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骨质疏松症和阿尔茨海默病均为退行性疾病，越来越多的研究表明它们的发病机制具有关联[1]。骨质疏松症往往伴随着认知缺陷，Aβ沉积是阿尔茨海默病的典型症状，而阿尔兹海默病小鼠（APPswe/PS1dE9）的骨组织中也会出现Aβ沉积，并出现骨密度降低，骨强度减弱等骨质疏松症状[2]。另有研究表明，氧化应激会导致 Aβ沉积，这种氧化损伤状态可被抗氧化剂改善[3]。因此， Aβ沉积偶联氧化损伤可视为阿尔茨海默病及骨质疏松症的共同发病机制。巴戟天丸收载于明代《古今医统大全》，由君药巴戟天，臣药远志、石菖蒲、茯苓、人参以及地骨皮、茯神组成[4]。前期课题组研究已证实，巴戟天丸组方可以从体内外水平上改善D-半乳糖（D-gal）引发的骨丢失，但巴戟天丸组方治疗Aβ沉积所致的骨丢失及具体作用机制有待进一步阐明[4, 5]。因此，本研究拟以Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞模型，对巴戟天丸组方的抗氧化能力及对骨形成干预作用进行探究，并通过网络药理学方法对潜在的作用机制进行预测。
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取质量比为5∶10∶10∶10∶10∶10∶3的巴戟天、茯苓、茯神、地骨皮、远志、石菖蒲、人参粉末，混合均匀。按照料液比1∶10加入去离子水，浸泡1 h后，加热煎煮，回流提取2次，每次1 h，所得药液过滤，合并两次的滤液。将收集到的滤液减压浓缩成浓度为2.6 g（生药量）/ml的巴戟天丸水提物母液。-20°C保存备用。
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新生 24 h Wistar 大鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）；胎牛血清（以色列BI）；MTT（上海碧云天）；BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒（上海碧云天）、ALP、CAT、SOD、GSH 、MDA 试剂盒（南京建成）；PBS（天津灏洋）；DMSO（上海博光）；α-MEM 培养基（上海富衡）； BMP2、RUNX-2、OPG、GAPDH抗体（美国Abcam）。
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采用二次消化法从新生 24 h Wistar 大鼠的颅盖骨中分离得到原代成骨细胞，将成骨细胞培养于 α-MEM 培养基中（10% 胎牛血清），置于 37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，取第 3～5 代成骨细胞进行后续实验。
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将成骨细胞以 2×104个/孔接种于无菌 96 孔板中，孵育过夜。空白组和模型组更换新的完全培养基，阳性药组加入含N-乙酰半胱氨酸（NAC）的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养液（0.008、0.04、0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组和给药组给予Aβ1-42寡聚体进行损伤，使完全培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到 20 mmol/L。培养 48 h 后，采用 MTT 法测定细胞增殖水平。
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ALP 活性检测：按照“1.4.2”项的方法进行给药，培养 48 h 后，取上清液，根据说明书进行 ALP 活性测定。将成骨细胞以 1×105 个/孔接种于无菌6孔板中，孵育过夜，细胞完全贴壁后，空白组和模型组更换新的完全培养基，阳性药组加入含NAC的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养基（0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组和给药组给予Aβ1-42寡聚体进行损伤，使培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到20 mmol/L。培养 48 h 后进行染色，室温下避光孵育 48 h，洗去工作液后置于显微镜下拍照。
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将成骨细胞以2×104个/孔和5×104 个/孔分别接种于接种于无菌96孔和24孔板中，孵育过夜，细胞完全贴壁后，空白组和模型组更换新的完全培养基，阳性药组加入含NAC的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养液（0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组、阳性药组和给药组给予Aβ1-42寡聚体进行损伤，使培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到20 mmol/L。培养 48 h 后根据说明书进行检测。
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将细胞以 2×105 个/孔接种于 6 孔板中，孵育过夜，细胞完全贴壁后，阳性药组加入含NAC的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养基（0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组和给药组加入Aβ1-42寡聚体，使完全培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到20 mmol/L。48 h 后，吸去培养基，PBS 洗涤 3 次。于冰上对细胞进行裂解提取总蛋白，采用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后，经 SDS-PAGE 凝胶电泳后转移至 PVDF 膜进行转膜，室温封闭1 h后，加入相应的一抗，4 ℃过夜，1×TBST洗涤 3 次，加二抗于室温孵育 50 min，1×TBST洗涤 3 次，采用 ECL 化学发光试剂盒检测。
