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鸡骨草（Abri Herba）来源于豆科相思子属植物广州相思子（Abrus cantoniensis Hance），野生资源主要集中分布于岭南地区以及中南半岛等地，《中华人民共和国药典》（2020年版）[1]及部分地方中药材标准[2]、中药饮片炮制规范[3]等均有收录，药用具有利湿退黄、清热解毒、疏肝止痛之功，常用于湿热黄疸、胁肋不舒、胃脘胀痛、乳痈肿痛、急慢性肝炎、胆囊炎等。鸡骨草含有多种活性物质，包括皂苷类[4]、黄酮类、生物碱类[5]、多糖[6]、氨基酸[7]、挥发油及脂肪酸[8]等，如相思子皂苷Ⅰ、大豆皂苷、槐花皂苷、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、相思子碱、刺桐碱等。文献研究发现，鸡骨草具有促进伤口愈合[9]、抗菌[10]、抗病毒[11]、抗氧化[12]、抗肿瘤、免疫调节[13]、抗肝炎病毒[14]、降脂保肝[15-16]等作用，民间也常用鸡骨草制作药膳、凉茶，具有较高的食用价值。目前鸡骨草法定质量标准主要对鸡骨草性状、显微、薄层色谱法（TLC）鉴别相思子碱等项做了初步的质量控制，相思子碱能够较好地反应鸡骨草正品的特性，但是相思子碱在相思子属其他植物中亦有发现，专属性不强，目前市场上常见有相思子属毛相思子（Abrus mollis Hance）与其混淆应用。通过网络药理学[17]及分子对接技术[18]寻找适合鸡骨草质量控制的质量标志物（Q-marker）[19-20]，建立符合鸡骨草药用活性特征的质量标准，能够更好地鉴定鸡骨草的质量及药用食用价值。
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赛默飞Vanquish Core型液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）；岛津LC-20A型液相色谱仪（日本岛津株式会社）；SK7200H超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；RH-600A高速多功能粉碎机（浙江荣洁工资有限公司）；XS105DU电子天平（梅特勒-托利多公司）；鼓风式干燥箱（上海般诺生物科技有限公司）；色谱柱：Thermo AcclaimTM 120 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，120Å，赛默飞世尔科技有限公司）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷伦科技公司）、Diamonsil® C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，北京迪马科技有限公司）。
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鸡骨草（经海军军医大学药学系黄宝康教授鉴定为豆科植物广州相思子Abrus cantoniensis Hance的干燥全草），药材市场采购或产地采集，根据采集地不同分别设置批号为JGC-xx（采集序号)-xxx（样品序号），共13个批次；相思子碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111808-202003）、刺桐碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：112058-202001）、夏佛塔苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111912-202204，纯度：94.9%）、异夏佛塔苷对照品（四川维克奇生物科技有限公司，纯度：98%）；乙腈、甲醇（色谱纯，Merck公司）；甲酸（分析级，国药集团）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。
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检索中药网络药理学常用数据库与分析平台TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/）、ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）等，结合鸡骨草主要活性化合物文献检索，根据OB值、OD值以及类药5原则等，获取鸡骨草中活性明确且具有成药性的化合物，再通过 Pubchem查询相关化合物Canonical SMILES 编号，输入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）获取化合物所对应的靶标蛋白的Uniprot ID。共选取Soyasaponin Bb、Kaikasaponin Ⅲ、Abrisapogenol A、Abrisapogenol D、Sophoradiol、Kudzusapogenol A、 Abrisaponin I、Abrine、Hypaphorine、Schaftoside、Isoschaftoside、butin等12种不同结构的化合物，筛选其药理活性作用靶点，筛去重复靶标，最终获得237个靶标，通过Cytoscape3.8.2软件构建“鸡骨草-成分-潜在靶点”可视化网络图（图1）。网络中包括250个节点和440条边，平均节点度值3.520。
图 1 “鸡骨草-成分-靶点”可视化网络图
