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针对非小细胞肺癌（NSCLC）的靶向药EGFR-TKIs，自第一代问世以来发展迅速，目前第四代已在临床研发阶段。但由于新的耐药突变的不断产生，导致其应用受限。因此如何克服EGFR-TKIs耐药问题和寻找可改善肺癌靶向治疗耐药的药物已成当务之急。植物来源的单体成分种类繁多，应用前景巨大。毒胡萝卜（Thapsia garganica L.，伞形科毒胡萝卜属）是于地中海西部沿海地区发现的一种开花植物，一直被作为止痛剂应用于传统医学。毒胡萝卜素是从该植物中分离的单体化合物，作为内质网应激（ERS）的诱导剂，近年也被用于抗肿瘤和抗病毒研究。吉非替尼作为第一代EGFR-TKIs，副作用小，有效率高。本研究旨在探讨毒胡萝卜素和吉非替尼联合用药对人肺腺癌耐药细胞株PC9/GR耐药性的影响，并探讨其可能的机制。
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吉非替尼（纯度99.94%，HY-50895）、毒胡萝卜素（纯度99.95%，HY-13433）、CCK8试剂（HY-K0301-500T）均购自美国MCE公司；胎牛血清（F8318-500ML）和DMEM培养基（D6429-500ML）购自美国Sigam Aldrich公司；胰酶（25200-072）购自美国Gibco公司；凋亡试剂盒（559763）购自美国BD公司； ATF-6抗体（#65880）、IRE1α抗体（#3294）均购自美国CST公司；羊抗兔二抗（AS003）购自abclonal；PVDF膜购自Millipore；其余试剂均为国产分析纯试剂。人肺腺癌细胞（PC9）由同济医院惠赠，PC9/GR细胞购自湖南丰晖生物科技有限公司。
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PC9细胞使用DMEM培养基培养，其中含10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的链霉素，于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中孵育。PC9/GR细胞使用上述培养基维持培养并额外含800 ng/ml的吉非替尼。
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检测细胞对吉非替尼的耐药性：分别取对数生长期的PC9和PC9/GR细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为40 000/ml，接种于96孔板，每孔100 μl细胞悬液，在培养箱中孵育过夜。吸弃96孔板上清液，加入含药培养基（PC9细胞中吉非替尼浓度分别为0、1、5、10、20、40、80、250、500、1 000 nmol/L；PC9/GR细胞中吉非替尼的浓度分别为0、1、10、100、1 000、2 500、5 000、10 000、20 000、40 000 nmol/L），同时设对照组，每组设4个复孔。72 h时吸弃上清液，再加入含CCK8的DMEM，0.5 h后用酶标仪检测A450。
检测毒胡萝卜素对细胞增殖的影响：分别取对数生长期的PC9和PC9/GR细胞同上述处理铺96孔板，贴壁后加入浓度为0.1、1、10、100、1 000、10 000 nmol/L的毒胡萝卜素，同时设对照组，每组设4个复孔。72 h时使用CCK8法检测A450。
检测毒胡萝卜素对PC9/GR细胞耐药的逆转：取PC9/GR对数生长期的细胞同上述处理铺96孔板，设12组，加入吉非替尼的浓度分别为0、4.5、4.5、4.5、4.5、4.5、0、9、9、9、9、9 μmol/L，毒胡萝卜素的浓度分别为0、0、0.1、1、10、100、 0、0、0.1、1、10、100 nmol/L。72 h时用CCK8法检测A450。
