上述获得的二维矩阵列表导入SIMCA 14.1软件中进行多元统计分析，采用正交偏最小二乘判别分析研究各组间差异，并得到变量VIP值。正常组和模型组组间比较采用独立样本t检验，采用VIP>1，且选择差异具有显著性（P<0.05）的变量作为潜在的差异代谢物，然后检索数据库（HMDB、METLIN、KEGG数据库），筛选出潜在的差异代谢物。
-
使用SPSS 21.0统计软件进行数据统计分析，组间数据采用单因素方差分析（ANOVA），两组样本分析采用独立样本t检验，分析数据差异的统计学意义，以P<0.05为差异有统计学意义。
-
本研究采用UPLC-Q-TOF/MS在正、负两种模式下对肝组织进行代谢组学分析，两种模式下典型的总离子流图见图1。代谢组学数据的稳定性、重现性对研究的可靠性非常重要，为考察实验的系统稳定性，本研究从每个肝组织样品中取10 μl混匀后作为质量控制样品。在样品序列一开始连续进样10针QC样品，并按每7个样品再进样一针，共进样14次。正、负离子模式下，QC样品均显示良好的聚集状况，证明该分析系统稳定可靠。
图 1 肝脏正负离子模式下典型的LC-MS总离子流图
-
经过数据处理后，LC-MS数据集在正离子模式下得到368个离子，在负离子模式下得到249个离子。根据OPLS-DA方法对数据进行分析，OPLS-DA是一种多因变量对多自变量的回归建模方法，最大特点是可以去除自变量和分类变量无关的分类变异，根据得分图可以揭示数据离散程度，发现异常值[7]。在得分图上具有相似的代谢物组成的样本，处在比较相似的位置，样本间距越远代表代谢物差异越大，样本间生理状态相差越大。将正常组、模型组、DHI低剂量组和DHI高剂量组的LC-MS数据导入到SIMCA进行分析，其得分如图2A、2B所示，正常组与模型组样本各自聚为一类，并且完全分离，说明肝纤维化大鼠模型的肝组织代谢轮廓发生显著改变，代谢物的种类或水平发生了明显变化。DHI给药组（DHI低剂量组、DHI高剂量组）能够与模型组明显区分，并向正常组靠近，表明DHI给药组可恢复部分代谢物至正常水平。
图 2 基于LC-MS正负离子模式下的OPLS-DA分析得分图
-
OPLS-DA可用于寻找导致聚类间显著差异的变量，筛选正常组和肝纤维化大鼠模型组间潜在的差异代谢物。基于OPLS-DA模式下VIP>1筛选两组间的差异代谢物，进行t检验后，筛出模型组和正常组间差异具有显著性的变量（P<0.05）。基于VIP和t检验以及HMDB和KEGG等数据库比对，筛选出38个与TAA诱导肝纤维化大鼠模型相关的较为重要的差异代谢物作为潜在生物标志物（表1）。通过KEGG、HMDB等数据库查询，我们发现这些代谢物主要涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径。
表 1 TAA诱导肝纤维化相关的差异代谢物及其代谢通路
编号 代谢物 精确分子量 加合离子 分子式 调节趋势 相关通路 1 丁二酸 118.026 6 M-H C4H6O4 ↓* TCA循环 2 柠檬酸 130.026 6 M+NH4 C5H6O4 ↑** 脂肪酸代谢 3 戊二酸 130.026 6 M+FA-H C5H6O4 ↓*** / 4 L-天冬氨酸 133.037 5 M-H C4H7NO4 ↑* 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 5 丝氨酸甘氨酸 162.064 1 M+H-H2O C5H10N2O4 ↑* 二肽 6 左旋肉碱 162.113 0 M+H C7H16NO3 ↓** 肉碱合成 7 2-甲基-3-苯基丙酸 164.083 7 M+H-H2O C10H12O2 ↑*** / 8 顺乌头酸 174.016 4 M-H C6H6O6 ↓** 三羧酸循环 9 半胱氨酰甘氨酸 178.041 2 M+H C5H10N2O3S ↓*** 谷胱甘肽代谢 10 缬氨冬酰胺 231.121 9 M+NH4 C9H17N3O4 ↓* 二肽 11 尿苷 244.069 5 M-H C9H12N2O6 ↓** 嘧啶代谢 12 甘油磷酸甘油 246.050 5 M-H C6H15O8P ↓** 脂质代谢 13 环状6-羟基褪黑素 246.100 4 M+Na C13H14N2O3 ↓** 褪黑素代谢 14 7,8-二氢蝶呤 255.096 8 M+H C9H13N5O4 ↓* 蝶呤生物合成 15 谷氨酰胺天冬酰胺 261.096 1 M+Na C9H15N3O6 ↑*** 二肽 16 γ-谷氨酰鸟氨酸 261.132 5 M+NH4 C10H19N3O5 ↑*** 二肽 17 3-羟基异戊酰肉碱 261.1576 M+NH4 C12H23NO5 ↓*** 脂肪酸代谢 18 天冬氨酰谷氨酸 262.080 1 M+FA-H C9H14N2O7 ↓*** 二肽 19 N-乙酰5-羟色胺硫酸盐 298.062 3 M-H20-H C12H14N2O5S ↓*** 褪黑素代谢 20 视黄酯 302.224 6 M-H C20H30O2 ↓* 脂肪酸代谢 21 谷胱甘肽 307.083 8 M+H C10H17N3O6S ↓** 谷胱甘肽代谢 22 吲哚酚葡萄糖醛酸苷 309.084 9 M+H C14H15NO7 ↓** 脂质代谢 23 3'-AMP 347.063 1 M+H C10H14N5O7P ↓* 胆酸生物合成 24 苯酰甘氨酸 397.355 6 M+Na C24H47NO3 ↑* 脂肪酸代谢 25 花生四烯酰肉碱 448.342 1 M+H C27H46NO4 ↓** 脂质代谢 26 花生四烯基肉碱 455.397 5 M+H-H2O