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苦参碱（Matrine）是传统中药苦参的主要活性成分[1]，是从苦参根中提取的生物碱类化合物，属于喹诺嗪类生物碱，其化学结构见图1。苦参碱具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤、抗病毒、抗纤维化、抗糖尿病、抗心衰、抗血小板和抗动脉粥样硬化等[2-4]。苦参碱存在着生物利用度低、化学稳定性差、生物毒性较高等一系列问题[5-6]。人们通过对苦参碱D环C-13、C-14和C-15位点的修饰，以及使D环的放开或融合等方法[7-9]，获得了一系列活性更高、毒性更低的苦参碱衍生物。如硫代苦参碱[10]，13-羟基乙胺苦参碱[11]，13-酰胺基取代苦参碱[12]等。目前，对于苦参碱衍生物的研究多聚焦于抗肿瘤的活性，充分了解并探索其抗炎活性及机制，更有助于人们开发苦参碱衍生物在炎症性疾病中的应用。本文将就苦参碱及衍生物的抗炎作用及其机制进行综述，为药物研发甚至临床应用提供理论支持。
图 1 苦参碱的化学结构
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炎症是一种高度受控的过程，它被多种信号通路调控以维持机体的稳态[13]。苦参碱及其衍生物可能通过调节多种细胞信号通路或分子靶标在多系统炎症性疾病中发挥治疗作用（图2）。
图 2 苦参碱及其衍生物在多系统中的抗炎作用及机制
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苦参碱可以通过抑制髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG35-55诱导的自身免疫性脑脊髓灰质炎（EAE）小鼠中枢神经中Wnt 家族成员 3A（Wnt3a）和β-连环蛋白（β-catenin）活化，激活糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），降低Wnt3a/β-catenin通路中的两个靶基因G1/S-特异性周期蛋白-D1（cyclin-D1）和Axis抑制蛋白2（Axin2）的表达，促进少突胶质细胞（OL）的成熟和髓鞘修复功能，从而改善多发性硬化症（MS）动物模型的神经功能缺损[14]。苦参碱也可以通过抑制Ⅰ型星形胶质细胞的增殖与浸润，有效减轻中枢神经系统炎症促进神经再生，显著改善EAE 的临床评分[15]。
在阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中，科研人员发现苦参碱可以降低海马组织中小胶质细胞的活性氧（ROS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）水平，显著改善AD模型小鼠的学习和记忆功能[16]。
在脊髓损伤（SCI）的体外实验中，有研究发现苦参碱能够上调miR-9的表达来抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）和核因子κB（NF-κB）通路，并抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的释放，保护大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC 12）免受脂多糖（LPS）诱导的炎症损伤[17]。
此外，苦参碱还能够通过增加视神经中神经丝蛋白（NFs）的表达，降低Iba1细胞（巨噬细胞/小胶质细胞）数量，上调B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）/BCL2相关X蛋白（Bax）的比率，从而减少炎性浸润和脱髓鞘和视网膜神经节细胞凋亡[18]。
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有研究表明，苦参碱可以通过抑制急性肺损伤模型中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、IL-6和IL-8的表达，改善造模小鼠的肺组织损伤程度[19]。
在卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘小鼠模型中，人们发现苦参碱可以通过抑制嗜酸性粒细胞趋化因子和Th2细胞因子的产生，显著降低哮喘小鼠的嗜酸性粒细胞浸润、减轻气道高反应性和气道炎症[20]。在过敏性哮喘小鼠模型和TNF-α诱导的人气管上皮细胞实验中，苦参碱可以减少IL-4、IL-6、IL-13和粘附分子的表达，抑制模型小鼠上皮细胞中的细胞因子信号传导抑制因子3（SOCS3）表达，改善OVA诱导引发的气道高反应性、炎症细胞浸润、杯状细胞分化和黏液产生，减少气管上皮细胞中促炎细胞因子的产生，达到缓解哮喘症状的效果[21]。
