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侧流免疫层析（LFIA）是一种基于抗原抗体免疫反应的新型检测技术[1]，该技术具有操作简单、检测时间短、灵敏度高和特异性好等特点，因此被广泛应用于医学、食品、农业、环境等领域，对特定生物分子进行快速检测，是迄今为止对目标物质进行即时现场检测（POCT）的最成功的检测技术之一[2]。目前可检测的样品种类很多，例如血液、汗液、尿液、唾液等，LFIA使用范围非常广泛，在医药检测、食品安全、农业、工业方面都有涉及[3]。
LFIA试纸主要由样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板五部分组成[4]。样品垫用于吸收待测样品，并通过毛细作用力将样品传送到结合垫；结合垫上负载标记材料，与待测样品中的目标物质在检测时结合，形成可检测的复合物，再将复合物传送至层析膜；层析膜上的检测线和质控线用于显色，同时也可观察检测结果[5]；吸水垫用于带动样品在层析膜上侧向流动，同时也可吸收废液；底板可用于粘连检测试纸各个部分。
检测线（T线）用于检测目标分子是否存在，质控线（C线）用于验证试纸是否有效。待测样品加入后，目标分子和结合垫上的标记抗体结合，随着层析作用到达层析膜被T线上的单抗捕获，过量的标记抗体在C线上被二抗捕获[6]。利用专业的检测仪器对T线和C线条带的颜色进行扫描并转换成数值，将结果代入预先建立的标准曲线中，从而实现对目标分子的定性和定量分析。
识别元件是LFIA的重要组成部分，其中最常见的是抗体和适配体。抗体与目标分析物结合，通常用于检测待测样品中的目标分子。抗体具有较高的灵敏度和特异性，能够识别极小量的目标分子，具有广泛的应用领域。然而，抗体也存在一些缺点，例如制备过程繁琐、热稳定性差、易受交叉反应和失活的影响等等[7]。适配体是一种新兴的识别元件。与抗体不同，适配体是一种可以通过体外筛选而得到的人工寡核苷酸序列，具有与抗体相当的特异性和亲和性。此外，适配体稳定性高、易于合成，因此备受关注，在药物分析、临床医学、靶向治疗及基因调控等领域已成为非常重要的研究工具。
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在LFIA中，标记材料是至关重要的组成部分，它们用于标记免疫反应的产物，并用于可视化检测结果。常用的标记材料可分为三类，分别是有色标记物、荧光标记物和其他标记物，它们都具有不同的优点和适用范围，可以根据具体应用场景进行选择和优化。随着新技术的不断涌现，LFIA技术的标记材料也将不断发展和创新，为快速、准确、方便的生物检测提供更好的解决方案。
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有色型标记物是指可产生肉眼可见颜色的标记物，常用的有色型标记物有胶体金和胶体碳等。
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胶体金是一种含有纳米尺寸的金颗粒，通过氯金酸中的金离子还原成金颗粒制备，通常用于标记蛋白质或抗体等生物分子[8]。胶体金是LFIA中最常用的标记材料，其显色是由于大量聚集从而形成红色条带。胶体金的标记受多种因素影响，如胶体金的酸碱度和配体蛋白的比例等[9]。胶体金制备方便、性质稳定、吸附能力较强，对蛋白质和其它生物分子具有高亲和力，同时也具有较高的电荷转移值和良好的光信号。徐子健等[10]使用胶体金作为标记材料检测水果中残留的三唑磷，检测限为15 μg/kg，检测时间为5 min。涂晓波等[11]使用胶体金作为标记材料检测食品中四氢大麻酚，检测限为1 μg/ml，检测时间为5 ～10 min。
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胶体碳是碳黑经过表面处理所得。胶体碳灵敏度较高，较胶体金材料更加环保，且黑色信号更有利于肉眼观测。胶体碳可以与多种生物分子一起功能化，用于检测低分子量和高分子量的分析物[12]。使用胶体碳的LFIA的灵敏度与酶联免疫吸附测定（ELISA）相当[13]。但是胶体碳存在不规则形状的大颗粒，非蛋白质和生物分子的特异性吸附是胶体碳存在的主要问题。陈发容等[14]使用胶体碳作为标记材料制作检测试纸检测花生油中黄曲霉毒素B1，结果显示检测限为2.0 ng/g，检测时间为5～10 min，表明该检测试纸特异性良好，与其他结构类似物无交叉反应。曾艳等[15]使用SB4型炭黑作为标记材料制作检测试纸，用于呋喃妥因代谢物1-氨基-乙内酰脲的检测，其检测限为0.2 μg/kg，检测时间短，可在15 min内完成。
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荧光标记物在特定的光源激发下会产生荧光，常用的荧光标记物有镧系元素、量子点等，目前许多新型荧光标记物也已用于LFIA定量检测。