C27H53NO4 ↑** 脂肪酸代谢 27 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/18∶2(9Z,12Z)) 477.285 5 M+H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 28 溶血磷脂酰乙醇胺(18∶2(9Z,12Z)/0∶0) 477.285 5 M-H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 29 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)) 499.269 9 M+FA-H C25H42NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 30 牛磺熊去氧胆酸 499.296 8 M-H C26H45NO6S ↓* 脂质代谢 31 溶血磷脂酰乙醇胺(20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0∶0) 501.285 5 M+H C25H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 32 二酰甘油(16∶1n7/0∶0/18∶3n3) 588.475 4 M+H-H2O C37H64O5 ↑*** 脂质代谢 33 二酰甘油(14∶0/0∶0/22∶5n3) 614.491 0 M+H C39H66O5 ↑*** 脂质代谢 34 磷脂神经酰胺(d18∶1/16∶0) 617.478 4 M+H-H2O C34H68NO6P ↑*** 鞘脂代谢 35 鞘糖脂(d18∶1/12∶0) 643.502 3 M+H C36H69NO8 ↑*** 磷脂代谢 36 磷脂酰乙醇胺(16∶0/P-16∶0) 675.520 3 M+H-H2O C37H74NO7P ↑** 磷脂代谢 37 磷脂酰乙醇胺（18∶0/15∶0） 705.530 9 M+H-H2O C38H76NO8P ↑*** 磷脂代谢 38 心磷脂(i-13∶0/i-22∶0/i-12∶0/i-13∶0) 1 296.909 6 M+H-H2O C69H134O17P2 ↓* 磷脂代谢 *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，模型组与正常组比较 -
以肝纤维化相关的差异代谢物的相对含量作为检测指标可以评价DHI对肝纤维化的治疗作用，比较发现33种代谢物的含量发生明显逆转（图3），同时，有14种代谢物的含量回调与DHI的剂量成正相关性，即高剂量组比低剂量组回调更多（图3A、3B）。
图 3 33种潜在标志物在正常组、肝纤维化模型组、DHI给药组中的相对含量变化
-
肝纤维化是一种发病机制复杂，可导致肝硬化、肝衰竭甚至肝癌等严重肝脏疾病的慢性流行肝病，然而目前并没有药物可以治疗肝纤维化，中药及其活性成分由于其多靶点、多通路等特点被认为是肝纤维化治疗的潜在药物。代谢组学可以对生物体内小分子代谢产物进行动态分析，通过分析阐述代谢物与生理病理变化间的联系，对肝纤维化的机制进一步阐述，也能通过肝纤维化相关差异代谢物的含量相对变化分析药物对肝纤维化模型的药效作用。本研究用肝脏代谢组学方法分析了与TAA诱导的肝纤维化模型密切相关的38种代谢物，主要涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径，DHI能够通过调节部分代谢通路发挥预防和治疗肝纤维化作用。
-
肝纤维化的产生伴随着肝细胞死亡和肝星状细胞(HSCs)的活化，HSCs约占正常人肝脏中非实质细胞的1/3和总驻留细胞的15%，HSCs从静态到激活会使得ECM过剩表达而导致纤维化，而氧化应激在HSCs激活和ECM形成中发挥重要的促进作用[1, 8]。谷胱甘肽（GSH）是人体内含量最丰富的抗氧化剂，也是体内氧化防御体系的主要组成成分之一[9]。GSH可以在谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽-S-转移酶以及谷胱甘肽还原酶的作用下与其氧化态相互转换，清除部分有机过氧化物，调节体内的氧化还原稳态，缓解氧化应激对组织造成的损伤[10-11]。有研究表明，在对乙酰氨基酚、四氯化碳、重金属砷等诱导下，大鼠肝组织中GSH含量下降[12]。本研究中，TAA诱导的肝纤维化大鼠模型肝组织中GSH显著下降，这与谷胱甘肽在其他肝损模型中下调的趋势一致。经过DHI干预后GSH回调，且高剂量DHI比低剂量组回调比例更大，这说明DHI可能调整体内谷胱甘肽代谢通路，通过提高体内谷胱甘肽含量恢复肝组织抗氧化功能，缓解氧化应激对肝脏的进一步损伤，从而起到抗肝纤维化作用。
-
肝纤维化过程中，抑制HSC的激活和增殖是预防和治疗肝纤维的重要途径。血小板衍生生长因子(PDGF)可以激活JAK2/STAT3信号通路，致使HSC增殖，并抑制HSC凋亡[13]。已有研究证明，褪黑素通过抑制JAK2/STAT3相关信号通路或抗氧化机制来抑制HSC的激活和增殖从而发挥肝脏保护作用[14-15]。在本研究中，环6-羟基褪黑素及N-乙酰血清素硫酸盐均为褪黑素代谢产物，在模型组中含量显著增加，说明褪黑素被大量代谢，肝脏保护作用被抑制。经过DHI的干预后两种褪黑素代谢产物均回调，这提示DHI可能通过调整褪黑素代谢，回调褪黑素及其代谢产物的机体内含量发挥抗肝纤维化活性。
-