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使用 SPSS Staistics 24 统计分析软件进行统计学分析。计量数据均采用（
$\bar{x} $ ±s）表示，选用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间变量的比较分析。使用 Graphpad prism 9.0 软件进行统计及绘图。以P<0.05 为差异有显著性意义。 -
通过TCMSP（http://tcmsow.com/tcmsp.php）和ETCM数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php），查找巴戟天、地骨皮、茯苓、人参、石菖蒲和远志6味中药的成分。在TCMSP数据库中，选择药物口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18的成分，在ETCM数据库中根据DrugLikeness Grading评分，选择评分为Moderate和Good的成分[6]。
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通过Uniprot（http://www.uniprot.org/）数据库，将靶点映射成基因，利用Cytoscape 3.6.0软件绘制成分靶点图。
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通过Disgenet数据库（http://www.disgenet.org/）和Genecards数据库（https://www.genecards.org/）查找阿尔兹海默病和骨质疏松症相关的疾病靶点，绘制PPI蛋白相互作用网络图，整合两大数据库中的靶点基因，去除重复的靶点。利用Venny2.1，将阿尔兹海默病和骨质疏松症相关的疾病靶点图进行交集分析。
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利用Venny2.1，将阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方相关靶点进行交集分析。将药物疾病交集靶点上传到String数据库进行分析，绘制PPI蛋白相互作用网络图。
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采用Metascape数据库，对关键靶点进行GO基因富集分析（http://geneontology.org/）和KEGG代谢通路分析（http://www.genome.jp/kegg/），分析巴戟天丸中的主要分子生物过程和信号通路。
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Aβ1-42寡聚体可显著抑制成骨细胞的增殖；巴戟天丸组方在 0.04、0.2、1、5 μg/ml浓度下均能够显著提高成骨细胞的增殖水平（图1A）。Aβ1-42寡聚体会显著抑制成骨细胞中骨形成相关蛋白BMP2、RUNX-2、OPG的表达；给予巴戟天丸组方干预后，BMP2、RUNX-2、OPG的表达显著提高，提示巴戟天丸组方可显著促进Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞的骨形成（图1B）。与空白组相比，Aβ1-42寡聚体可以显著降低成骨细胞的 ALP 活性，而巴戟天丸组方显著逆转了 Aβ 损伤成骨细胞的 ALP 活性，促进成骨细胞的分化（图1C、D）。
图 1 巴戟天丸组方对Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞增殖、骨形成相关蛋白以及ALP活性的影响（n=6）
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如图2 所示，Aβ1-42寡聚体显著降低了成骨细胞CAT（图2A）、SOD（图2B）、GSH（图2D）的活性，提高MDA的活性（图2C），导致成骨细胞的氧化损伤，而巴戟天丸组方低、中、高剂量均可以显著改善Aβ1-42寡聚体导致的氧化损伤。
图 2 巴戟天丸组方对Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞抗氧化能力的影响（n=4）
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根据条件筛选后，其中，巴戟天成分为20种，地骨皮成分为12种，茯苓成分为10种，人参成分为18种，石菖蒲成分为10种，远志成分为5种，茯神成分0种，共计成分75种。
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通过TCMSP和ETCM数据库查找满足筛选条件的化学成分对应的靶点，得到151个预测靶点。删除重复靶点后，通过Uniprot数据库映射成基因ID，剔除重复靶点后，得到143个基因symbol（图3）。
图 3 巴戟天丸组方成分靶点图
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通过Disgenet数据库和Genecards数据库查找得到阿尔兹海默病相关疾病靶点10 362个，骨质疏松症相关疾病靶点4 582个，并将所得靶点进行蛋白相互作用网络分析（图4A、B）。将阿尔兹海默病和骨质疏松症相关的疾病靶点图进行交集分析，得到共有靶点2 674个（图4C）。
图 4 阿尔兹海默病、骨质疏松症靶点图