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镧系元素也可称为稀土元素，由于电子壳层间产生跃迁，从而产生强烈的荧光。镧系元素具有灵敏度高、特异性好、稳定性好、动态检测范围广等特点，并且不依赖复杂的专业仪器设备就能即时获得检测结果。李艾哲等[16]使用铕纳米颗粒制备荧光探针来制作试纸检测猪旋毛虫病，采用15头不同剂量人工感染旋毛虫猪的全血评估试纸的性能，结果显示，不同剂量的试纸都呈阳性，使用集样消化法进行检测，结果并未全部呈现阳性，表明该检测方法具有更高的灵敏度，且操作简便，检测限为0.05 ng/ml，仅需5～10 min即可检测出结果。黄文颖等[17]以羧化铕微球为荧光标记材料制作了试纸，检测牦牛肉中磺胺类药物残留，检测限为1.97 μg/kg，所有样品的添加回收率在90%～115%，其中批内离散系数均低于10%、批间离散系数均低于13%。
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量子点是一种半导体材料，粒径属于纳米级别。量子点吸收光子后价带的电子跃迁到导带，导带上的电子也可以跃迁到价带发射光子，不同量子点粒子的大小可发出不同波长的光[18]。量子点具有良好的稳定性和吸收系数，易于与生物分子结合，并且具有水溶性[19]。由于其独特的光学特性，可用于监测广谱波长等，量子点已经成为有机荧光染料的替代品[20]。徐志远等[21]根据非洲猪瘟病毒（ASFV）VP72蛋白的氨基酸序列筛选合成多肽，并与载体蛋白BSA进行偶联，用来制备鼠源抗ASFV-VP72蛋白的单克隆抗体，将该单抗作为荧光量子点标记的抗体，建立了一种简便、快速、准确的用于ASFV抗原检测的荧光量子点免疫层析试纸，结果阳性符合率为82.1%，阴性符合率为93.8%，该试纸条特异性好、灵敏度高。毛永强等[22]使用量子点检测氨苄青霉素，氨苄青霉素在5.0 ～ 140.0 μmol/L范围内对碳量子点的荧光增强程度呈良好的线性关系，检出限为1.0 μmol/L。
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表面增强拉曼技术（SERS）是一项利用金属的纳米结构增强待测物电磁场的技术，从而使吸附于基底上的拉曼信号放大。SERS增强基底常使用贵金属，例如金、银等。可将多种贵金属组合使用制作基底，不同金属内部的纳米结构不同，因此放大信号的能力也不同，可通过改变基底材料的组成、尺寸、间距、聚焦方式等优化基底。SERS常用于食品安全、医疗诊断、生物分析等领域。SERS技术具有优异的特异性和灵敏度，检测结果准确度高，但是同时需要昂贵的拉曼检测仪配合使用。韦伟等[23]自制金银纳米梭基底，结合癌胚抗原（CEA）的单克隆抗体，实现胃癌的早期诊断。经过实验证明，该检测方法灵敏度高、特异性好，对血清中CEA检测限低至1.22 pg/ml，基于SERS分析平台在胃癌诊断中具有应用价值。冯笛等[24]基于SERS开发了一种银立方体基底和酶促反应相结合的检测方法，检测汗液中的葡萄糖，检测限为0.5 mmol/L，整个过程可在7 min内完成。
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最初，研究人员使用胶体金制备试纸条，用于尿人绒毛膜促性腺激素检测，检测结果依据目测判定，但是该检测方法假阴性率高、检测灵敏度低。随着LFIA技术的发展，也出现了通过图像采集的方法处理检测线的仪器，LFIA测量逐渐实现定量、半定量化。
定量检测的原理是通过对T线和C线的颜色进行定量或半定量分析。为了方便定量检测，通常采用专业仪器测量T线和C线颜色的强度。目前广泛应用的LFIA定量检测仪器主要包括金标检测仪和荧光检测仪，此外，新型的智能手机相机作为检测仪器也开始广泛的应用，可作为家用便携式检测仪进行检测，基于SERS的检测仪等也在逐步的发展研究中。
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胶体金检测技术使用纳米级的胶体金作为标记材料并进行检测，表面带负电荷的胶体金颗粒可以与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合[25]。金标检测仪主要有基于光敏电阻法和图像处理法的检测仪，从而将T线和C线的颜色信号转换成电信号或灰度图像。
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基于光敏电阻法的检测仪是基于朗伯-比尔光吸收定律，利用光电二极管接收试纸条反射光，用相关算法对待测区域采样数值进行处理。光敏电阻法是使用光电导探测器，其阻值会随着照射光信号的强度发生变化，因此入射光强时输出电流大，入射光弱时输出电流小，通过拟合待测物浓度与相关检测值的曲线，从而求出未知检测物的浓度。