肝脏是机体物质代谢的中枢器官，在氨基酸的新陈代谢和蛋白质的合成与分解中发挥重要作用。天冬氨酸是一种酸性氨基酸。天冬氨酸在哺乳动物中一般被认为是一种营养上非必需的氨基酸。然而，越来越多的文献表明，天冬氨酸在包括肝脏生理学在内的许多生物和生理过程中起着重要作用，如合成精氨酸以维持巨噬细胞应对免疫挑战，同时，也有证据表明天冬氨酸可以减轻肝损伤、增强肝脏功能[16]。本研究发现TAA诱导大鼠肝纤维化后，与正常组比较，模型组中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路被干扰，L-天冬氨酸含量显著变化，经过DHI的干预后回调，这提示DHI可能调整丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路，改变体内天冬氨酸含量发挥肝保护作用。
-
脂质不仅是细胞膜的组成成分，而且参与信号转导。磷脂酰胆碱、鞘脂、溶血性磷脂酰胆碱是血清脂蛋白和细胞膜的重要组成成分。溶血磷脂酰乙醇胺是磷脂酶A1水解磷脂酰乙醇胺(PE)失去一分子脂肪酸生成的产物，作为一种溶血卵磷脂，在肝脏中与卵磷脂一起在线粒体间进行转移[17]。有研究证明，PE通过N-甲基转移酶生成PC的通路约占PC产生量的30%，磷脂酰胆碱为肝脏重要营养来源，可以拮抗肝脏受病毒、药物、酒精及其他有毒物质的侵害，防止肝纤维化[9]。肝脏是脂质生成和脂肪酸氧化等脂类代谢的主要场所，肝纤维化时可以引起脂质合成、转运及分解代谢的普遍紊乱，而脂质代谢异常又会加重肝损害，引起肝脏的脂毒性[18]。在本研究中，4种LysoPE在模型组中均发生下降，另外一些磷脂代谢相关物质，如GlcCer(d18:1/12:0)、PE(16:0/P-16:0)、PE(18:0/15:0)、CL(i-13:0/i-22:0/i-12:0/i-13:0)和脂质代谢相关物质如二酰甘油（DG）、甘油磷酸甘油、牛磺酸熊去氧胆酸等在正常组与模型组大鼠中也存在显著差异，说明TAA诱导的大鼠肝纤维化模型脂质代谢的紊乱。经过DHI干预治疗后，代谢物水平不同程度得到回调，表明DHI可通过干预多个脂质代谢通路发挥其抗肝纤维化活性。
-
三羧酸循环是糖、脂肪、氨基酸三大营养素的最终代谢通路，在能量代谢、提供生物合成的前体中起重要作用。琥珀酸既是三羧酸循环的的重要中间产物，也是一种重要的细胞外信号分子，在信号传递、炎症反应、肝纤维化的发生发展中发挥着重要作用[19]。在本研究中，肝纤维化模型组大鼠琥珀酸的代谢变化趋势均与正常大鼠相反，而给予DHI后趋近正常，说明DHI能够改善肝纤维化大鼠的能量代谢。
-
本研究建立了LC-MS代谢组学分析的方法，通过OPLS-DA筛选出与肝纤维化密切相关的38种差异代谢产物，主要涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径。基于38种差异代谢物在正常组、模型组及DHI给药组之间相对含量的差异，对DHI预防治疗大鼠肝纤维化模型的药效进行了评价，结果表明DHI能够回调34种潜在差异代谢物的相对含量，调节部分失衡代谢通路，发挥抗肝纤维化作用。本研究为肝纤维化的新标志物和治疗靶点的发现以及DHI作为抗肝纤维化潜在药物的进一步开发应用提供实验依据。
Metabolomics study of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis with LC-MS technology
-
摘要:
目的 利用肝脏代谢组学方法监测肝纤维化相关的代谢变化，评价二氢丹参酮Ⅰ治疗肝纤维化的药效及作用机制。 方法 将28只雄性SD大鼠随机分为4组：正常组、肝纤维化模型组和二氢丹参酮Ⅰ低剂量组、二氢丹参酮Ⅰ高剂量组。采用硫代乙酰胺诱导肝纤维化模型，给予4周治疗后，取大鼠肝脏进行液相色谱-质谱分析，结合OPLS-DA模式识别方法筛选模型组和正常组之间的差异代谢物，并以此评价二氢丹参酮Ⅰ对肝纤维化的治疗作用。 结果 通过肝脏代谢组学分析鉴定了38种肝纤维化相关的生物标志物，涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等代谢通路，同时数据显示二氢丹参酮Ⅰ的干预对肝纤维化有改善作用。 结论 二氢丹参酮Ⅰ能够通过调节失衡的谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径而发挥预防和治疗肝纤维化作用。 Abstract:Objective To evaluate therapeutic effects of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis based on liver metabolomics method. Methods 28 rats were randomly divided into four groups including control group, hepatic fibrosis model group and dihydrotanshinone Ⅰ low dose group and dihydrotanshinone Ⅰ high dose group. The dihydrotanshinone Ⅰ treated groups received dihydrotanshinone Ⅰ for 28 days. The rat liver samples were collected and analyzed by liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS). The OPLS-DA pattern recognition