检测毒胡萝卜素对PC9/GR细胞耐药的逆转：取PC9/GR对数生长期的细胞同上述处理铺96孔板，设两组，为吉非替尼单药组和联合用药组：其中单药组设7个小组，加入吉非替尼的浓度分别为0、1、10、102、103、104、105 μmol/L；联合用药组设7个小组，每小组加入10 nmol/L的毒胡萝卜素，同时加入浓度分别为0、1、10、102、103、104、105 nmol/L的吉非替尼。72 h时用CCK8法检测A450。逆转倍数（RF）=逆转前的IC50值/逆转后的IC50值。
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取对数生长期的PC9/GR铺6孔板，每孔3×105个细胞，孵育过夜，吸弃上清液，加入含药培养基（对照组为9 μmol/L的吉非替尼组，实验组为9 μmol/L的吉非替尼组+10 nmol/L的毒胡萝卜素联合用药组），孵育72 h后，收集上清液及贴壁细胞，按说明书加入膜联蛋白（Annexin V-PE），室温孵育20 min后，再加入7-AAD，5 min后，收集细胞，流式细胞仪上机检测。
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取对数生长期的PC9/GR铺6孔板，每孔3×105个细胞，孵育过夜，吸弃上清液，加入含药培养基（每孔吉非替尼浓度依次为0、0、4.5、4.5、9、9 μmol/L，毒胡萝卜素浓度依次为0、10、0、10、0、10 nmol/L），培养72 h，去上清液，收集细胞蛋白，BCA法测量样品中总蛋白浓度。蛋白变性后取蛋白样品，使用蛋白印迹法检测IRE1α、ATF-6蛋白表达。
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数据采用GraphPad Prism 9软件进行统计分析，计量资料用（
$ \bar x $ ±s）表示，符合正态分布和方差齐性者采用单因素方差分析的单向分类方差分析（ANOVA），对取得的数据两两比较使用 LSD 检验。以P<0.05 为有统计学意义。 -
吉非替尼对人肺腺癌细胞株PC9和PC9/GR的IC50值经计算分别为0.1019 μmol/L（图1A）和8.912 μmol/L（图1B），按公式计算耐药倍数为87.5（本课题中PC9和PC9/GR细胞株的IC50值分别以0.1 μmol/L和9 μmol/L进行实验）。
图 1 吉非替尼对PC9和PC9/GR细胞增殖率的影响
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毒胡萝卜素对人肺腺癌细胞株PC9和PC9/GR的增殖均有抑制作用，呈剂量依赖性。当毒胡萝卜素浓度为10 nmol/L时，对PC9和PC9/GR的抑制率分别为14.7%（图2A）和4.11%（图2B）。毒胡萝卜素浓度为10 nmol/L时对PC9细胞的增殖显示较弱的抑制作用，而对PCR/GR细胞增殖的作用与对照组相比无统计学差异。抑制率（IR）＝（1−药物组A值/对照组A值）×100%。本课题中，毒胡萝卜素的工作浓度选择10 nmol/L或者围绕10 nmol/L进行设计。
图 2 毒胡萝卜素对PC9和PC9/GR细胞增殖的影响
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相比于吉非替尼单独用药，毒胡萝卜素（浓度依次为0、0.1、1、10、100 nmol/L）和吉非替尼（4.5 μmol/L或9 μmol/L）联合用药72 h时，PC9/GR的细胞增殖率在10 nmol/L和100 nmol/L时显著下降，并且具有统计学差异性（图3A、B）。
图 3 不同浓度的毒胡萝卜素联合吉非替尼对PC9/GR增殖的影响
在不同浓度（0、1、10、102、103、104、105 nmol/L）的吉非替尼联合10 nmol/L的毒胡萝卜素作用后，PC9/GR的细胞增殖率相比吉非替尼单独用药（吉非替尼组浓度依次为0、1、10、102、103、104、105 nmol/L）也出现了下降，具有统计学差异（图4）。计算得出吉非替尼单独用药的IC50值为11.039 μmol/L，联合用药后其IC50值为3.584 μmol/L，其RF为3.15。