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苦参碱可以抑制过氧化物酶增殖物激活受体-α（PPAR-α）信号通路，增加肠道巴氏杆菌（Barnesiella intestinihominis）的丰度，降低甘氏幽门螺杆菌（Helicobacter ganmani）的丰度[22]。在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中，苦参碱可以显著抑制炎性细胞因子水平，改善肠道屏障的完整性。
苦参碱衍生物能通过抑制MCP-1的产生和活性，减少炎症性Gr1hi单核细胞在肝脏中的浸润，从而明显减轻四氯化碳（CCl4）诱导的急性肝损伤和肝纤维化[23]。
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在胶原诱导的关节炎（CIA）小鼠模型中，人们观察到苦参碱衍生物MASM通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB通路抑制炎症介质表达，诱导成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）的凋亡来减轻CIA小鼠的关节炎严重程度，降低了CIA小鼠的炎症和关节破坏程度[24]。
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动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，与炎症反应以及血管平滑肌细胞不受控制的增殖和过度凋亡有关。研究发现，苦参碱通过抑制NF-κB通路，降低氧化低密度脂蛋白（oxLDL）诱导的动脉粥样硬化模型中人主动脉血管平滑肌细胞的增殖和凋亡，表现出抗炎作用[25]。
在缺氧性肺动脉高压（HPAH）模型中，炎性细胞因子可浸润肺动脉血管，使肺动脉平滑肌细胞异常增殖，导致肺血管重构。人们发现苦参碱可降低大鼠α平滑肌肌动蛋白和肺动脉介质中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，降低TNF-α和IL-1β水平，将细胞周期延缓在S期，并降低p50、p65、PCNA、Bcl-2的表达，逆转缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖和凋亡的失衡，降低大鼠右心室收缩压和平均肺动脉压，改善缺氧诱导的肺血管重塑（PVR）[26]。
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苦参碱可以提高小鼠调节性T细胞（Treg）细胞比例，降低CD 4+/CD 8+比例，减轻移植心脏的炎性细胞浸润，延长心脏移植小鼠的存活时间。更重要的是，苦参碱可以下调NF-κB通路，上调ERK 1/2信号通路，抑制小鼠树突状细胞（DCs）成熟，减少同种异体心脏的氧化损伤和凋亡[27]。
研究发现，在特应性皮炎（AD）小鼠模型和TNF-α/IFN-γ处理的人表皮角质形成细胞（HaCaT）模型中，苦参碱可以减少T淋巴细胞和肥大细胞浸润，抑制CD4+ T细胞分化，调节Th1/Th2炎症反应，抑制Hsp90/NF-κB信号轴来抑制TNF-α/IFN-γ处理的HaCaT细胞炎性因子分泌，从而减轻AD的症状[28]。
无乳链球菌（S. agalactiae）是牛乳腺炎的主要致病菌，在其诱导的乳腺炎体外模型中，可导致牛乳腺上皮细胞 （BMEC）细胞凋亡，研究发现，苦参碱可以抑制NF-κB和MAPK信号通路，显著下调了IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎细胞因子的产生并预防BMEC细胞损伤[29]。
在金黄色葡萄球菌脂磷壁酸（LTA）诱导的小鼠子宫内膜炎模型中，苦参碱可以抑制Toll样受体2（TLR2）的表达及其下游NF-κB的活化，降低TNF-α和IL-1β的表达，发挥对子宫内膜细胞的保护作用[30]。在临床试验中，应用苦参碱治疗慢性盆腔炎，苦参碱组患者的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著低于对照组，苦参碱组疗效明显优于对照组[31]。
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在肽聚糖、脂蛋白等因子的刺激作用下，巨噬细胞发生极化并表现出两种主要表型M1和M2。其中，M1型巨噬细胞产生炎性细胞因子，M2型巨噬细胞则参与炎症的消退和修复[3]。研究表明，苦参碱可以抑制M1巨噬细胞侵袭与浸润，促进M1型巨噬细胞向M2型转化，降低M1/M2的比例，发挥抗炎作用[32]。
中性粒细胞是炎症反应的重要调节剂，它能够表达和产生多种细胞因子参与炎症过程，如IL-1β、IL-6和IL-17等。这些细胞因子在疾病的炎症反应中发挥重要作用。有研究表明，在香烟烟雾暴露诱导的肺炎小鼠模型中，苦参碱能够显著降低其支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜中性粒细胞数量，减轻肺部炎症和损伤。进一步研究发现，苦参碱不是参与抑制中性粒细胞相关的细胞因子及趋化因子，而是通过诱导中性粒细胞凋亡来起到调节炎症反应的作用[33]。此外，苦参碱也可以通过抑制细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1），来减少中性粒细胞与病变组织的黏附改善炎症反应[34]。