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将“2.1.1”项下筛选所得靶标导入STRING 11.0 在线数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）进行PPI 网络分析。选择物种为“Homo sapiens”，蛋白交互参数评分值为“high confidence>0.9”，隐藏网络中无联系的节点，其余参数设置不变，获得化合物靶点PPI网络图（图2）。结果共获得237个节点，360条边，平均节点度为3.04，预期边数135，PPI富集P值<1.0e-16。再将PPI结果以TSV文本格式导入Cytoscape 3.8.2软件中，进行拓扑属性分析，选取亲密度、间隔度、自由度3个重要参数，共计筛选21个网络参数大于均值（0.322、9.662、5.180）的核心靶标（图3）。包括信号传导与转录激活因子3（STAT3）、基质金属蛋白酶2、9（MMP2、9）、蛋白激酶（AKT1）、表面活性蛋白C（SRC）、淋巴细胞特异蛋白酪氨酸激酶（LCK）、雌激素受体alpha（ESRα）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARγ）、一氧化氮合酶2（NOS2）、缺氧诱导因子-1alpha（HIF1A）、生长因子受体结合蛋白2（GRB2）、双微体2蛋白（MDM2）、糖原合酶激酶3Β（GSK3B）、酪氨酸蛋白激酶受体B2（EPHB2）、α-突触核蛋白（SNCA）等靶标。
图 2 化合物靶点PPI网络图
图 3 核心靶点筛选
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应用metascape 数据库（https://metascape.org/gp/index.html）对21个主要潜在的靶点进行基因本体（GO）功能和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。其中，靶点经生物过程（BP）相关条目463 条，主要涉及细胞凋亡正调控（positive regulation of cell death）、蛋白质水解调控（regulation of proteolysis）、细胞对有机氮化合物的反应（cellular response to organonitrogen compound）、TGF-β响应（response to transforming growth factor-beta）等；细胞组分（CC）有34个条目，主要涉及复合物转录调节（transcription regulator complex）、谷氨酸突触（glutamatergic synapse）、细胞质核周区（perinuclear region of cytoplasm）等；分子功能（MF）有42个条目，主要涉及DNA-结合转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）、转录因子结合（transcription factor binding）、蛋白质结构域特异性结合（protein domain specific binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、分子适配器活性（molecular adaptor activity）等，各选取显著性前10 条目展示（图4）。KEGG通路富集分析得到79个通路条目，选取显著性前20的条目通过桑基图呈现（图5）。Y轴为信号通路，X轴为该通路靶向基因占总基因的比率，气泡颜色表示该通路基因富集的显著性，气泡大小表示该通路的基因数量。其中AKT1、STAT3、HIF1A、GRB2、MMP9等主要靶点蛋白与松弛素信号通路（relaxin signaling pathway）、甲状腺激素信号通路（thyroid hormone signaling pathway）、B细胞受体信号通路（B cell receptor signaling pathway）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、ErbB信号途径（ErbB signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、JAK-STAT 信号通路（JAK-STAT signaling pathway）、乙型肝炎（hepatitis B）等具有较强的关联性。
图 4 GO功能富集分析
图 5 KEGG富集分析桑基图
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通过PubChem获取相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等化合物3D结构，根据自由度选取“成分-靶点-通路”网络中靠前的靶标，检索PDB数据库（http://www.rcsb.org/）获得靶标蛋白结构，再将蛋白与化合物结构文件导入 pymol 软件进行去水、加氢、删除重复链等预处理，模拟化合物与靶标作用模式，计算结合能，结合能小于0表明可以自由结合，结果如表1、图6所示。
表 1 成分-靶标分子对接结果
靶标 PDB ID 活性成分 结合能(kcal/mol) AKT1 4GAH 相思子碱 −4.67 刺桐碱 −4.34 夏佛塔苷 −2.98 STAT3 5AX3 相思子碱 −4.72 刺桐碱 −4.56 夏佛塔苷 −2.82 HIF1A 3OUI 相思子碱 −4.02 刺桐碱 −3.93 夏佛塔苷 −2.36 大豆皂苷Bb −0.27 GRB2 3IMD 相思子碱 −5.0 刺桐碱 −5.66 夏佛塔苷 −4.68 大豆皂苷Bb −2.46 MMP2 8H78 相思子碱 −7.21 刺桐碱 −7.02 夏佛塔苷 −5.83 大豆皂苷Bb −4.28 
图 6 成分–关键靶标分子对接