该类检测仪的结构一般由信号采集板、LED光源、步进电机组成。检测系统通过步进电机对试纸进行扫描，步进电机的固定架与仪器外壳底部固定连接[26]。试纸两侧位置有光源，试纸条置于信号采集板上。步进电机水平匀速移动，对下方的试纸条进行扫描检测，根据不同测量物选用不同颜色和波长的发光二极管作为系统检测的光源。通过光电二极管接收胶体金试纸条反射光，通过计算转换获得检测结果。
利用嵌入式微控制器，软件部分包括主程序、电机控制模块软件、人机交互模块软件、显示模块软件、存储模块软件。这些软件共同完成仪器的检测流程，包括从开机自检到检测完成的全部流程。
王振江[27]利用绿色光源激发的光敏电阻法开发了一种基于硅光电池的便携金标检测仪。选取0、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1 ng/ml这7种不同浓度的克伦特罗溶液作为样品进行检测，结果显示变异系数分别为2.27%、1.92%、2.13%、2.08%、2.18%、1.8%、2.25%，变异系数均低于3%，证明了该便携检测仪具有较高的稳定性。
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基于图像处理的检测仪通过将试纸进行图像信息采集，使用算法进行特定处理，从图像中提取试纸图像的特征值。通常使用CCD或者CMOS来进行光电转换[28]，当光照射到像元上时产生光电流，光强度越强，在每个像元上累积电荷量就越多。主控芯片获得显色图片后，通过算法处理得到T线和C线的显色结果，图像信息经数据转换后在LCD显示。
该类检测仪的硬件主要包括图像传感器、LED光源、电源。依据胶体金的吸收峰波长以及图像传感器的光谱响应，可以选择不同颜色的LED作为系统照明光源[29]。输出的图像在电脑上进行分析处理，得出相应的检测结果[30]。LED光源照射在试纸条带反应区，反射光被图像处理器捕捉，图像传感器将经过滤光片的光信号转化为电信号，通过信号放大等处理后形成原始图像数据。
软件部分是将原始图像数据通过算法进行计算，提取T线和C线的条带信息，获取吸收特征峰曲线，并对曲线进行平滑处理，提取特征峰曲线的特征值并且建立模型，获得浓度拟合曲线，从而输出定量检测值。
郑宇[31]等开发了一种利用图像处理对尿素酶进行定量检测的检测仪。使用CMOS传感器获取图片信息，然后使用k-means均值聚类算法提取T线和C线，T线和C线被转换成灰白色，并且提取出进行计算。采用该仪器检测了3种不同浓度的试纸条的色带的平均灰度值，检测结果显示差异非常小，波动范围小于3%，设备的检测下限为5 mIU/ml，符合临床检测的需要。
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随着许多新型的荧光标记物的广泛使用，也出现了灵敏度更高的荧光检测仪。现有的荧光检测仪主要有基于光电转换的检测仪和智能手机两种模式。基于光电转换的检测仪是通过光电传感器获取T线和C线中的荧光信号并转换成电信号[32]，这种模式需要完整的机电检测系统，使得整套仪器笨重不方便携带，不利于即时检测。新型检测模式使用智能手机自带的相机，利用手机软件可对荧光及化学发光信号进行分析处理，该检测方法在疾病的家庭自检中具有极大的应用前景。
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基于光电转换的检测仪采用光电扫描方式进行荧光层析试条的定量检测[33]。当激发光照射在层析试条上，荧光标记物获得能量发出荧光，光学传感器捕捉到发出的荧光，进而将光信号转化成为电信号，发出的光信号越强，转换的电信号也就越强，根据荧光信号强度进行待测样品溶液的浓度分析[34]。
该类检测仪的硬件系统主要由激发光源、光电检测系统、步进电机等组成。随着步进电机在试纸上方匀速运动，激发光扫描整个试条，在激发光和试纸中放置一面二向色镜，二向色镜用来反射激发光照射到试纸上，待测物由于激发光照射发出荧光，被光电二极管接收，根据获取的电信号强弱进行分析，通过滤波放大电路对信号进行放大，通过模数转换器进行分析，得出数据结果。
姜海燕等[35]利用基于STM32的荧光测流免疫分析仪定量检测C反应蛋白，并通过传统的荧光分析仪平行测定，与该检测装置进行对比，证明其性能。使用3种不同浓度的样品溶液，分别在该检测装置和ESE分析仪进行多次测试，使用检测线峰值和控制线峰值的比值作为信号特征量，检测出该装置的灵敏度为1.95 µg/ml，ESE的灵敏度为1.95 µg/ml，因此该检测仪器的灵敏度较高；线性度测试结果显示，该检测装置的线性相关系数r=0.996，ESE的线性相关系数 r=0.9947，在线性度上该检测装置接近ESE，但ESE检测范围为0.98～32µg/ml，该检测装置检测范围为1.95～256 µg/ml，检测范围更宽；重复性测试结果显示，对应质量浓度ESE的变异系数分别为0.5%、0.2%，该检测装置分别为1.65%、0.6%。由结果可知，该检测装置具有较高的灵敏度、线性度、重复性，可用于临床。