analysis of metabolomics differences among the groups and therapeutic effects of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis were evaluated. Results 38 metabolites were identified through liver metabolomics analysis. The possible mechanism of hepatic fibrosis was mainly involved glutathione metabolism, melatonin metabolism, amino acid metabolism, lipid metabolism and TCA cycle. The hepatic fibrosis induced by TAA was reversed by dihydrotanshinone Ⅰ. Conclusion Dihydrotanshinone Ⅰ provided satisfactory therapeutical effects on hepatic fibrosis through partially regulating the perturbed glutathione metabolism, melatonin metabolism, amino acid metabolism, lipid metabolism, TCA cycle. -
Key words:
- hepatic fibrosis /
- dihydrotanshinone I /
- LC-MS /
- metabolomics
-
银屑病是受遗传与环境影响[1]的由免疫介导[2]的一种慢性、炎症性皮肤病，患者症状常表现为暗红色斑块或浸润性红斑，上覆有白色、层状鳞屑，有蜡滴、薄膜、点状出血等，又称为牛皮癣、白疕。其病理组织在显微镜下呈现表皮层异常增厚、颗粒层变薄或缺失、毛细血管扩张和炎症细胞浸润等特征[3]。据统计，全球约有1.25亿人受银屑病影响[4]，发病率呈逐年递增趋势，患者还常伴有心血管疾病、代谢性疾病、精神性疾病和免疫性疾病等合并共病，这些共病不仅影响患者的生活质量，还增加了治疗的难度和复杂性[5]。治疗银屑病存在周期长、易复发等难点，临床治疗主要以缓解患者症状、抑制病情复发及减少共病并发为主[6]。
目前，银屑病的治疗方法包括外用药物、口服药物、生物制剂、光疗法等。轻中度患者常单独外用润肤剂、糖皮质激素、维生素D3衍生物、维A酸类、钙调磷酸酶抑制剂和生物制剂等药物；中重度患者则多系统治疗，如联用糖皮质激素与维生素D3衍生物类等外用药物，口服甲氨蝶呤、环孢素、维A酸类、糖皮质激素等制剂，皮下注射生物制剂及结合光疗法、辅助疗法等[7]。然而，以上治疗方法疗效有限，长期使用可能诱发局部皮肤萎缩、酒渣鼻及依赖性等不良反应，因此，寻求安全、有效、延长复发的药物是治疗银屑病的难点。对此中医药具有辨证论治、副作用小、疗效显著及性价比高等优势。
近年来，多项临床研究表明，中药狼毒口服、外用均可有效治疗银屑病；其提取物可缓解疼痛、促进创面愈合，具有良好的抑菌、抗炎活性[8]。但狼毒的基源和药效物质尚不明确，阻碍了其临床应用。据记载，自西汉以来，药用狼毒以瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）或大戟科大戟属植物狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud.）、甘肃大戟（Euphorbia kansuensis Prokh.）的干燥根为主[9-10]，上述三种基源的狼毒均有临床应用。为了探究三种狼毒在临床上的疗效差异，本研究拟通过构建 IMQ 诱导的银屑病样小鼠模型，以醇提取物的方式，探究三种狼毒对银屑病的防治作用。
1. 材料
1.1 实验动物
SPF级雄性BALB/c小鼠36只，8 周龄，体质量约22～25 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号：20220004035001；实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004。 本实验经上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物伦理委员会批准。小鼠于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物房适应性喂养１周后开始实验。
1.2 药物和试剂
瑞香狼毒（采自河北保定）、狼毒大戟（采自东北吉林）和甘肃大戟（采自甘肃兰州）经上海中医药大学朱建勇副主任药师鉴定为Stellera chamaejasme L.、Euphorbia fischeriana Steud.及Euphorbia kansuensis Prokh.）；凡士林[联合利华（中国）有限公司，规格：100 g]；5%咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限责任公司，规格：3 g/支）；卡泊三醇软膏（爱尔兰利奥制药有限公司，规格：30 g：1.50 mg）；95%乙醇（规格：20 kg/塑桶）、二甲苯（规格：500 ml）和30% 双氧水（H2O2，规格：500 ml），均购于国药集团化学试剂有限公司；4% 多聚甲醛固定液（上海碧云天生物技术股份有限公司，规格：100 ml）；苏木素-伊红染色剂试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，规格：100 ml）；柠檬酸抗原修复液（规格：1 L，pH 6.0，即用型），Anti-Ki67 小鼠单克隆抗体（规格：50 μl）、PBS缓冲液（规格：500 ml，pH 7.4，即用型）、牛血清白蛋白（BSA，规格：100 g）和DAB显色试剂盒（规格：200 T），均购于武汉赛维尔生物科技有限公司；超纯水（实验室自制）。