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成分分析采用C18色谱柱（Thermo、Agilent、Diamonsil）；流动相采用梯度洗脱，A相为乙腈，B相为0.2%甲酸溶液，梯度洗脱程序：0～10 min（5%～10%B）；10～20 min（10%～12%B）；20～30 min（12%～13%B）；30～35 min（13%～14%B）；35～40 min（14%～16%B）；40～55 min（16%～18%B）；55～60 min（18%～20%B）；60～65 min（20%～22%B）；65～70 min（22%～30%B）；70～75 min（30%～40%B）；75～80 min（40%～60%B）；80～85 min（60%～75%B）；85～95 min（75%～75%B）。柱温设置为25℃、30℃、35℃。流速：0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min。检测波长278 nm。进样量：10 μl。
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①对照品储备液的制备：精密称取相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品5~10 mg，分别置10 ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，制备对照品储备液。②供试品溶液的制备：精密称取样品粉末1 g置锥形瓶中，加甲醇50 ml，称定重量，加热回流提取2 h，取出，称定，补足损失的量，滤过，回收溶剂，残渣加甲醇5 ml使溶解，微孔滤膜过滤，制得供试品溶液。
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精密量取混合对照品溶液10 μl注入液相色谱仪，测定对照品保留时间及峰面积，平行测定5次，计算相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷保留时间及峰面积RSD，保留时间RSD分别为0.6%、0.7%、0.4%、0.3%，峰面积RSD均为0.3%（图7、表2）。
图 7 对照品色谱图
表 2 对照品色谱峰相对保留时间
峰 名称 保留时间
（t/min）相对保留
时间精密度
RSD（%）峰1 相思子碱 18.058 1.00 0.6 峰2 刺桐碱 21.658 1.20 0.7 峰3 夏佛塔苷 42.865 2.37 0.4 峰4 异夏佛塔苷 47.433 2.63 0.3 -
取供试品JGC01-010按照2.3.2项下供试品溶液制备法制备供试品溶液，分别在0、2、4、12、24 h测定相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品保留时间，计算RSD，分别为0.09%、0.10%、0.05%、0.05%（表3）。
表 3 稳定性实验色谱峰保留时间（t/min）
时间（t/h） 相思子碱 刺桐碱 夏佛塔苷 异夏佛塔苷 0 16.892 20.783 42.283 46.967 2 16.892 20.783 42.283 46.967 4 16.900 20.808 42.308 47.000 8 16.867 20.758 42.258 46.950 12 16.858 20.742 42.242 46.942 24 16.875 20.775 42.300 47.000 RSD（%） 0.09 0.10 0.05 0.05 -
测定13批样品，记录样品中相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷等色谱峰的保留时间及峰面积，并计算其相对保留时间及偏差（表4 ）。根据出峰时间及样品化合物峰型特征分析，部分供试品中异夏佛塔苷未检测到或含量较低超出仪器检出范围，不具有共有峰特征。因此选择相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等3种化合物的色谱峰作为特征峰，相对保留时间为1.00、1.21、2.39，可控制偏差范围±5%。参考《中华人民共和国药典》（2020年版）通则指导原则的有关规定，拟定供试品色谱中应呈现相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷3种化合物的特征峰，并应与对照品色谱峰保留时间相对应（图8）。
表 4 样品特征峰相对保留时间（n=13）
样品 相思子碱峰 刺桐碱峰 夏佛塔苷峰 异夏佛塔苷峰 保留时间
（t/min）相对保
留时间保留时间
（t/min）相对保
留时间保留时间
（t/min）相对保
留时间保留时间
（t/min）相对保
留时间对照品 18.058 1.00 21.658 1.20 42.865 2.37 47.433 2.63 JGC-01-001 17.717 1.00 21.175 1.20 42.400 2.39 46.767 2.64 JGC-01-002 17.733 1.00 21.183 1.19 42.200 2.38 46.917 2.65 JGC-01-003 18.025 1.00 21.658 1.20 42.900 2.38 − − JGC-01-004 18.033 1.00 21.683 1.20 43.950 2.44 47.483 2.63 JGC-01-006 18.183 1.00 21.408 1.18 42.700 2.35 47.542 2.61 JGC-01-007 17.967 1.00 21.675 1.21 42.933 2.39 − − JGC-01-010 16.881 1.00 20.775 1.22 42.279 2.49 47.000 2.78 JGC-03-004 17.650 1.00 21.225 1.20 42.475 2.41 − − JGC-03-012 17.833 1.00 21.350 1.20 42.325 2.37 48.392 2.71 JGC-04-003 17.000 1.00 21.575 1.27 42.175 2.48 47.083 2.77 JGC-04-004 17.475 1.00 21.500 1.23 42.417 2.43 45.683 2.61 JGC-04-006 17.975 1.00 22.650 1.26 42.417 2.36 − − JGC-04-007 17.892 1.00 21.400 1.20 42.708 2.39 47.067 2.63 平均值 17.720 1.00 21.481 1.21 42.606 2.40 47.104 2.67 RSD（%） 2.1 0.0 1.9 2.1 1.1 1.7 1.4 2.3 注：“-”为样品中未检测到相关色谱峰。 