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苦参碱及衍生物可以抑制包括NF-κB、JAK2/STAT3、MKK/p38 MAPK信号通路在内的多种炎症信号通路的激活，从而减少炎症因子的分泌，以起到抗炎的效果，这也是苦参碱及衍生物发挥抗炎作用的最主要机制。其对各通路的影响汇总于（图3）并阐述如下。
图 3 苦参碱及其衍生物抗炎相关通路示意图
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一氧化氮（NO）是人体内重要的调节分子，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）是产生NO的上游调节因子。多种炎症刺激可触发iNOS产生NO，并引发炎症反应。有研究表明，在LPS刺激的RAW 264.7细胞中，氧化苦参碱可以显著抑制iNOS的过表达，从而减少NO水平[35]。
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NF-κB通路在许多生物过程的调节中起着至关重要的作用，是一种典型的促炎症信号通路，与炎症因子TNF和IL的分泌密切相关[27]。苦参碱可以通过刺激上调钙敏感受体的表达，来抑制NF-κB信号通路的激活，从而保护肠脏器并恢复肠屏障的完整性[36]。
氧化苦参碱能够抑制NF-κB和MAPKs信号通路，显著减轻LPS诱导的乳腺损伤[37]；苦参碱可以上调miRNA-9的表达，通过抑制JNK和NF-κB通路，从而改善LPS诱导的PC 12细胞炎症损伤，减轻小鼠脊髓损伤的继发性损伤[17]。苦参碱通过NF-κB通路减弱HAVSMCs中的异常生物反应，减少oxLDL诱导的血管平滑肌细胞异常增殖和过度凋亡，表现出抗炎作用[25]。苦参碱衍生物MASM可显著减轻LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞中NF-κB通路的激活，减少了TNF-α、IL-6和NO/iNOS的释放[38]。苦参碱也可以通过抑制NF-κB和MAPK途径的活化，抑制LPS刺激的人肺上皮A549细胞中环氧合酶-2（COX-2）和ICAM-1的转录和表达[19]。
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JAK 2/STAT 3通路的异常激活与一些炎性疾病的进展密切相关，包括关节炎、肝炎、肾炎和溃疡性结肠炎等。苦参碱可阻断JAK 2/STAT 3信号通路，抑制DSS诱导的肠上皮细胞促炎因子水平、髓过氧化物酶（MPO）活性、NO产生和细胞凋亡[39]。苦参碱能够抑制脓毒症诱导的沉默信息调节因子1（SIRT-1）下调和NF-κB p65亚基和p53的去乙酰化，减少肺中M1型巨噬细胞的浸润数量，增加M2型巨噬细胞浸润，减轻脓毒症诱导的肺损伤 [32]。
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P38 MAPK信号通路在许多细胞类型中诱导炎症反应。p38 MAPK的激活依赖于其上游激酶MKK 3和MKK 6的磷酸化。研究发现ox-LDL暴露后显著促进MKK 3，MKK 6和p38的磷酸化，激活p38 MAPK炎症信号通路。而苦参碱能够通过抑制MKKs/p38 MAPK信号通路来减轻ox-LDL诱导的炎症，减少ox-LDL诱导的THP-1细胞ROS产生，发挥抗炎作用[3]。苦参碱能够抑制无乳链球菌诱导的BMEC细胞NF-κB、IκBα、p38和ERK磷酸化水平升高，抑制IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA，减少无乳链球菌感染引起的BMEC损伤[29]。
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TLR4位于多种促炎细胞表面，是炎症反应中的主要受体。LPS激活免疫细胞中的TLR4启动信号级联，触发NF-κB通路的激活，从而导致后续一系列细胞因子和炎症介质的产生。研究发现，氧化苦参碱可以通过抑制TLR4的表达而减少NF-κB的活化，下调TLR4/NF-κB通路，抑制LPS刺激诱导的炎症反应[35]。炎症介质高迁移率族蛋白1（HMGB 1）是一种非组蛋白DNA结合蛋白，具有多种生物学效应，在炎症过程中，HMGB1可以通过结合TLR4，从而激活NF-κB信号通路，促进促炎细胞因子的转录。自身免疫性脑脊髓炎的发生发展便与这一通路的激活密切相关，有研究发现，苦参碱可抑制HMGB 1/TLR4/NF-κB信号传导，减少炎症因子的产生，抑制炎性细胞浸润，从而减轻脑脊髓炎模型小鼠的炎性损伤[40]。