1.3 仪器
BF-08小型高速粉碎机（河北本辰科技有限公司）；HDM-500恒温电热套（上海精密仪器仪表有限公司）；N-
1300 旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；EG1150H石蜡包埋机、RM2016切片机（德国徕卡仪器有限公司）；VS200全玻片扫描仪（日本奥林巴斯有限公司）；Heal Force SMART-N 超纯水机（香港力康生物医疗科技控股有限公司）。2. 方法
2.1 药物制备
将适量瑞香狼毒、狼毒大戟和甘肃大戟的干燥根粉碎成粗粉，各取50 g加至回流提取装置中，用4倍量95％乙醇回流提取3次，每次1 h。将提取液过滤、合并，减压蒸馏回收乙醇，分别得瑞香狼毒、狼毒大戟和甘肃大戟浸膏5.61 g、6.41 g和7.04 g。取适量浸膏，加超纯水制成生药含量为1 g/ml的醇提取物溶液，高压灭菌后备用。
2.2 造模
实验所用的BALB/c雄性小鼠，适应性喂养1周后，背部剃毛约2 cm × 3 cm面积，次日起，除空白组小鼠背部涂抹凡士林外，其余各组小鼠背部均匀涂抹 5% 咪喹莫特软膏，每次涂抹62.5 mg，每日1次，连续7 d。
2.3 分组及给药
将36只小鼠随机分为空白组、模型组、瑞香狼毒组、狼毒大戟组、甘肃大戟组和卡泊三醇组，每组6只。自造模第1 d起，除空白组和模型组外，其余各组小鼠背部在涂抹造模药4 h后，基于Selenge[11]、Wang[12]及徐[13]等人的报道及前期动物预实验结果，按0.4 ml/10 g分别涂抹浓度稀释至2.5 mg/ml的瑞香狼毒醇提取物、狼毒大戟醇提取物、甘肃大戟醇提取物溶液及62.5 mg卡泊三醇软膏，每日1次，连续7 d。
2.4 银屑病面积和严重程度指数（PASI）
每日拍照记录小鼠背部的皮肤变化。并采用 PASI 评分，按照无（0分）、轻度（1分）、中度（2分）、重度（3分）和极度严重（4分）5个等级，对小鼠的红斑（Erythema）、鳞屑（Scales）和浸润（Tickness）程度进行评分，并将三者的评分相加为总评分，取平均分（n = 6）绘制趋势线，以反映小鼠皮损的变化情况。
2.5 苏木精-伊红染色法（HE）
末次给药24 h后，各组小鼠经异氟烷麻醉，脱颈处死后取小鼠背部皮损组织，采用4%多聚甲醛溶液固定24 h以上；经过脱水、石蜡包埋、切片和脱蜡处理后，苏木素染色5 min后，流水冲洗；用 1% 盐酸乙醇分化 0.5 min，流水冲洗 ；用伊红染色2 min，流水冲洗；用乙醇脱水后，二甲苯透化10 min；最后滴加中性树脂封片，自然晾干后，在显微镜下观察皮损组织病理变化，并利用Image J软件测量各组小鼠背部皮损组织表皮层厚度。
2.6 免疫组化（IHC）
取“2.5”项下皮肤组织切片脱蜡、水化，放入柠檬酸缓冲溶液煮沸10 min进行抗原修复，3% H2O2室温阻断内源性过氧化物酶25 min，PBS冲洗3次，3% BSA室温封闭30 min后，PBS冲洗3次，Ki67抗体（1：500）4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次，二抗室温孵育50 min，PBS冲洗3次，DAB显色2 min，流水冲洗终止显色，苏木精复染细胞核 1 min，脱水、透明、封片。风干后置显微镜下观察，并运用Image Pro Plus 8.0 软件统计Ki67阳性细胞数，并计算Ki67阳性细胞百分率及累计光密度（IOD）。
2.7 统计学方法
采用GraphPad Prism 9统计软件进行数据分析及科研绘图；计量资料以
$ \bar x \pm s $ 表示，若满足正态分布且方差齐性，多组间比较采用单向方差分析，以P≥0.05表示无差异，P<0.05表示有差异且具统计学意义，P<0.01表示有显著差异。3. 结果
3.1 三种狼毒醇提取物对银屑病小鼠的影响
如图1所示，空白组小鼠无皮损变化。与空白组相比，模型组小鼠经IMQ诱导后，其背部剃毛区出现不同程度的皮损；造模第4 d可见小鼠皮肤上伴有大面积红斑和片状鳞屑；第7 d斑块颜色有所加深，鳞屑呈层状分布，有部分鳞屑脱落，以上症状均与寻常型银屑病相符。与模型组相比，经瑞香狼毒、狼毒大戟和甘肃大戟干预后的银屑病样小鼠的皮损程度均有所缓解，其中瑞香狼毒醇提取物的效果较为显著，小鼠皮肤上的斑块颜色变浅、鳞屑大面积脱落、浸润程度减轻。
3.2 三种狼毒醇提取物对银屑病小鼠 PASI评分的影响
PASI评分结果显示（图2），小鼠自造模第1 d开始，其红斑、鳞屑、浸润及总积分会随时间推移而升高，在第 5 ～ 7 d达到峰值；而瑞香狼毒组、狼毒大戟组、甘肃大戟组和卡泊三醇组的评分均低于同时期的模型组，且在第 4 ～ 5 d后呈下降趋势，其中以瑞香狼毒组的下降幅度最为显著。
3.3 三种狼毒醇提取物对银屑病小鼠皮损组织病理的影响