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将2 674个疾病交集靶点基因和143个药物成分靶点基因再次进行交集分析，得到共有靶点95个（图5A），将95个药物疾病交集靶点上传到String数据库进行分析，绘制PPI蛋白相互作用网络图。将单独节点去除后，图中共有94个节点，871条边，意味着它们间有特殊的关联，即蛋白质共同贡献一个共同的功能，每个靶点的平均节点度为18.3，说明交集靶点间关系密切而且存在很强的相互作用关系（图5B）。
图 5 阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方共同靶点图
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GO富集分析包括生物过程（BP）、分子功能（MF）及细胞组分（CC），将每个结果前 10 的条目可视化为条形图（图6A）。巴戟天丸活性物质参与的BP主要包括对脂多糖的反应、对氧含量的反应、细胞凋亡信号途径、活性氧代谢过程。MF主要包括G蛋白偶合胺受体的活性、神经递质受体的活性、氧化还原酶活性、参与凋亡信号通路的半胱氨酸型内肽酶活性、泛素类蛋白连接酶结合。CC主要包括膜筏、突触膜的整体组成部分、浆膜筏等。 KEGG 通路富集分析中主要涉及与阿尔兹海默症、骨质疏松症相关的通路有AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路以及神经活性配体与受体的相互作用通路等（图6B）。
图 6 巴戟天丸GO基因富集分析和KEGG代谢通路分析
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骨骼重塑是一个重要的生理过程，其主要包括两个阶段，成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收[7]。其中，成骨细胞的增殖能力反映骨形成的强弱，其分泌的 ALP 是分化阶段的关键酶，可促进骨组织矿化[8]。本研究中，各剂量巴戟天丸均可显著改善Aβ损伤成骨细胞的增殖抑制，且0.2 μg/ml效果最好，5 μg/ml的效果优于0.04 μg/ml，故选择0.2 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml作为巴戟天丸给药剂量进行后续实验，并发现其可显著提高Aβ损伤成骨细胞的ALP活性和骨形成相关蛋白 BMP2、RUNX-2、OPG的表达，促进骨形成。GSH是细胞抗氧化系统的一个重要成员，高水平的GSH对于清除过多的活性氧（ROS）和解毒异物是不可缺少的[9]。MDA是细胞中多不饱和脂肪酸过氧化的最终产物之一，自由基的增加会导致MDA的过度生产，加剧氧化损伤[10]。SOD和CAT是重要的酶类抗氧化剂，二者活性的降低会导致氧化损伤[11,12]。本实验中巴戟天丸组方可逆转Aβ损伤成骨细胞GSH、SOD、CAT活性的降低， MDA活性的升高，结果所表现的剂量依赖与增殖实验相吻合，表明巴戟天丸组方可作为抗氧化剂改善成骨细胞的氧化损伤。后采用网络药理学方法进一步探究巴戟天丸干预Aβ损伤成骨细胞的作用机制，结果显示，巴戟天丸促进Aβ损伤状态下成骨细胞骨形成的作用可能与AGE-RAGE、PI3K-Akt及MAPK等信号通路有关。其中，AGE-RAGE信号通路的激活会扰乱细胞的氧化还原平衡并调节各种细胞死亡途径 [13]。作为AGE-RAGE信号通路的下游， PI3K-Akt信号通路的激活会增强细胞的抗氧化能力，保护细胞免受氧化应激[14]。此外，MAPK通路的激活同样可以减轻氧化应激状态[15]，故网络药理学研究结果同样提示巴戟天丸组方可通过缓解氧化损伤发挥干预Aβ沉积损伤成骨细胞的作用。
The roles of Bajitianwan formula on Aβ-injured osteoblasts and the mechanism based on network pharmacology
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摘要:
目的 探讨巴戟天丸组方对Aβ损伤成骨细胞的骨形成作用及其机制。 方法 以新生24 h Wistar大鼠所分离的成骨细胞为研究对象，用 Aβ1-42 寡聚体对成骨细胞进行损伤，并用巴戟天丸组方水提物进行药物干预。分别采用MTT法、碱性磷酸酶（ALP）活性检测、过氧化氢酶（CAT）活性检测、超氧化物歧化酶（SOD）活性检测、谷胱甘肽（GSH）活性检测以及丙二醛（MDA）活性检测。采用蛋白质印迹法检测骨形成相关蛋白骨形态发生蛋白2（BMP2）、成骨特异性转录因子（RUNX-2）、骨保护蛋白（OPG）的表达水平；明确巴戟天丸组方对Aβ损伤成骨细胞的作用后，采用网络药理学方法对潜在的作用机制进行预测。 结果 巴戟天丸组方可显著促进Aβ损伤成骨细胞的增殖，提高 ALP、SOD、GSH 活性，抑制MDA活性，并促进骨形成相关蛋白BMP2、RUNX-2、OPG的表达。网络药理学分析显示，巴戟天丸组方发挥改善Aβ损伤成骨细胞的作用主要与AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路以及神经活性配体与受体的相互作用通路等有关。 结论 明确巴戟天丸组方具有改善Aβ损伤成骨细胞的作用，并通过网络药理学方法探究其相关作用通路，为传统方剂巴戟天丸抗骨质疏松的临床应用提供借鉴。 