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基于智能手机的检测仪是利用智能手机相机进行图像收集，利用手机应用程序对图像进行分析处理。开发适配手机的配件暗盒，其中可插入检测试纸，从而隔绝外部环境光线变化等对结果分析的影响[36]。暗盒可以通过简单的手动操作使用，因此使用智能手机CMOS相机作为光探测器，非专业操作员也可以进行整个分析。
该类检测仪的硬件系统包括手机配件暗盒以及智能手机，手机配件上包含一个与相机对齐的平凸透镜和一个用于插入暗盒的插槽。
Zangheri等[37]又开发了一种用于赭曲霉毒素A检测的智能手机定量检测仪，在葡萄酒和速溶咖啡两种基质中获得的校准曲线彼此非常相似，这表明预处理程序有效地去除了可能干扰测定的任何样品组分。该测定还显示出良好的再现性，与校准曲线的点相关的相对标准偏差（RSD）始终低于12%（葡萄酒基质）和7%（速溶咖啡基质）。
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SERS作为一种高度灵敏的分析技术，已被用于鉴定各种分析物，如核酸、蛋白质、细菌、细胞和重金属。这种光谱检测方法利用金属表面激发的低能电子使等离子体表面的局域光电场增强，从而引起SERS信号的极大提高。基于SERS的LFIA将SERS的高灵敏度和特异性[38]与LFIA技术的简单、快速和易于操作相结合，因此非常适合临床POCT。然而基于SERS的LFIA的主要不足是测试结果的读数效率较低[39]，并且商用的拉曼散射仪价格昂贵。
基于SERS的LFIA读卡器包括LFIA反应通道、二极管激光器、光谱仪、光纤拉曼探头、步进电机、两轴手动可调平移台、光电开关传感器和触摸屏计算机主板。步进电机安装在可手动调节的平移载台上，并且配有支架，装有LFIA试纸的集成LFIA通道安装在固定在步进电机上的支架上，并且可以通过调整两轴平移台上下移动或来回移动。平移级的上下运动可以控制拉曼探头，使其在T线和C线之间切换检测。
史巧巧等[40]利用基于SERS的检测仪检测猪肉中喹乙醇的浓度。取不同浓度的喹乙醇标准溶液建立标准曲线，结果是随着分析物浓度的升高，拉曼峰强度逐渐降低，在0.1 pg/ml～1.0 ng/ml浓度范围内均呈现较好的线性关系，根据获得的拟合方程，计算出检测灵敏度为0.025 ng/ml，检测限为0.31 pg/ml。测定实验的重现性，在相同浓度的试纸条中，随机测定的点的RSD分别为5.6%、6.3%、3.7%、4.8%和3.1%，说明该方法对于SERS信号检测的精密度较高。
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LFIA检测正在向着精准化的方向发展，传统的标记材料检测灵敏度偏低，因此研究人员致力于研究出更高效的新型标记材料。除了上文中提到的标记材料，还有一些新型标记材料，例如上转换荧光纳米材料，在红外线区域激发，可用于检测核酸、呼吸道合胞病毒等；磁性材料，广泛应用于生物检测和分离之中，纳米级别的磁性材料与抗体结合形成的磁珠可以对分析物进行预浓缩和纯化，从而显著提高灵敏度。随着新型标记物的产生，LFIA的应用也会更加方便和灵敏，趋向家用化，以满足用户日常健康监测的需求。
LFIA检测仪也正在趋向便捷化。目前胶体金检测仪、荧光检测仪以及基于SERS的检测仪的检测精确度和灵敏度都达到了可用于临床检验的程度，但是对高浓度分析物的检测具有限制、重现性较差。对于胶体金检测仪，光敏电阻法的信号响应会因为T线和C线的宽度受到限制，图像处理法也存在对灰度图像的利用不充分的缺点。目前出现多种新型金标检测仪，可通过分析仪检测T线和C线的温度、气压等变化，经过数字转换获得定量检测结果，灵敏度比光敏电阻法高数十倍。对于荧光检测仪，目前出现的新型智能手机荧光检测仪，可通过使用暗盒避免外界环境带来的影响，进一步提高了准确性，使荧光检测仪摆脱需要专用检测仪的限制，逐渐向家用的方向发展。对于SERS检测仪，其灵敏度高、特异性强、检测速度快，但是SERS基底与生物分子会互相作用影响精度、制备复杂，该技术还处于摸索阶段，仍需大量的临床试验进行验证。
随着新型灵敏标记物、新型LFIA检测仪器的发展和应用，LFIA检测项目会更多、更普及，其操作方式会更加智能、便携、家用，其定量结果输出也会更加快速、灵敏、准确，在即时现场检测领域必将发挥巨大的作用。
Research progress on quantitative detection methods of lateral flow immunochromatography assay