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热休克蛋白60（HSP 60）于细胞外释放结合TLR4，可以刺激神经元细胞加重炎症反应。苦参碱可以通过抑制HSP 60/TLR4/MyD 88信号传导通路，抑制LPS诱导的小胶质细胞活化，发挥神经保护和抗炎作用[41]。苦参碱可以抑制炎性细胞因子-胸腺活化调节趋化因子TARC/CCL17和IL-6分泌，改善AD小鼠的炎症反应；苦参碱还可以通过抑制 Hsp90/NF-κB 信号轴来调节 Th1/Th2 炎症反应，从而缓解特应性皮炎[28]。
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苦参碱是从传统中药中提取出来的一种天然成分，具有相当大的药用价值。目前在炎症相关疾病中研究较为深入的苦参碱类生物碱主要包括苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱3种。三者之中，苦参碱在多系统多器官的炎症性疾病中都有广泛研究；氧化苦参碱在支气管哮喘[42]、溃疡性结肠炎[43]的动物模型中表现出了一定的治疗效果；槐果碱则主要在类风湿性关节炎[44]、脓毒症[45]的动物模型中表现出了疗效。考虑到成药性，苦参碱的药理活性低、体内药效维持时间短，其临床应用局限很大，仅能偶尔作为辅助药物使用。因此，研究人员对苦参碱进行了结构修饰，提高了其药理活性，改善了其药代动力学特点，苦参碱衍生物在动物实验中表现出了明确的有效性和安全性。例如，苦参碱衍生物MASM已被证实在小鼠关节炎[24]和脓毒症等模型[38]中表现出较好的治疗效果。在实际临床工作中，对于严重感染引发的急危重症脓毒症，患者的致残致死率极高，给临床工作带来极大困难，如果联合应用安全有效的苦参碱衍生物可能会取得很好的疗效，苦参碱衍生物的临床应用前景值得期待。
与此同时，目前对于苦参碱及其衍生物在抗炎机制研究还不够深入，目前大部分研究还是集中在其抑制炎症相关通路（如NO、NF-κB、MAPK等）以及减少炎症因子分泌（IL-1β、IL-6、TNF-α等）的探讨上，缺乏对其特异性靶点的探索。此外，目前合成苦参碱衍生物通常需要经过多步合成反应，制备工艺还相对复杂，且有些合成产物的稳定性差，易被氧化或降解，距离产业化和临床应用还有较长的一段路要走。综上所述，苦参碱及其衍生物在炎症相关疾病中的应用是一个富有前景的研究方向，仍有许多极富价值的课题有待科研人员去探索和解决。
Research progress on anti-inflammatory effect and mechanism of matrine and its derivatives
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摘要: 苦参碱是从中药植物苦参中分离提取的一种生物碱化合物，具有抗肿瘤、抗炎和抗病毒等作用，由于体内活性低、疗效时间短、毒副作用大等因素，其临床应用受到限制。为解决这一问题，药物专家对苦参碱的结构进行修饰获得其衍生物，以改善其缺点。目前，对苦参碱及衍生物抗肿瘤的研究比较多，在炎症性相关疾病中的研究还有待进一步加强。本文综述了苦参碱及衍生物在改善炎症性疾病中的作用及机制的研究进展，为苦参碱类药物研发提供线索。Abstract: Matrine is an alkaloid compound isolated and extracted from the traditional Chinese medicinal plant Sophora flavescens, which has anti-tumor, anti-inflammatory, and anti-viral effects. However, its clinical application has been limited due to its low in vivo activity, short duration of efficacy, and significant toxic side effects. In response to this challenge, pharmaceutical experts modified the structure of Matrine to obtain derivatives that addressed its limitations. Currently, research on the anti-tumor effects of Matrine and its derivatives is more prevalent, while research in inflammatory-related diseases still needs further strengthening.The progress on the role and mechanism of Matrine and its derivatives in inflammatory diseases were summarized in this paper, which offered valuable insights for the development of therapeutic agents based on Matrine.