图 8 特征图谱
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分别采用Thermo、Agilent、Diamonsil色谱柱考察色谱柱的影响；柱温在20℃、25℃、30℃考察柱温的影响；流速为0.8、1.0、1.2 ml/min考察流速的影响。根据测定数据分析，色谱柱、柱温、流速均对特征峰相对保留时间具有一定的影响，其中流速及色谱柱型号对峰3、峰4影响较大，各色谱峰的影响RSD小于5.0%，属于可接受的范围（表5）。
表 5 不同色谱条件对相对保留时间的影响（n=3）
色谱条件 相对保留时间 峰1 峰2 峰3 峰4 色谱柱 Thermo 1.00 1.20 2.37 2.63 Agilent 1.00 1.22 2.54 2.93 Diamonsil 1.00 1.24 2.51 2.82 平均値 1.00 1.22 2.47 2.79 RSD（%） 0.00 1.30 3.00 4.40 柱温(℃) 25 1.00 1.20 2.34 2.60 30 1.00 1.20 2.37 2.63 35 1.00 1.19 2.34 2.64 平均値 1.00 1.20 2.35 2.62 RSD（%） 0.00 1.40 1.10 0.70 流速(ml/min) 0.8 1.00 1.20 2.37 2.63 1.0 1.00 1.20 2.53 2.85 1.2 1.00 1.19 2.66 3.08 平均値 1.00 1.20 2.52 2.85 RSD（%） 0.00 0.40 4.70 6.40 -
运用网络药理学的方法对中药成分进行研究，然后预测其药理活性作用测靶点、分析通路，再通过实验验证，探索中药的作用机制[21]，进而预测中药作用的物质基础，寻找中药质量标志物，能够较好地结合中药的药效建立质量控制标准[22]。通过网络药理学预测发现，鸡骨草主要成分相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等药理活性与STAT3、MMP2、AR、AKT1、SPC、LCK、ESR1、CTNNB1、PPARγ、NOS2、HIF1A等靶标有关，可能作用于松弛素信号通路、HIF-1信号通路、ErbB信号途径、PI3K-Akt信号通路、JAK-STAT 信号通路等多种信号通路。实验研究发现，相思子碱可以通过抑制NOS、VEGF的表达，促进IL-1β刺激的人软骨细胞C28/I2进行细胞增殖并抑制细胞凋亡，进而起到治疗骨性关节炎的作用[23]。刺桐碱可以通过PI3K-Akt信号通路调控PPARγ起到抗炎的作用[24]。夏佛塔苷及异夏佛塔苷等能够通过调控PPARα及其下游蛋白，减少促炎性细胞因子生成，产生抗炎、抗氧化等作用，具有潜在的非酒精性脂肪肝治疗作用[25]。异夏佛塔苷可有效抑制脂多糖诱导的iNOS生成和促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β和COX2）的表达，能够显著降低脂多糖诱导的HIF1A、HK2和PFKFB3蛋白的表达[26]。文献报道的实验研究结果进一步验证了网络药理学的预测结果。因此，网络药理学在基于药理活性的鸡骨草质量标志物预测上具有一定价值，能够为鸡骨草质量标准的建立提供药效预测及研究基础。
鸡骨草药用为全草，但市场上鸡骨草药材叶损失严重，这是否会造成药材成分及其含量的变化进而影响药材质量？该实验分别取鸡骨草（JGC-003-012）供试品根、茎、叶等不同部位粉末1 g，参照2.3.2项下制备供试品溶液，测定药材不同部位相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等化合物的含量，记录保留时间及峰面积。计算含量发现根、茎、叶等不同部位所含3种成分含量分别为根：0.12%、0.08%、未检出；茎：0.02%、0.01%、0.06%；叶：未检出、0.01%、0.20%，相思子碱及刺桐碱主要存在于根、茎中，夏佛塔苷主要存在于叶和茎中，与文献报道[27]一致。因此保证根、茎、叶的相对存量是保障鸡骨草药材质量的重要因素。另外该实验同时测定了13批次鸡骨草药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物的量，对鸡骨草质量标准的研究具有一定意义。
鸡骨草除药用外，岭南多地常用于食疗保健中。由于相思子属鸡骨草、毛鸡骨草等基源相近、形态相似、民间及中医临床上常同功效应用，市场上常有毛鸡骨草等混淆或掺伪为鸡骨草药材，而现行版《中华人民共和国药典》（一部）2020年版及部分收载鸡骨草的中药标准等对鸡骨草质量的控制主要集中在性状和相思子碱的薄层鉴别上，而相思子碱在相思子属相思子、毛鸡骨草、美丽相思子等植物中均有发现，仅以此为指标化合物专属性不强。目前基于化学成分与药理活性的关联为依据制定中药质量仍然是中药质量标准研究的主要方向。本实验通过网络药理学与分子对接预测鸡骨草主要活性成分，筛选出药理活性较强的成分，并以此为基础，建立鸡骨草质量控制的HPLC特征图谱，最终选择相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等作为鸡骨草特征图谱的质量标志物。
Prediction of characteristic chromatogram for Abri Herba based on network pharmacology and molecular docking
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摘要:
目的 基于网络药理学与分子对接预测鸡骨草潜在质量标志物，并以此建立质量控制特征图谱。 方法 运用多种数据库通过网络药理学的方法构建“鸡骨草-成分-靶点-通路”网络关系结合分子对接，预测鸡骨草潜在的质量标志物，在此基础上采用高效液相色谱法建立鸡骨草特征图谱。 结果 通过网络药理学预测发现，鸡骨草中相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等成分与AKT1、STAT3、HIF1A、GRB2、MMP9等主要靶点蛋白关联密切，可作用HIF-1、PI3K-Akt、JAK-STAT 等信号通路，是鸡骨草潜在的质量标志物，以此为依据通过HPLC检测，根据保留时间建立鸡骨草特征图谱。 结论 通过网络药理学与分子对接预测结合HPLC检测，建立以相思子碱、刺桐碱及夏佛塔苷等成分为质量标志物的鸡骨草特征图谱，能够结合成分与药理活性控制鸡骨草的质量。 Abstract:Objective To predict the potential Q-markers of Abri Herba based on network pharmacology and molecular docking and establish a quality control characteristic. Methods The network relationship of “Abri Herba - component - target - pathway” was constructed by using a variety of databases and the method of network pharmacology. The potential Q-markers of Abri Herba were predicted and then the characteristic Chromatogram of Abri Herba was established by high performance liquid chromatography Results Through the network pharmacological prediction, it was found that the components of abrine hypaphorine, schaftoside in Abri Herba were closely associated with the main targets, such as AKT1, STAT3, HIF1A, GRB2, MMP9, which could act on HIF-1, PI3K-Akt, JAK-STAT and other signaling pathways and have good pharmacological activities to be potential Q-markers of Abri Herba. Then HPLC was used to establish the characteristic according to retention time. Conclusion Through network pharmacology and molecular dock-prediction combined with HPLC detection, the characteristic chromatogram was established with the components of abrine hypaphorine, schaftoside as Q-markers, which could control the quality of Abri Herba by combining the components and pharmacological activities. -
Key words:
- Abri Herba /
- network pharmacology /
- Q-markers /
- characteristic chromatogram
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肝纤维化是由肝炎病毒、酒精摄入过量或代谢紊乱引起的急性/慢性肝损伤的一种病理伤口愈合反应，也是慢性肝病发病率和病死率高的主要原因[1, 2]。肝纤维化的特点是I 型胶原和纤维连接蛋白等细胞外基质（ECM）成分的过多聚集，形成纤维疤痕扭曲肝脏结构，最终造成肝脏器官功能损伤[2]。研究显示，肝星状细胞（HSCs）的过度激活是肝纤维化进程中的关键环节，也是肝纤维化防治研究的重要靶点[3, 4]。
全反式维甲酸（ATRA）是维生素A主要的生物活性形式，已是急性早幼粒细胞白血病的标准治疗方案[5]。近期研究证实，ATRA可逆转HSCs的活化，并对肝纤维化具有抑制作用，但其具体机制尚未完全阐明[6]。本文拟在细胞水平探索ATRA抑制HSCs增殖及活化的作用和机制，为ATRA的临床应用提供理论和实验基础。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂
HSCs系LX-2细胞和培养基购自上海中乔新舟生物科技公司。胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司。血小板源性生长因子（PDGF-bb）、ATRA购自美国MedChemExpress公司。RNAiso试剂，逆转录和定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。CCK-8、活性氧（ROS）、还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）等检测试剂盒购自上海碧云天生物科技公司。抗α-SMA、Collagen I、NRF2和LC3的抗体购自武汉三鹰生物科技公司；抗HO-1、ATF4、Beclin 1和GAPDH的抗兔购自武汉博士德生物科技公司。辣根过氧化物酶及FITC标记的二抗购自美国thermo Fisher Scientific公司。
1.2 HSCs的培养和诱导