皮肤组织病理结果显示（图3），空白组小鼠表皮层厚度相对其余各组明显较薄（图4），基底层细胞正常排列，真皮浅层及血管周围未见明显炎性细胞浸润；模型组小鼠表皮层厚度显著增加，角化过度伴角化不全，角质层可见微脓肿，棘层肥厚，棘突向下延伸呈棒槌状，真皮层内毛细血管扩张，且血管周围淋巴细胞浸润明显，符合银屑病样皮肤组织病理特点。瑞香狼毒组、狼毒大戟组、甘肃大戟组和卡泊三醇组小鼠的表皮层厚度均低于模型组（P<0.01），角化不全有所减轻，浸润情况有所改善。结果表明，三种狼毒醇提物均能抑制银屑病样小鼠表皮细胞的异常增殖，降低炎症细胞的浸润。与临床常见的外用药卡泊三醇相比，瑞香狼毒醇提取物的抗银屑病活性更为显著。瑞香狼毒醇提取物能显著改善IMQ诱导的寻常型银屑病小鼠皮损。
3.4 三种狼毒醇提取物对银屑病小鼠皮损组织中Ki67 表达的影响
免疫组化结果显示（图5），Ki67在银屑病小鼠的皮肤组织中为椭圆形、棕黄色点状分布。各组小鼠表皮中均有Ki67阳性细胞存在，但着色深浅与面积均有差异，其中空白组小鼠的表皮基底层有极少量Ki67表达，呈单层点状分布；与空白组相比，模型组小鼠的阳性表达显著增加（ P<0.01），呈多层密集分布；与模型组相比，三种狼毒均能降低Ki67的表达（ P<0.01），其中瑞香狼毒组中Ki67基本呈单层线状分布，其阳性细胞百分率（图6）和累计光密度值（图7）均显著降低（P<0.01），其抑制作用优于卡泊三醇组。
4. 讨论
中医认为银屑病是由于血热、湿热、风邪[14]等因素导致的，治疗时使用清热解毒、祛风止痒、活血化瘀等中药可有效改善银屑病的症状[15]。据报道，狼毒在治疗血热证银屑病、角化病等皮肤病上具有显著的疗效[11]，在银屑病的治疗和预防方面具有潜在价值和应用前景。然而狼毒的同名异物品种很多，基源多达十几种，使得狼毒的质量和疗效存在一定的不确定性。据历代本草记载和近现代文献考证，瑞香科狼毒属瑞香狼毒 Stellera chamaejasme L.是药用狼毒的主流品种[16]，为狼毒正品，其味苦辛、性平，入肺、脾、肝经，可用于治疗心腹冷痛、结核及疥癣等诸多病症，具有镇痛、免疫调节、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等药理活性[17]，其根含有二萜类、黄酮类和苯丙素类等多种化学成分[18-20]；而大戟科大戟属狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.和月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata分别是䕡茹和草䕡茹[21]，为狼毒的混淆品[22]，且经《中国植物志》中的形态对比，月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata实为甘肃大戟Euphorbia kansuensis Prokh.的异名[23]。狼毒大戟根呈圆锥形，切面可见同心环；月腺大戟根偏椭圆型，切面可见不规则的大理石样纹理或环纹[24]。两者的根含有二萜类、三萜类、酚酸类、生物碱类和蒽醌类等成分[25-27]。
为了探究上述三种基源的狼毒治疗银屑病的疗程差异，本研究对其进行了体内抗银屑病活性实验。结果表明，三个品种的狼毒均能有效改善银屑病样小鼠皮损，其中瑞香狼毒的抗银屑病活性最佳，但其作用机制暂未明确。因此，本课题组后续拟借助中药靶点钩钓技术及体内外研究方式，将进一步探讨瑞香狼毒治疗银屑病的药效成分及作用机制，为银屑病的治疗提供新的思路和方法。同时，也为狼毒的质量控制和标准化提供参考，确保其安全性和有效性。
-
表 1 TAA诱导肝纤维化相关的差异代谢物及其代谢通路
编号 代谢物 精确分子量 加合离子 分子式 调节趋势 相关通路 1 丁二酸 118.026 6 M-H C4H6O4 ↓* TCA循环 2 柠檬酸 130.026 6 M+NH4 C5H6O4 ↑** 脂肪酸代谢 3 戊二酸 130.026 6 M+FA-H C5H6O4 ↓*** / 4 L-天冬氨酸 133.037 5 M-H C4H7NO4 ↑* 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 5 丝氨酸甘氨酸 162.064 1 M+H-H2O C5H10N2O4 ↑* 二肽 6 左旋肉碱 162.113 0 M+H C7H16NO3 ↓** 肉碱合成 7 2-甲基-3-苯基丙酸 164.083 7 M+H-H2O C10H12O2 ↑*** / 8 顺乌头酸 174.016 4 M-H C6H6O6 ↓** 三羧酸循环 9 半胱氨酰甘氨酸 178.041 2 M+H C5H10N2O3S ↓*** 谷胱甘肽代谢 10 缬氨冬酰胺 231.121 9 M+NH4 C9H17N3O4 ↓* 二肽 11 尿苷 244.069 5 M-H C9H12N2O6 ↓** 嘧啶代谢 12 甘油磷酸甘油 246.050 5 M-H C6H15O8P ↓** 脂质代谢 13 环状6-羟基褪黑素 246.100 4 M+Na C13H14N2O3 ↓** 褪黑素代谢 14 7,8-二氢蝶呤 255.096 8 M+H C9H13N5O4 ↓* 蝶呤生物合成 15 谷氨酰胺天冬酰胺 261.096 1 M+Na C9H15N3O6 ↑*** 二肽 16 γ-谷氨酰鸟氨酸 261.132 5 M+NH4 C10H19N3O5 ↑*** 二肽 17 3-羟基异戊酰肉碱 261.1576 M+NH4 C12H23NO5 ↓*** 脂肪酸代谢 18 天冬氨酰谷氨酸 262.080 1 M+FA-H C9H14N2O7 ↓*** 二肽 19 N-乙酰5-羟色胺硫酸盐 298.062 3 M-H20-H C12H14N2O5S ↓*** 褪黑素代谢 20 视黄酯 302.224 6 M-H C20H30O2 ↓* 脂肪酸代谢 21 