Abstract:Objective To explore the effect of Bajitianwan（BJTW）formula on bone formation of Aβ-injured osteoblasts and its mechanism. Methods Osteoblasts isolated from neonatal 24-hour Wistar rats were used for the study, and osteoblasts were subjected to damage with Aβ1-42 oligomers, and pharmacological intervention was performed with the aqueous extract of BJTW formula. The MTT assay, alkaline phosphatase（ALP）activity assay, catalase（CAT）activity assay, superoxide dismutase（SOD）activity assay, glutathione（GSH）activity assay and malondialdehyde（MDA）activity assay were carried out respectively. The expression levels of bone morphogenetic protein 2（BMP2）, osteogenic specific transcription factor（RUNX-2）and osteoprotective protein（OPG）were detected by Western blotting. After confirming the effect of BJTW formula on Aβ-injured osteoblasts, the network pharmacology method was used to predict the potential pathways. Results The BJTW formula significantly promoted the proliferation of Aβ-injured osteoblasts, increased ALP, SOD and GSH activity, inhibited MDA activity, and promoted the expression of bone formation-related proteins BMP2, RUNX-2 and OPG. Network pharmacological analysis showed that the effect of ameliorating of Aβ-injured osteoblasts by BJTW formula was mainly mediated by AGE-RAGE, PI3K-Akt, MAPK and neuroactive ligand-receptor interaction signaling pathways. Conclusion In this study, the effect of BJTW formula on improving the osteoblasts damaged by Aβ was confirmed for the first time, and its related mechanism was explored based on network pharmacology method. The results lay a strong foundation for the clinical application of traditional formula BJTW against osteoporosis. -
Key words:
- osteoblasts /
- Bajitianwan /
- Aβ deposition /
- network pharmacology
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高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品与试剂
姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
2. 方法与结果
2.1 姜黄素纳米乳的制备
姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立
2.2.1 色谱质谱条件[8]
色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
2.2.2 方法学考察
取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究
2.3.1 给药方案
18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
2.3.2 药动学参数计算
药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 2.4 药效学研究
2.4.1 动物分组、造模及给药
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
2.4.2 统计学处理
实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。2.4.3 肝脏指数
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片
取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平
第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
3. 讨论
姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
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图 1 巴戟天丸组方对Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞增殖、骨形成相关蛋白以及ALP活性的影响（n=6）
*P<0.05，**P<0.01与模型组比较，##P<0.01与空白组比较。
图 2 巴戟天丸组方对Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞抗氧化能力的影响（n=4）
*P<0.05，**P<0.01与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01与空白组比较。
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