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摘要: 侧流免疫层析技术是一项新型的即时检测技术，采用层析膜和标记材料进行检测。该检测技术具有方便快捷、成本低廉的特点，因此被广泛应用于生物医药、疾病检测、食品安全、环境保护等多个领域。传统的侧流免疫层析需要使用肉眼观测，因此只能提供至多半定量的结果，并且有可能存在观测误差。随着各种类型的标记材料和灵敏检测仪器的出现及广泛应用，侧流免疫层析技术逐步实现了对待检测物的定量检测。通过综述识别元件、标记材料、检测仪器等，阐述侧流免疫层析检测系统的研究进展以及目前的应用情况。Abstract: Lateral flow immunochromatography assay is a new instantaneous detection technology that employs a chromatographic membrane and labeling materials for detection. This detection technology is convenient, fast, and inexpensive, and is therefore widely used in a number of different fields, such as biomedicine, disease detection, food safety, environmental protection, and so on. Traditional lateral flow immunochromatography assay relied on visual observation and provided only qualitative or semi-quantitative results. By utilizing various types of markers and sensitive detection devices, lateral flow immunochromatography assay enables quantitative and multi-component detection of the analytes. The research progress on the lateral flow immunoassay detection system and its current applications in the context of recognition elements, labeling materials, and detection instruments were reviewed in this paper.
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Key words:
- lateral flow immunochromatography assay /
- detector /
- biomarker
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高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品与试剂
姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
2. 方法与结果
2.1 姜黄素纳米乳的制备
姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立
2.2.1 色谱质谱条件[8]
色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
2.2.2 方法学考察
取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究
2.3.1 给药方案
18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
2.3.2 药动学参数计算
药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 2.4 药效学研究
2.4.1 动物分组、造模及给药
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
2.4.2 统计学处理
实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。2.4.3 肝脏指数
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片
取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平
第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
3. 讨论
姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
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