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Key words:
- Matrine /
- derivatives /
- anti-inflammatory action /
- signal pathway
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高海拔地区最大的环境特征是大气压降低，从而使机体从空气中摄取的氧气含量减少。大脑是最耗氧的器官之一，对缺氧异常敏感，这种生理反应使机体处于缺氧环境中可能导致严重的脑损伤，如学习和记忆障碍[1-3]。近年来，治疗或改善低压低氧引起的中枢神经系统(CNS)损伤在高原医学领域引起了越来越多的关注[4-5]。有研究表明，急性暴露在缺氧环境中会加速活性氧(ROS)的积累，并在海马和皮层区域引发氧化应激，而氧化应激是高原学习记忆障碍的主要诱因[6-8]，随着进入高海拔地区学习、工作和旅游的人群日益增加，寻找能够改善高原缺氧记忆损伤的药物成为高原缺氧损伤防治研究的重点。
利舒康胶囊为国药准字（Z20025932）药品，其主要成分为红景天、手掌参、甘青青兰、烈香杜鹃四味藏药辅以黄柏、甘草，经提取加工而制成，具有抗缺氧、抗疲劳、增强体力等作用，主要用于防治各种急、慢性高原病。临床实践表明，该药还可用于慢性缺血缺氧症侯群、脑梗死伴眩晕症、血管性痴呆、非痴呆性血管性认知功能障碍等缺血缺氧性相关疾病的治疗，其作用机制可能与抑制脂质过氧化，清除自由基减轻氧化应激有关[9]。本研究利用大型低压氧舱模拟高原海拔7500 m缺氧72 h，从行为学、组织形态学和Keap1/Nrf2/HO-1信号通路等方面，探讨利舒康胶囊对高原学习记忆损伤的干预作用，以期进一步阐明其可能的作用机制，为扩大利舒康胶囊的药理作用和临床适用范围提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
本研究符合《实验动物福利伦理指南》的规定，并取得中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院伦理委员会的认可(审批编号：2021KYLL205)。实验动物选取体重质量为18～22 g的SPF级Balb/C雄性小鼠60只，购于兰州大学动物科，饲养于中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院动物实验科[合格证号：SCXK（京）2016-0006]。
1.2 主要材料和仪器
Anti-Keap1抗体、Anti-Nrf2抗体、Anti-HO-1抗体、Anti-Caspase-3抗体、Anti-Bcl-2抗体、Anti-Bax抗体（abcam公司）；β-Actin单克隆抗体（中杉金桥公司）；RM-200八臂迷宫分析测试系统(成都泰盟科技有限公司)；DYC-1703070大型低压氧舱(贵州风雷航空军械有限公司)；Tissuelyser-24多样品组织研磨机（上海净信实业发展有限公司）；免疫印迹分析仪( BIO-RAD公司)。
1.3 方法
1.3.1 八臂迷宫实验检测高原缺氧小鼠的学习记忆能力
海马体对空间工作记忆和参考记忆都是至关重要的，Xu等[10]研究发现八臂迷宫以食物作为诱饵，并在食物臂上贴上信号图，使实验动物可以在参考记忆任务中优先进入下一个选择的手臂的轨迹，在工作记忆任务中优先进入先前访问过的手臂的轨迹。Li和Du等[11-12]研究表明，八臂迷宫模型能很好地反映高原缺氧环境下小鼠的空间工作记忆情况和参考记忆情况。本实验将60只Balb/C雄性小鼠（体重18～22 g）进行适应性训练3 d（将小鼠置于迷宫中，八个臂均放入饵料自由进食5 min），适应性训练结束后，称重，将小鼠随机分为正常对照组、缺氧模型组、红景天胶囊组[400 mg/kg]，利舒康胶囊低剂量组[400 mg/kg]、中剂量组[600 mg/kg]、高剂量组[800 mg/kg]，每组10只，在之后的饲养中给予小鼠少许食物，第4 d开始正式实验，训练时，在1、3、4、7（食臂末端有信号图）食臂中放入饵料，将一只小鼠置于迷宫中央用塑料罩罩住，30 s后打开使其自由进食，训练总时间为5 min，5 min内吃完则系统自动停止，5 min内仍未吃完则实验终止。测试指标为：①工作记忆错误（WME），即在同一个训练中小鼠再次进入已经放置饵料的臂；②参考记忆错误（RME），即小鼠进入没有放置饵料的臂；③小鼠探究总时间（TT），即小鼠吃完所有饵料所花的时间；④错误总次数（TE）。小鼠训练成功的标准为：WME=0；RME≤1。每次训练结束后清理小鼠排泄物，立即用75%酒精擦拭八臂迷宫内部祛除气味干扰。连续训练30 d。