HSCs系LX-2细胞解冻后，在DMEM培养基（含2%FBS），37 ℃，5%CO2条件下生长，每2 d更换一次培养基，细胞融合度达到85%以上时传代培养。以含PDGF-bb（10 ng/ml）的DMEM培养基作为诱导培养基；ATRA以5 μmol/L的浓度刺激。
1.3 细胞生长活力的检测
细胞生长活力通过CCK-8法检测。以每孔2×103个细胞的密度将LX-2细胞接种于96孔培养板，培养过夜。分别在常规培养基（含10%FBS）和PDGF-bb诱导培养基中培养，并添加ATRA（5 μmol/L）刺激。培养目标时间后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，继续培养1 h，轻轻拍动培养板充分混匀后，在酶标仪上测定450 nm的吸光度（A），并绘制细胞生长活力曲线。
1.4 蛋白表达的荧光检测
以每孔5×104个细胞的密度将LX-2细胞接种于24孔培养板（预置细胞爬片），培养过夜后以不同方式刺激培养48 h，以4%的多聚甲醛固定，并经Triton X-100（0.1%）透化10 min，随后经1%的BSA封闭1 h，加入一抗，4 ℃过夜孵育后，加入FITC标记的二抗，避光孵育1 h。加入DAPI染色1 min，以PBS-T缓冲液清洗后，用抗淬灭封片剂封片，于荧光倒置显微镜下观察并拍照。
1.5 蛋白表达的免疫印迹检测
以每孔2×105个细胞的密度将LX-2细胞接种于12孔培养板，培养过夜后以不同方式刺激培养48 h，利用RIPA试剂提取总蛋白。以20 μg总蛋白作为上样量，经SDS凝胶电泳分离后，转至甲醇预处理的PVDF膜。以5%脱脂牛奶常温封闭1 h，加入一抗，4 ℃过夜孵育后，加入辣根过氧化物酶标记二抗，常温孵育1 h。用TBS-T缓冲液清洗3次，经显色后在凝胶成像仪上观察并拍照记录。
1.6 基因表达的实时定量PCR检测
以每孔2×105个细胞的密度将LX-2细胞接种于12孔培养板，培养过夜后以不同方式刺激培养48 h，利用trizol试剂提取总RNA。以200 ng总RNA为模板，逆转录成互补DNA（cDNA），反应程序为37 ℃，10 min，85 ℃，5 s。以稀释后的cDNA为模板进行实时定量PCR反应，反应程序为95 ℃，15 s；56 ℃，20 s；72 ℃，20 s，共40个循环。以GAPDH基因作为内参，每个样品重复3次，经2−△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。
1.7 细胞氧化应激的检测
细胞内ROS利用DCFH-DA荧光探针检测。以每孔1×104个细胞的密度将LX-2细胞接种于24孔培养板，培养过夜后以不同方式刺激培养48 h。去除培养液并加入100 μl含DCFH-DA（10 μmol/L）的无血清培养基，继续孵育20 min。用无血清培养基清洗3次后，在荧光显微镜下观察并拍照记录。
以每孔1×105个细胞的密度将LX-2细胞接种于6孔培养板，培养过夜后以不同方式刺激培养48 h。细胞内GSH和MDA水平根据试剂盒说明书进行检测，计算总蛋白中GSH和MDA的含量（nmol/mg）。
1.8 细胞自噬水平的检测
双荧光自噬流通过转染自噬双标腺病毒（pAd-mRFP-GFP-LC3）后检测。以每孔1×104个细胞的密度将LX-2细胞接种于24孔培养板，培养过夜。将腺病毒转染细胞后，以不同方式刺激培养48 h，即在荧光显微镜下分别观察红色及绿色荧光信号并拍照记录。自噬激活后，自噬体与溶酶体融合后绿色荧光发生淬灭，红色荧光增强。
1.9 统计学分析
所有数据均使用SPSS 26.0软件进行统计学分析，满足正态分布的计量数据以（
$ \bar x \pm s $ ）表示。组间差异以独立样本t检验比较分析，以P<0.05说明差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 ATRA对HSCs生长活力的影响
如图1A所示，常规培养条件下，5 μmol/L的ATRA处理48 h和72 h后的HSCs生长活力为对照组的（84.5±4.8）%和（86.7±3.0）%，具有一定的抑制作用。如图1B所示，在PDGF-bb诱导条件下，5 μmol/L的ATRA处理48 h和72 h后的HSCs生长活力为对照组的（52.4±3.0）%和（57.6±2.0）%，具有显著的抑制作用（P<0.01）。
图 1 ATRA对HSCs生长活力的影响（n=5）A. 常规条件下ATRA对HSCs生长活力的影响；B. PDGF-bb刺激条件下ATRA对HSCs生长活力的影响*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较。2.2 ATRA对PDGF-bb诱导HSCs活化的影响
免疫荧光结果如图2A所示，与对照组相比，PDGF-bb刺激的HSCs中α-SMA的绿色荧光信号较强，而ATRA处理后，α-SMA荧光信号显著降低。蛋白质免疫印迹的结果如图2B所示，与对照组相比，PDGF-bb刺激的HSCs中α-SMA和Collagen I的蛋白表达明显增加，而ATRA处理后，α-SMA和Collagen I蛋白表达明显降低。
图 2 ATRA对PDGF-bb诱导HSCs活化的影响A. HSCs中α-SMA（绿色）的免疫荧光检测；B. HSCs中α-SMA和Collagen I的免疫印迹检测注A图中细胞核以DAPI（蓝色）标记，标尺为100 μm，B图中GAPDH为内参。2.3 ATRA对HSCs氧化应激的影响
ROS的检测如图3A所示，PDGF-bb刺激后HSCs中的荧光强度明显强于对照组，而ATRA处理后荧光强度明显降低，提示ATRA抑制HSCs中ROS的生成。如图3B所示，PDGF-bb刺激后，HSCs中GSH的含量明显低于对照组（18.82±1.83 nmol/mg vs. 46.45±1.69 nmol/mg），MDA的含量则明显高于对照组（13.46±1.43 nmol/mg vs. 5.45±0.47 nmol/mg）；ATRA处理后GSH的含量明显升高（32.60±2.23）nmol/mg，MDA的含量则明显降低（9.56±0.34）nmol/mg。