谷胱甘肽 307.083 8 M+H C10H17N3O6S ↓** 谷胱甘肽代谢 22 吲哚酚葡萄糖醛酸苷 309.084 9 M+H C14H15NO7 ↓** 脂质代谢 23 3'-AMP 347.063 1 M+H C10H14N5O7P ↓* 胆酸生物合成 24 苯酰甘氨酸 397.355 6 M+Na C24H47NO3 ↑* 脂肪酸代谢 25 花生四烯酰肉碱 448.342 1 M+H C27H46NO4 ↓** 脂质代谢 26 花生四烯基肉碱 455.397 5 M+H-H2O C27H53NO4 ↑** 脂肪酸代谢 27 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/18∶2(9Z,12Z)) 477.285 5 M+H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 28 溶血磷脂酰乙醇胺(18∶2(9Z,12Z)/0∶0) 477.285 5 M-H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 29 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)) 499.269 9 M+FA-H C25H42NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 30 牛磺熊去氧胆酸 499.296 8 M-H C26H45NO6S ↓* 脂质代谢 31 溶血磷脂酰乙醇胺(20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0∶0) 501.285 5 M+H C25H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 32 二酰甘油(16∶1n7/0∶0/18∶3n3) 588.475 4 M+H-H2O C37H64O5 ↑*** 脂质代谢 33 二酰甘油(14∶0/0∶0/22∶5n3) 614.491 0 M+H C39H66O5 ↑*** 脂质代谢 34 磷脂神经酰胺(d18∶1/16∶0) 617.478 4 M+H-H2O C34H68NO6P ↑*** 鞘脂代谢 35 鞘糖脂(d18∶1/12∶0) 643.502 3 M+H C36H69NO8 ↑*** 磷脂代谢 36 磷脂酰乙醇胺(16∶0/P-16∶0) 675.520 3 M+H-H2O C37H74NO7P ↑** 磷脂代谢 37 磷脂酰乙醇胺（18∶0/15∶0） 705.530 9 M+H-H2O C38H76NO8P ↑*** 磷脂代谢 38 心磷脂(i-13∶0/i-22∶0/i-12∶0/i-13∶0) 1 296.909 6 M+H-H2O C69H134O17P2 ↓* 磷脂代谢 *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，模型组与正常组比较 
下载: 导出CSV
-
[1] Tsochatzis EA, Bosch J, Burroughs A K. Liver cirrhosis[J]. Lancet,2014,383(9930):1749-1761. doi: 10.1016/S0140-6736(14)60121-5 [2] CHANG M L, YANG S S. Metabolic signature of hepatic fibrosis: from individual pathways to systems biology[J]. Cells,2019,8(11):E1423. doi: 10.3390/cells8111423 [3] GE M X, LIU H, ZHANG Y X, et al. The anti-hepatic fibrosis effects of dihydrotanshinone I are mediated by disrupting the yes-associated protein and transcriptional enhancer factor D2 complex and stimulating autophagy[J]. Br J Pharmacol,2017,174(10):1147-1160. doi: 10.1111/bph.13766 [4] WANG F, MA J, WANG K S, et al. Blockade of TNF-α-induced NF-κB signaling pathway and anti-cancer therapeutic response of dihydrotanshinone I[J]. Int Immunopharmacol,2015,28(1):764-772. doi: 10.1016/j.intimp.2015.08.003 [5] WEI Y D, XU M J, REN Y, et al. The cardioprotection of dihydrotanshinone I against myocardial ischemia-reperfusion injury via inhibition of arachidonic acid ω-hydroxylase[J]. Can J Physiol Pharmacol,2016,94(12):1267-1275. doi: 10.1139/cjpp-2016-0036 [6] 邢心睿. 