1.3.2 低压低氧实验
在小鼠训练30 d后，第31 d开始对所有实验小鼠进行灌胃给药，每天一次。正常对照组和缺氧模型组给予等体积的生理盐水，连续给药7 d（舱外给药4 d＋舱内给药3 d），期间所有小鼠正常在当地海拔进行八臂迷宫训练。在灌胃给药第4 d后停止八臂迷宫训练，除正常对照组外，将其余各组小鼠放入大型低压低氧动物实验舱内，借助实验舱可以模拟不同海拔高度。小鼠以极快的速度（10 m/s）从当地海拔上升到海拔7500 m高度。之后每天上午实验员进入实验舱内（舱内海拔由7500 m降至3500 m，下降速度为20 m/s），在模拟海拔3 500 m处对小鼠进行灌胃给药，连续3 d。每天给药完毕后，将海拔上升至预定海拔7500 m处，小鼠在舱内自由进食和摄水，正常对照组小鼠同时饲养于动物实验科（当地海拔1500 m）。缺氧结束后将舱内海拔降至3500 m，实验人员进入舱内，检测高原损伤后小鼠的学习记忆能力，评价利舒康胶囊对高原学习记忆损伤的干预作用。实验流程如图1。实验结束后麻醉小鼠，取出海马组织，按照测定要求对其进行处理。
1.3.3 HE染色观察高原缺氧小鼠脑组织形态学变化
各组取2只小鼠，取脑组织，经生理盐水漂洗后放入10%甲醛溶液中浸泡，1周后，将样品送至联勤保障部队第940医院病理科，进行石蜡包埋，组织切片，染色以及光镜观察。
1.3.4 Western blot法检测高原缺氧小鼠海马中Nrf2途径蛋白含量及凋亡相关蛋白含量
将实验小鼠大脑取出，剖出海马体后，用BCA法测定其蛋白浓度，之后加入缓冲液，100 ℃水浴5 min，流水冷却后重复水浴5 min使其充分变性。以β-action为内参，配制10% SDS聚丙烯酰氨凝胶进行电泳、转膜和抗体孵育。次日使用ECL液进行显影，Image J图像分析软件对条带进行分析。其中一抗稀释比例为：β-action（1: 2000）、Keap1（1∶1000）、Nrf2（1∶2 000）、HO-1（1∶2 000）、Caspase-3（1∶2 000）、Bax（1∶1000）、BCL-2（1∶1000）。
1.4 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件分析结果，符合正态分布的实验数据以
$ \bar x \pm s $ 表示。多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。2. 结果
2.1 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠学习记忆的干预作用
与正常对照组相比，缺氧模型组小鼠WME、RWE、TE、TT均显著升高（P<0.01）；与缺氧模型组相比，利舒康胶囊三个剂量组小鼠四项指标均有不同程度降低，其中利舒康胶囊高剂量组800 mg/（kg·d）具有显著性差异（P<0.05或P<0.01），表明高原低氧缺氧能导致小鼠空间记忆障碍，而利舒康胶囊高剂量组能够增强高原缺氧小鼠的短期记忆和长期记忆能力，改善大鼠认知，有望对高原缺氧导致的学习记忆损伤患者提供预防和治疗。结果见表1和图2。
表 1 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠空间记忆的影响（$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 剂量（mg/kg） WME(次) RME(次) TT（秒） TE（次） 正常对照组 − 0.43±0.35 0.50±0.41 63.47±9.64 1.50±0.17 缺氧模型组 − 3.00±1.58## 2.70±1.52## 119.99±43.00## 3.10±0.48## 红景天胶囊组 400 0.57±0.35** 0.79±0.49* 81.78±28.20 1.83±0.29#** 利舒康胶囊低剂量组 400 2.43±0.89#▲ 1.36±0.56 99.45±25.27## 3.06±0.58##▲▲ 利舒康胶囊中剂量组 600 2.14±1.14#▲ 1.43±1.10 98.75±30.51 3.04±0.52##▲▲ 利舒康胶囊高剂量组 800 1.07±0.61* 0.71±0.49** 69.38±31.69* 1.73±0.37** # P<0.05, ## P<0.01, 与正常对照组比较；* P<0.05, ** P<0.01，与缺氧组比较 ;▲P<0.05, ▲▲P<0.01，与红景天胶囊组比较 