图 4 不同浓度的吉非替尼与毒胡萝卜素联合用药对PC9/GR增殖的影响
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与对照组（图5A）、吉非替尼单独作用（图5B）、毒胡萝卜素单独作用（图5）相比，联合用药（图5）后PC9/GR细胞早期凋亡和晚期凋亡的比例均相应增加，并且具有统计学差异（图5）。说明毒胡萝卜素在一定程度上可以改善PC9/GR细胞的耐药性。
图 5 吉非替尼、毒胡萝卜素及两者联合用药对PC9/GR细胞凋亡的影响
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结果显示，与吉非替尼组1或2相比，药物作用后联合用药组1或联合用药组2中PC9/GR细胞的ATF-6及IRE1α蛋白表达均上调（图6A），并且有统计学差异（图6B、C）。ATF-6和IRE1α均是ERS的指标蛋白，说明PC9/GR细胞在药物联合作用后发生了ERS。
图 6 毒胡萝卜素、吉非替尼及两者联合用药对PC9/GR细胞中ATF-6和IRE1α蛋白表达的影响
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肺癌是当今世界最常见、致死率最高的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康[1]。NSCLC是最常见的病理类型，约占所有比例的85%[2]。约70%的NSCLC患者在确诊时已处于晚期，失去了手术的机会。近年来，NSCLC的分子靶向治疗发展迅速，靶向药EGFR-TKIs不断更新，成为放化疗和免疫治疗之外的重要治疗手段之一。
截止目前，EGFR-TKIs已从第1代发展至第3代[3]，且有多款第4代靶向药已进入临床实验阶段。然而由于抗肿瘤耐药性，患者使用靶向药一定时间后不可避免的会出现耐药[4]。于是寻找能够克服肿瘤耐药的药物及方法已经成为肿瘤治疗领域中亟待解决的问题。由于中草药植物的毒副作用小且疗效明确，故从中寻找能够克服肿瘤耐药的成分已经成为一种趋势。毒胡萝卜素是从地中海菊属植物中提取的单体成分[5]，作为常用的ERS的诱导剂，毒胡萝卜素在科研中有着广泛的应用[6]。也有文献报道其有抗肿瘤活性[7]，同时对冠状病毒、合胞病毒、甲型流感病毒等有较强的抑制作用[8]。本研究中使用的吉非替尼耐药细胞株PC9/GR经CCK8实验证明其对吉非替尼具有耐药性。实验结果显示，吉非替尼对PC9的IC50值为0.1019 μmol/L（图1A），对PC9/GR的IC50值为8.912 μmol/L（图1B），耐药倍数为87.6。当毒胡萝卜素浓度为 10 nmol/L时，对PCR/GR细胞增殖的作用与对照组相比无统计学差异，故该浓度的毒胡萝卜素未显示出对PCR/GR的细胞增殖的抑制作用（图2B），故本课题中毒胡萝卜素选择10 nmol/L作为实验浓度。而提高毒胡萝卜素的浓度，其对PC9/GR细胞抑制率也增加，表明毒胡萝卜素本身对于肺腺癌细胞PC9/GR具有抑制作用。实验发现联合用药中当毒胡萝卜素浓度为大于或等于10 nmol/L时，PCR/GR细胞的增殖相比吉非替尼单独用药受到了更强的抑制，并具有显著性差异（图3A、B）。本课题同时使用不同浓度的吉非替尼联合10 nmol/L的毒胡萝卜素共同作用于PC9/GR细胞，结果发现所有联合用药组相比于吉非替尼单独用药组，均对PC9/GR细胞的生长产生抑制作用。分别计算吉非替尼单药和联合用药对PC9/GR细胞的IC50值，发现联合用药的IC50值降低（图4），逆转倍数为3.15。说明10 nmol/L的毒胡萝卜素可以有效改善PC9/GR对吉非替尼的耐药。