图 3 ATRA对HSCs氧化应激的影响A. HSCs中ROS的DCFH-DA荧光探针检测（标尺为20 μm）；B. HSCs中GSH和MDA含量的检测（n=3）**P<0.01，与Mock组比较；##P<0.01，与PDGF-bb组比较。2.4 ATRA对HSCs中抗氧化基因表达的影响
实时定量PCR的检测结果如图4A所示，ATRA处理后HSCs中抗氧化基因NRF2、HO-1和ATF4的表达明显增加（P<0.01），分别是PDGF-bb组的（2.53±0.15）倍、（3.34±0.12）倍和（2.58±0.10）倍。蛋白质免疫印迹的结果如图4B所示，NRF2、HO-1和ATF4的蛋白表达在ATRA处理后也明显增加。
图 4 ATRA对HSCs中抗氧化基因表达的影响A. HSCs中抗氧化基因的实时定量PCR检测（n=3）；B. HSCs中抗氧化蛋白的免疫印迹检测**P<0.01，与PDGF-bb组比较。GAPDH为内参。2.5 ATRA对HSCs自噬活力的影响
蛋白质免疫印迹的结果如图5A所示，ATRA处理后HSCs中自噬标志蛋白Beclin 1的表达和LC3 II/I均明显减少。双荧光自噬流的检测结果如图5B所示，ATRA处理后HSCs中红色荧光信号显著降低，绿色荧光信号明显增强，自噬流信号显著降低。
图 5 ATRA对HSCs自噬活力的影响A. HSCs中Beclin 1和LC3的蛋白质免疫印迹检测（GAPDH为内参）；B. HSCs中双荧光自噬流的检测（标尺为20 μm）3. 讨论
目前，还没有特定的抗纤维化疗法来预防或逆转肝纤维化，现有的治疗方案旨在去除潜在的致病因子或紊乱，但也证明了肝纤维化的潜在可逆性[7]。研究证实，HSCs是主要的肝胶原生成细胞，并被认为是肝纤维化的主要效应细胞[8]。在健康肝脏中，HSCs位于窦周间隙，处于静止状态；当受到损伤或刺激时，HSCs会对各种促纤维化信号做出反应，如来自受损肝细胞的产物、来自Kupffer细胞的生长因子和细胞因子、重构的ECM以及肝外信号等[9]。HSCs的活化涉及多个进程，包括细胞死亡、衰老和恢复静止状态等。在此过程中，HSCs会失去其特有的细胞质脂滴，并转分化为肌成纤维样细胞，并合成ECM成分（如胶原纤维I型和III型），增殖、收缩和迁移等能力增强，并具有促炎作用。HSCs活化的作用机制和干预是肝纤维化防治研究的重要内容。
静息状态HSCs中富含的脂滴，其主要成分是甘油三酯和维生素A。脂滴脱落被认为是HSCs活化的形态学标志，但其生物学作用仍被广泛研究[10-12]，作为维生素A的主要代谢产物，ATRA被发现广泛参与肝纤维化以及肝癌等的生物学过程[13, 14]。研究发现，ATRA能通过抑制硫氧还蛋白互用蛋白的表达，改善TGF-β诱导的HSCs的活化和维生素A缺乏诱导的肝纤维化[6]。目前的研究证实，ATRA 通过与 RAR（α、β、γ）或 PPARβ/δ 起作用，但这两组受体的生物效应在某些进程中却完全相反[15]，提示ATRA抗肝纤维化的作用机制未完全阐明。还有研究发现，纤维化药物对HSCs的激活最终会导致这些细胞的衰老，尽管有助于纤维化的逆转，但也可能会导致肝癌的发生[16]。因此，ATRA作为抗肝纤维化潜在药物的应用潜能仍需深入探索和验证。
研究证实，氧化应激与肝纤维化之间存在密切关系，当肝脏受到氧自由基的攻击时，机体抗氧化防御系统的平衡就会被打破，从而导致氧化应激[17, 18]。MDA是脂质过氧化的主要代谢产物，过量时会严重破坏细胞膜结构，也被认为是肝脏中自由基的间接指标[19]。GSH是哺乳动物细胞中最主要的自由基清除剂，广泛分布于包括肝脏在内的多个器官。研究发现，GSH可保护肝细胞免受各种自由基的侵害，包括ROS、脂质氢过氧化物、异生物毒物和重金属[20]。因此，调节MDA和GSH水平有助于控制氧化应激，最终可能有助于抑制肝纤维化。有研究报道，抑制氧化应激显著降低MDA水平，提高GSH水平，对CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化具有明显的保护作用[21]。本课题研究发现ATRA处理促进了HSCs中抗氧化基因的表达，造成细胞中GSH的增加和MDA的降低，减少细胞内ROS的水平，缓解了PDGF-bb诱导的HSCs氧化应激，研究结果提示，以氧化应激为靶点可能是肝纤维化防治的潜在策略。
自噬是真核细胞消除一次性或有潜在危险的细胞质物质的一种新陈代谢过程，可以消除有缺陷的蛋白质和细胞器、细胞内的病原体，防止异常蛋白质的积累，在许多疾病的病理过程中发挥着积极作用[22]。越来越多的证据表明，肝细胞和非实质性细胞（HSCs、Kupffer 细胞等）的自噬反应对肝脏的生理功能至关重要[23]。近年来，HSCs自噬成为肝纤维化研究领域的热点，其调控机制日益受到关注。研究显示，自噬水平的增加可加速HSCs中脂滴的降解，为HSCs的激活提供能量支持[24, 25]。降低HSCs自噬活性显著抑制其活化，降低小鼠的肝纤维化程度[26]。本课题的结果证实，ATRA能抵抗PDGF-bb诱导的HSCs自噬水平的增加，这可能是ATRA抑制HSCs活化的分子机制之一。
HSCs是目前研究药物代谢和毒理的重要工具，也是研究肝纤维化的绝佳模型[27]。HSCs具有高度的可塑性，在有害刺激下会改变其表型和代谢，并产生大量ECM成分来替代受伤细胞，生成纤维化疤痕[28]。在各种HSCs细胞系中，LX-2是目前广泛使用的细胞类型[29]。研究发现，LX-2细胞会根据培养基中FBS的浓度改变其代谢，从而诱导基因的差异表达。在低浓度FBS下，LX-2细胞呈静止样表型；在高浓度 FBS下，细胞呈肌成纤维细胞样表型，产生ECM成分[30]。本课题研究发现，PDGF-bb可诱导LX-2细胞向肌成纤维细胞样表型分化，表现为高增殖水平，且高表达α-SMA和Collagen I，而ATRA的处理显著降低细胞增殖能力并抑制α-SMA和Collagen I的表达，表明ATRA具有抵抗HSCs活化的潜在功能。