图 2 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠空间记忆的影响（$ \bar x \pm s $ ，n=10）# P<0.05, ## P<0.01, 与正常对照组比较；* P<0.05, ** P<0.01，与缺氧组比较 ;▲P<0.05, ▲▲P<0.01，与红景天胶囊组比较2.2 利舒康胶囊对缺氧小鼠脑组织形态学的影响
海马体在学习和记忆中发挥关键作用，尤其容易受到缺氧损伤。在本研究中，小鼠脑组织病理学切片结果显示（见图3），正常对照组小鼠海马神经元密集，细胞核大而圆，神经元呈层状有序分布，各层细胞形态饱满而数量多，细胞排列整齐且致密；缺氧模型组小鼠海马神经元细胞分布受到破坏，细胞形态不规则，部分细胞缺失或有空泡(黑色箭头)，出现明显核固缩（蓝色箭头），细胞排列紊乱，CA1区有较多不规则形状的深染细胞（绿色箭头），表明脑组织出现神经元死亡；经过红景天胶囊和利舒康胶囊药物干预后，缺氧模型组脑组织损伤有所改善；神经元细胞排列整齐，核固缩现象减轻（蓝色箭头），深染细胞数量减少（绿色箭头），少有细胞缺失或空泡（黑色箭头），细胞形态较好，排列整齐，且利舒康胶囊高剂量组脑组织形态趋于正常。
图 3 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠脑组织海马HE染色结果（×400）A. 正常对照组；B. 缺氧模型组；C. 红景天胶囊组；D. 利舒康胶囊低剂量组；E. 利舒康胶囊中剂量组；F. 利舒康胶囊高剂量组2.3 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠海马组织中Keap1/Nrf2/HO-1信号通路蛋白水平的影响
与正常对照组比较，缺氧模型组小鼠海马组织中Keap1蛋白含量显著升高（P<0.01），Nrf2、HO-1蛋白含量显著降低（P<0.01）；与缺氧模型组相比，利舒康胶囊组Keap1蛋白含量降低（P<0.01），Nrf2、HO-1蛋白含量显著升高（P<0.01），其中以利舒康胶囊高剂量组蛋白水平变化最为显著，且效果优于阳性药红景天胶囊组。结果见图4和表2。
图 4 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响1. 正常对照组；2. 缺氧模型组；3. 红景天胶囊组；4. 利舒康胶囊低剂量组；5. 利舒康胶囊中剂量组；6. 利舒康胶囊高剂量组表 2 各组小鼠脑组织蛋白表达比较（$ \bar x \pm s $ ，n=3）分组 剂量
（mg/kg）Keap1 Nrf2 HO-1 Caspase-3 Bax BCL-2 正常对照组 − 0.36±0.08 0.76±0.08 1.03±0.14 0.03±0.01 0.09±0.02 0.79±0.09 缺氧模型组 − 0.91±0.15## 0.45±0.03## 0.31±0.05## 0.95±0.12## 0.99±0.08## 0.31±0.02## 红景天胶囊组 400 0.44±0.03** 0.92±0.15** 0.86±0.03 0.75±0.16## 0.73±0.11##** 0.65±0.02#** 利舒康胶囊低剂量组 400 0.42±0.03** 0.77±0.09** 0.67±0.02## 0.86±0.17## 0.81±0.05##** 0.62±0.02##** 利舒康胶囊中剂量组 600 0.41±0.04** 0.83±0.09** 0.98±0.13 0.64±0.06## 0.79±0.06##** 0.73±0.09** 利舒康胶囊高剂量组 800 0.33±0.02**▲▲ 1.21±0.11##**▲▲ 1.23±0.08**▲▲ 0.46±0.01##**▲▲ 0.52±0.05##**▲ 0.76±0.11** # P<0.05, ## P<0.01, 与正常对照组比较；* P<0.05, ** P<0.01，与缺氧组比较；▲P<0.05, ▲▲P<0.01，与红景天胶囊组比较 2.4 利舒康胶囊对缺氧小鼠海马细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2的影响
与正常对照组相比，缺氧模型组小鼠海马组织中Caspase-3和Bax的表达显著升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表达显著降低（P<0.01）；与缺氧模型组相比，利舒康胶囊组Caspase-3和Bax蛋白表达显著降低（P<0.01），BCL-2蛋白表达显著升高（P<0.01），其中利舒康胶囊高剂量组蛋白水平变化尤为显著，且效果优于阳性药红景天胶囊组。结果见图5和表2。