肿瘤细胞的耐药性严重影响着患者的预后。耐药突变、自噬、肿瘤免疫微环境都是肿瘤细胞产生耐药的因素[9]。由于耐药突变，EGFR-TKIs治疗已经陷入了研究人员开发新药物与肿瘤细胞产生新耐药突变的循环之中。近年来，因自噬异常与肿瘤发生和进展、细胞死亡及抗肿瘤治疗疗效相联系而受到广泛关注[10]。但是抑制自噬只能延缓EGFR-TKI耐药的产生，并不能有效解决耐药的问题[11]。因此，耐药问题亟待找到新的解决方法。体内低氧、低糖等恶劣环境会导致肿瘤细胞发生ERS，并启动未折叠蛋白反应从而让细胞重新恢复稳态。ERS过度可启动细胞凋亡。因此，ERS也与肺癌治疗息息相关[12]。毒胡萝卜素作为研究ERS常用的激动剂，是一种特异性的肌浆/内质网Ca2+-ATP酶抑制剂，能够使内质网中Ca2+量减少、未折叠蛋白增多，引起ERS[13]。本研究中通过细胞凋亡实验发现，和单独用药相比，毒胡萝卜素联合吉非替尼联合用药可以进一步促进PC9/GR细胞的凋亡（图5B、D和E）。通过蛋白印迹实验证实，联合用药相比吉非替尼单独用药，PC9/GR细胞中ATF-6（图6A、B）和IRE1α蛋白（图6A、C）的表达均上调，表明联合用药后PC9/GR细胞处于ERS状态。这是毒胡萝卜素有效改善PC9/GR对吉非替尼耐药的可能原因之一。
综上所述，体外实验证实毒胡萝卜素低浓度下可以有效促进PC9/GR的ERS，高浓度下对肺癌细胞具有直接杀伤作用，说明毒胡萝卜素本身具有抗肿瘤活性，本课题同时证实，毒胡萝卜素能增强吉非替尼对PC9/GR的杀伤作用。其可能的机制是，在抗肿瘤药物和ERS状态的双重压力下，肺腺癌耐药细胞株PC9/GR对靶向药吉非替尼的敏感性增加。因此，毒胡萝卜素有望成为解决非小细胞肺癌靶向治疗耐药的潜在药物之一，但其中的机制仍需进一步的探索。
Improvement of gefitinib-resistance of PC9/GR by thapsigargin combined with gefitinib
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摘要:
目的 研究毒胡萝卜素（thapsigargin）联合吉非替尼（gefitinib）对人肺腺癌耐药细胞株PC9/GR增殖的影响并探讨可能的机制。 方法 吉非替尼单独用药或吉非替尼与毒胡萝卜素联合应用，通过CCK8实验检测上述两组药物对PC9/GR细胞增殖的影响；应用流式细胞术鉴定两组药物对PC9/GR细胞凋亡的影响；应用Western blotting法检测两组药物对PC9/GR细胞蛋白ATF-6和IRE1α表达的影响。 结果 细胞增殖实验显示，与吉非替尼单独用药相比，联合用药组中PC9/GR的增殖受到更强的抑制作用；凋亡实验显示，相较于吉非替尼单独用药，联合用药能够进一步促进细胞的凋亡；Western blotting法显示，与吉非替尼单独用药相比，联合用药后PC9/GR中ATF-6和IRE1α蛋白（内质网应激标志物）表达上调，其差异具有统计学意义。 结论 在毒胡萝卜素诱导下，PC9/GR细胞对吉非替尼的敏感性增加，其中机制可能与内质网应激有关。 Abstract:Objective To study the effect and mechanism of the thapsigargin combined with gefitinib on the proliferation of human lung adenocarcinoma gefitinib resistance cell line PC9/GR. Methods The cell viability of PC9/GR treated with gefitinib alone or gefitinib combined with thapsigargin was evaluated by CCK8 assay. The flow cytometry was used to analyze the PC9/GR cell apoptosis indued by the two group drugs. The ATF-6 and IRE1α protein expression of PC9/GR cells treated with the two group drugs were detected by Western blotting. Results The group of drug combination exhibited enhanced ability to inhibit cell proliferation, promote