扶正化瘀方抗肝纤维化的网络多靶标作用机制研究[D]. 上海: 海军军医大学, 2019. [7] 李俊南, 侯艳, 孙凤宇, 等. OPLS方法的原理及其在代谢组学数据判别分析中的应用[J]. 中国卫生统计, 2014, 31(5):765-769. [8] LUANGMONKONG T, SURIGUGA S, MUTSAERS H A M, et al. Targeting oxidative stress for the treatment of liver fibrosis[J]. Rev Physiol Biochem Pharmacol,2018,175:71-102. [9] HOU Y Y, WANG Y, WANG H H, et al. Induction of glutathione synthesis in human hepatocytes by acute and chronic arsenic exposure: differential roles of mitogen-activated protein kinases[J]. Toxicology,2014,325:96-106. doi: 10.1016/j.tox.2014.09.002 [10] TRAVERSO N, RICCIARELLI R, NITTI M, et al. Role of glutathione in cancer progression and chemoresistance[J]. Oxid Med Cell Longev,2013,2013:972913. [11] 高兰, 龙世棋, 陈博鑫, 等. 还原型谷胱甘肽靶向氧化应激对肝癌干细胞的作用[J]. 临床与实验病理学杂志, 2020, 36(8):887-892. [12] 刘仁伟, 刘冰. 黄芩苷胶囊联合胸腺法新治疗慢性乙型肝炎的临床研究[J]. 现代药物与临床, 2018, 33(12):3312-3316. [13] 岳彩飞, 洪汝涛, 徐德祥, 等. 褪黑素对PDGF诱导的肝星状细胞中JAK2/STAT3信号通路的影响[J]. 中国药理学通报, 2020, 36(3):403-407. doi: 10.3969/j.issn.1001-1978.2020.03.020 [14] LIN X, KONG L N, HUANG C, et al. Hesperetin derivative-7 inhibits PDGF-BB-induced hepatic stellate cell activation and proliferation by targeting Wnt/β-catenin pathway[J]. Int Immunopharmacol,2015,25(2):311-320. doi: 10.1016/j.intimp.2015.02.009 [15] LEBDA M A, SADEK K M, ABOUZED T K, et al. Melatonin mitigates thioacetamide-induced hepatic fibrosis via antioxidant activity and modulation of proinflammatory cytokines and fibrogenic genes[J]. Life Sci,2018,192:136-143. doi: 10.1016/j.lfs.2017.11.036 [16] LENG W B, LIU Y L, SHI H F, et al. Aspartate alleviates liver injury and regulates mRNA expressions of TLR4 and NOD signaling-related genes in weaned pigs after lipopolysaccharide challenge[J]. J Nutr Biochem,2014,25(6):592-599. doi: 10.1016/j.jnutbio.2014.01.010 [17] 仰贤莉, 李光伟, 康璐, 等. 扶正化瘀方抗大鼠肝纤维化疗效的代谢组学研究[J]. 中成药, 2016, 38(11):2342-2346. [18] WU T, ZHENG X J, YANG M, et al. Serum lipid alterations identified in chronic hepatitis B, hepatitis B virus-associated cirrhosis and carcinoma patients[J]. Sci Rep,2017,7:42710. doi: 10.1038/srep42710 [19] LI Y H, WOO S H, CHOI D H, et al. Succinate causes α-SMA production through GPR91 activation in hepatic stellate cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2015,463(4):853-858. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.06.023 期刊类型引用(0)
其他类型引用(1)
-
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 9648
- HTML全文浏览量: 2193
- PDF下载量: 50
- 被引次数: 1