图 5 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠凋亡相关蛋白的影响1. 正常对照组；2. 缺氧模型组；3. 红景天胶囊组；4. 利舒康胶囊低剂量组；5. 利舒康胶囊中剂量组；6. 利舒康胶囊高剂量组3. 讨论
缺氧会引起机体组织细胞形态结构、功能和代谢的异常变化[13]。大脑对缺氧刺激异常敏感，短期暴露于高海拔地区的急性低压低氧会导致认知能力下降，尤其是空间学习、短期记忆和工作记忆能力下降。高原脑缺氧可引起中枢神经系统氧化性损伤，大量证据表明，氧化应激和细胞凋亡是神经元变性和死亡的主要诱因，进而造成机体认知功能损伤，且这种损伤为不可逆缺陷[14]。在本研究中，采用八臂迷宫实验方法检测高原缺氧环境下小鼠的空间记忆能力。通过利舒康胶囊高剂量组干预治疗后，WME、RME、TE和TT与缺氧模型组相比显著减少（P<0.05或P<0.01），表明利舒康胶囊能明显提高高原缺氧环境下小鼠的空间记忆能力。海马体是大脑中对缺氧最敏感的区域之一，也是形成空间记忆的关键区域[15]。HE染色结果显示，与正常对照组相比，缺氧模型组小鼠海马神经元细胞形态不规则，部分细胞缺失或有空泡；经利舒康胶囊干预后，细胞形态较好，排列整齐，少有细胞缺失或空泡。提示进行利舒康胶囊药物干预可以修复高原低压低氧造成的海马组织神经元损伤，防止了小鼠因暴露在高海拔环境中而导致的空间记忆障碍。
Keap1/Nrf2/HO-1信号通路是机体内保持细胞稳态的防御系统，在预防由氧化应激引起的细胞损伤中起重要作用，Nrf2是一种具有细胞保护和抗氧化活性的诱导蛋白，可被视为氧化应激反应的主调控因子[16-18]，HO-1可以催化血红素的分解，从而抑制中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞介导的炎性反应。在正常条件下，Keap1形成E3泛素连接酶的一部分，紧密调控Nrf2的活性，这时的Nrf2活性处在相对较低水平。在氧化应激条件下，Nrf2通过与细胞质中含有半胱氨酸残基的阻遏蛋白Keap-1分离而被激活，进而激活其相关的抗氧化酶HO-1表达，达到抵抗氧化应激的作用[19]。本文研究结果显示，与正常对照组相比，缺氧模型组海马细胞中Keap1蛋白表达升高（P<0.01）、Nrf2和HO-1蛋白表达下降（P<0.01），表明机体在缺氧环境中，ROS积累导致氧化还原状态失衡。经利舒康胶囊干预后，与缺氧模型组相比，Keap1蛋白表达下降，且具有显著性差异（P<0.01），Nrf2和HO-1蛋白表达均显著升高（P<0.01）,且利舒康胶囊高剂量组治疗效果最好，本课题组前期对利舒康胶囊对高原脑损伤防治的研究结果显示[20]，机体暴露在高原环境下，活性氧（ROS)大量累积导致氧化性损伤，利舒康胶囊能降低脑组织内MDA含量，提高SOD的活力，具有良好的抗氧化应激的作用。因此我们推测，利舒康胶囊可以通过调控Keap1/Nrf2/HO-1信号通路，发挥抗氧化作用。
氧化应激和炎症在脑损伤中起关键作用，导致细胞凋亡。细胞凋亡是器官生长、发育和维持正常体内平衡的重要过程，也是脑缺氧后神经元死亡的主要形式[21]。海马锥体神经元的凋亡可导致学习和记忆障碍[22]。Caspase-3作为凋亡激活剂是重要的凋亡调节因子，是缺氧诱导的脑细胞凋亡的重要标志，抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax可能参与病理性凋亡和坏死细胞死亡途径[23-25]。在本研究中，与正常对照组相比，缺氧模型组Caspase-3蛋白含量和Bax/Bcl-2比值表达显著增加（P<0.01），说明缺氧可引起脑组织细胞凋亡。而利舒康胶囊可通过降低Caspase-3蛋白表达和Bax/Bcl-2比值来逆转这些变化，抑制了氧化应激引起的脑细胞凋亡和炎症引发的脑损伤，且利舒康胶囊高剂量组优于阳性药红景天胶囊组。
综上所述，利舒康胶囊可以改善高原缺氧小鼠脑损伤，提高小鼠在高原缺氧环境下的抗氧化能力，其机制可能是通过调控Keap1/Nrf2/HO-1信号通路发挥抗氧化应激作用，减轻缺氧引起的ROS积累；同时通过抗氧化和抗凋亡机制在低压低氧暴露期间为海马神经元提供神经保护作用，从而改善缺氧诱导的小鼠空间记忆损伤。
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突。
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