cell apoptosis and upregulate the ATF-6 and IRE1α protein expression of the PC9/GR compared with the group gefitinib used alone. Conclusion The sensitivity of PC9/GR to gefitinib was increased when the cells were treated by thapsigargin, which may be related with the state of endoplasmic reticulum stress（ERS） induced by thapsigargin. -
Key words:
- gefitinib /
- thapsigargin /
- tumor drug resisdance /
- apoptosis /
- endoplasmic reticulum stress
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人口老龄化、慢性病发病率增加、高价新药持续推出等因素使得全球医疗卫生支出迅速增长。为了控制药品费用，降低医疗费用开支，各国政府纷纷出台鼓励仿制药品研发和使用的政策[1]。研究显示，2003年—2012年，仿制药的替代为美国节省了超过1.5万亿美元的费用[2]。2018年，我国三级医院的患者门诊年人均费用为322.1元，其中药品费用占42.2%[3]，通常发达国家药品费用占20%[4]。而我国，广大公众的医疗消费水平还不高，质优价廉的仿制药仍是满足我国公众基本用药的重要来源和手段。近年来，国务院从国家战略层面提出开展仿制药质量一致性评价，以提高仿制药质量和用药可及性。尤其是在2018年11月，为了降低医疗开支，控制药品费用，国家组织了在北京、天津、上海、重庆4个直辖市和沈阳、大连、厦门、广州、深圳、成都、西安7个城市(简称“4+7”城市)试点药品集中带量采购。各试点城市委派代表组成联合采购办公室，代表公立医疗机构实施集中采购，兼顾药品采购数量和中标价格，通过以“量”换“价”的方式，促进仿制药替代原研药使用，达到合理降低药品费用的目的[5]。2019年2月29日，上海市发布了《关于本市执行“4+7”城市药品集中采购中选结果的通知》，正式公布了“4+7”中选品种及执行时间，要求上海市所有医保定点医疗机构于3月20日正式统一执行。
本研究通过评估该政策实施对上海市某公立三级综合医院门诊治疗心血管疾病的仿制药与原研药的利用情况的影响，分析仿制药替代策略带来的经济效益，为完善相关药物政策提供实证依据。
1. 资料与方法
1.1 目标疾病与目标药物
本研究根据《中国高血压防治指南2018年修订版》[6]中常用降压药及《冠心病合理用药指南第2版》[7]中常用治疗冠心病药对照该院药品使用目录，选择使用比例高，既有仿制药又有对应原研药的口服固体制剂品种。由于缓、控释剂型与普通制剂成本不同，所以本研究均选取相同剂型药物。另外，为了进行对比，单独选取了中选带量采购品种的原研药福辛普利作为对照（该药品没有对应仿制药品种），分析其在带量采购政策实施前后的药物利用状况的变化，并与其他仿制药进行比较。
共选取高血压和冠心病的目标药物11种，分别是治疗高血压的降压药物：硝苯地平、氨氯地平、缬沙坦、厄贝沙坦氢氯噻嗪、坎地沙坦、替米沙坦、替米沙坦氢氯噻嗪、奥美沙坦；治疗冠心病的药物：氯吡格雷、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀。其中氨氯地平、厄贝沙坦氢氯噻嗪、氯吡格雷、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀5个仿制药品种为带量采购目录品种（其对应原研药未中选带量采购），即中选品种，其余6个仿制药及其对应的原研药品种均为非带量采购目录品种，即未中选品种。
1.2 数据来源