本课题在细胞水平探索了ATRA对HSCs激活的作用和潜在机制。ATRA促进抗氧化基因的表达，降低PDGF-bb诱导的HSCs氧化应激及自噬活力，抑制了HSCs的激活。研究结果证实了ATRA对肝纤维化防治的潜在应用。需要注意的是，自噬活性的激活存在“双刃剑”作用，ATRA对HSCs自噬活性的调节还需要进行剂量和分子机制等方面的深入研究。
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表 1 成分-靶标分子对接结果
靶标 PDB ID 活性成分 结合能(kcal/mol) AKT1 4GAH 相思子碱 −4.67 刺桐碱 −4.34 夏佛塔苷 −2.98 STAT3 5AX3 相思子碱 −4.72 刺桐碱 −4.56 夏佛塔苷 −2.82 HIF1A 3OUI 相思子碱 −4.02 刺桐碱 −3.93 夏佛塔苷 −2.36 大豆皂苷Bb −0.27 GRB2 3IMD 相思子碱 −5.0 刺桐碱 −5.66 夏佛塔苷 −4.68 大豆皂苷Bb −2.46 MMP2 8H78 相思子碱 −7.21 刺桐碱 −7.02 夏佛塔苷 −5.83 大豆皂苷Bb −4.28 
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表 2 对照品色谱峰相对保留时间
峰 名称 保留时间
（t/min）相对保留
时间精密度
RSD（%）峰1 相思子碱 18.058 1.00 0.6 峰2 刺桐碱 21.658 1.20 0.7 峰3 夏佛塔苷 42.865 2.37 0.4 峰4 异夏佛塔苷 47.433 2.63 0.3
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表 3 稳定性实验色谱峰保留时间（t/min）
时间（t/h） 相思子碱 刺桐碱 夏佛塔苷 异夏佛塔苷 0 16.892 20.783 42.283 46.967 2 16.892 20.783 42.283 46.967 4 16.900 20.808 42.308 47.000 8 16.867 20.758 42.258 46.950 12 16.858 20.742 42.242 46.942 24 16.875 20.775 42.300 47.000 RSD（%） 0.09 0.10 0.05 0.05
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表 4 样品特征峰相对保留时间（n=13）
样品 相思子碱峰 刺桐碱峰 夏佛塔苷峰 异夏佛塔苷峰 保留时间
（t/min）相对保
留时间保留时间
（t/min）相对保
留时间保留时间
（t/min）相对保
留时间保留时间
（t/min）相对保
留时间对照品 18.058 1.00 21.658 1.20 42.865 2.37 47.433 2.63 JGC-01-001 17.717 1.00 21.175 1.20 42.400 2.39 46.767 2.64 JGC-01-002 17.733 1.00 21.183 1.19 42.200 2.38 46.917 2.65 JGC-01-003 18.025 1.00 21.658 1.20 42.900 2.38 − − JGC-01-004 18.033 1.00 21.683 1.20 43.950 2.44 47.483 2.63 JGC-01-006 18.183 1.00 21.408 1.18 42.700 2.35 47.542 2.61 JGC-01-007 17.967 1.00 21.675 1.21 42.933 2.39 − − JGC-01-010 16.881 1.00 20.775 1.22 42.279 2.49 47.000 2.78 JGC-03-004 17.650 1.00 21.225 1.20 42.475 2.41 − − JGC-03-012 17.833 1.00 21.350 1.20 42.325 2.37 48.392 2.71 JGC-04-003 17.000 1.00 21.575 1.27 42.175 2.48 47.083 2.77 JGC-04-004 17.475 1.00 21.500 1.23 42.417 2.43 45.683 2.61 JGC-04-006 17.975 1.00 22.650 1.26 42.417 2.36 − − JGC-04-007 17.892 1.00 21.400 1.20 42.708 2.39 47.067 2.63 平均值 17.720 1.00 21.481 1.21 42.606 2.40 47.104 2.67 RSD（%） 2.1 0.0 1.9 2.1 1.1 1.7 1.4 2.3 注：“-”为样品中未检测到相关色谱峰。
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表 5 不同色谱条件对相对保留时间的影响（n=3）
色谱条件 相对保留时间 峰1 峰2 峰3 峰4 色谱柱 Thermo 1.00 1.20 2.37 2.63 Agilent 1.00 1.22 2.54 2.93 Diamonsil 1.00 1.24 2.51 2.82 平均値 1.00 1.22 2.47 2.79 RSD（%） 0.00 1.30 3.00 4.40 柱温(℃) 25 1.00 1.20 2.34 2.60 30 1.00 1.20 2.37 2.63 35 1.00 1.19 2.34 2.64 平均値 1.00 1.20 2.35 2.62 RSD（%） 0.00 1.40 1.10 0.70 流速(ml/min) 0.8 1.00 1.20 2.37 2.63 1.0 1.00 1.20 2.53 2.85 1.2 1.00 1.19 2.66 3.08 平均値 1.00 1.20 2.52 2.85 RSD（%） 0.00 0.40 4.70 6.40
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