数据来源于上海市某三级医院的药品信息管理系统，分别抽取2018年4月1日至9月30日及2019年4月1日至9月30日该院用药数据，包括药品使用量、销售金额等。本研究采用世界卫生组织（WHO）官方网站提供的药物限定日剂量（defined daily dose, DDD）确定各药物的DDD值。因为高血压的复方制剂厄贝沙坦氢氯噻嗪和替米沙坦氢氯噻嗪无法在WHO网站直接查询到DDD值，所以根据WHO发布的《ATC分类和DDD分配指南（2020）》[8]分配原则，可以采用日维持剂量，且DDD值为每日给药的片数。
1.3 方法
1.3.1 使用数量和使用金额占比
医院药品零加成后，医院销售价等于采购价，统一采用药品采购价作为研究对象。研究时间分两组：政策实施前（2018年4月至9月）和政策实施后（2019年4月至9月）。研究中某一种药物的使用数量可以标化为该药品的用量(DDDs)，DDDs =某药品的消耗总剂量(mg)/该药DDD值(mg), DDDs反映了某药物的使用人数和人均使用频率，该值越大，表明使用人数越多或人均使用率越高[9]；用一个DDD的购买费用作为该药物的日费用，以此反映该药物的可负担性。日费用(DDDc)=[某药品采购价/该药每盒的剂量(mg)]×该药DDD值(mg)。
中选和未中选原研药或者仿制药的使用数量和金额占比为该组内对应类型原研药或仿制药的DDDs和使用金额，分别除以原研药和仿制药的使用数量总DDDs和使用总金额。原研药或者仿制药的使用数量和金额占比为两种类型的原研或仿制药使用数量和金额占比的总和。
1.3.2 日费用及使用数量
以每组中选和未中选原研药或仿制药DDDc的加权平均费用作为研究对象，观察政策实施前后两种类型原研药及仿制药的日费用和使用数量的变化情况。原研药和仿制药DDDc是所有原研或仿制药DDDc的加权平均价格。
1.3.3 潜在费用节省率
因为药品的品种一直处于动态变化之中，而且每年的就诊人数在不断增长，本研究分别将政策实施前后的仿制药及原研药的数据进行分析，得到每个目标药品的日费用比及潜在费用节省情况。
仿制药与原研药的日费用比=仿制药DDDc/原研药DDDc×100%。
潜在节省的药品费用是指如果药物使用量不变，以仿制药替代原研药可以节省的费用。潜在费用节省率是指某药品节省的费用除以该原研药在4月至9月的使用金额。
节省费用(P)=Σ(原研药DDDc-仿制药DDDc)×原研药DDDs
潜在费用节省率=（P/原研药4月至9月使用金额）×100%
2. 结果
2.1 使用数量和使用金额占比
政策实施前后原研药和仿制药使用数量及使用金额占比见表1。
表 1 带量采购政策实施前后原研药和仿制药使用数量及使用金额占比(%)时间 未中选药品数量占比 中选药品数量占比 未中选药品金额占比 中选药品金额占比 原研 仿制 原研 仿制 原研 仿制 原研 仿制 2018.04-09 38.74 6.08 45.58 9.60 26.44 2.39 59.59 11.59 2019.04-09 33.89 7.95 24.22 33.94 38.93 4.76 39.23 17.07 由表1可知，政策实施后，未中选和中选的原研药使用数量占比都呈现下降趋势，分别下降了12.52%和46.86%。未中选原研药使用金额占比呈现上升趋势，上升了47.24% ，而中选原研药使用金额占比下降了34.17%。未中选和中选的仿制药使用数量占比和金额占比都呈上升趋势，使用数量占比分别上升了30.76%、253.54%，使用金额占比分别上升了99.16%、47.28%。所有目标药物原研药使用数量和使用金额占比呈现下降趋势，使用数量占比下降更快。使用数量占比由84.32%下降至58.12%，降幅为31.07%；使用金额占比由86.02%下降至78.16%，降幅为9.14%。仿制药的使用数量和使用金额占比都呈现上升趋势，其中使用数量占比上升更快，上升了167.09%，使用金额占比上升了56.22%。
2.2 日费用及使用数量
带量采购政策实施前后目标药品原研药和仿制药DDDc、DDDs及使用总金额见表2和表3。
表 2 带量采购政策实施前后原研药和仿制药的日费用(单位：元)时间 未中选药品的DDDc 中选药品的DDDc 仿制药DDDc 原研药DDDc 仿制药/原研药价格比(%) 原研 仿制 原研 仿制 2018.04-09 4.61 2.65 8.83 8.16 6.02 6.89 0.87 2019.04-09 4.46 2.33 6.29 1.95 2.02 5.22 0.39 表 3 带量采购政策实施前后原研药和仿制药的总用量及总金额时间 未中选药品DDDs 中选药品DDDs 仿制药DDDs 原研药DDDs 使用总金额（万元） 原研 仿制 原研 仿制 2018.04-09 633 248 99 460 745 059 156 859 256 319 1 378 307 1 104.35 2019.04-09 611 842 143 490 437 290 612 604 756 095 1 049 132 700.72 由表2和表3可知，政策实施后，总的药品使用数量增加了10.44%，使用总金额却下降了36.55%。11种目标药物原研和仿制品种的DDDc均呈下降趋势，但是仿制药下降幅度更大，降幅达到66.45%，而原研药价格降幅为24.24%；仿制药与原研药在两组中加权平均日费用的比值从0.87下降到0.39，费用差距明显变大。未中选的原研药DDDc下降了3.25%，中选的下降28.77%；而仿制药则分别下降了12.08%、76.10%。相比于政策实施前，原研药使用量呈现下降趋势，下降了23.88%；而仿制药使用量呈现上升趋势，上升了194.98%，仿制药使用率明显提高。其中未中选和中选的原研药使用数量分别下降3.38%、41.31%；仿制药分别增加44.27%、290.54%。对照药品中选原研品种福辛普利的DDDs由3099增加到5451，增加了75.90%，DDDc由4.20元下降至1.26元，下降了70.00%。福辛普利日费用下降幅度与中选仿制药品种相似，且远高于未中选原研药的下降幅度，但其使用量的增加幅度不如中选仿制药品种，可能与该药本身临床应用较少有关。
2.3 仿制药与原研药日费用比和潜在费用节省率
带量采购政策实施前后各目标药物仿制药与原研药日费用比和潜在费用节省率见表4和表5（表格中药企名称为简称）。
表 4 带量采购政策实施前11种药物仿制药与原研药日费用比及潜在费用节省率药品名 仿制药DDDc（元） 原研药DDDc（元） 原研药企 仿制药/原研药日费用比 原研药DDDs 潜在节省费用（万元） 硝苯地平控释片 2.64 4.02 拜耳 0.66 151 130 20.79 氨氯地平片① 1.95 4.43 辉瑞 0.44 165 592 41.18 缬沙坦胶囊 2.58 5.17 诺华 0.50 165 494 42.89 厄贝沙坦氢氯噻嗪片① 2.62 4.53 赛诺菲 0.58 70 791 13.52 坎地沙坦酯片 2.18 5.17 武田制药 0.42 51 107 15.26 替米沙坦片 2.00 2.66 勃林格殷格翰 0.75 132 790 8.82 替米沙坦氢氯噻嗪片 4.60 5.49 勃林格殷格翰 0.84 21 644 1.93 奥美沙坦酯片 4.66 6.49 第一三共制药 0.72 111 083 20.30 氯吡格雷片① 10.08 17.13 赛诺菲 0.59 151 375 106.83 阿托伐他汀钙片① 6.12 8.53 辉瑞 0.72 240 765 57.99 瑞舒伐他汀钙片① 6.88 7.53 阿斯利康 0.91 116 536 7.52 潜在节省费用总计 337.03 费用节省率，% 35% 注：①表示该药品为“4+7”带量采购目录中药品 表 5 带量采购政策实施后11种药物仿制药与原研药日费用比及潜在费用节省率药品名 仿制药DDDc（元） 原研药DDDc（元） 原研药企 仿制药/原研药
日费用比原研药DDDs 2019年实际
总节省
费用（万元）潜在节省费用
（万元）硝苯地平控释片 1.62 4.02 拜耳 0.40 172 242 –8.19 41.26 氨氯地平片① 0.59 3.26 辉瑞 0.18 102 340 40.45 27.28 缬沙坦胶囊 2.53 5.01 诺华 0.51 153 188 6.96 37.92 厄贝沙坦氢氯噻嗪片① 2.18 3.67 赛诺菲 0.59 42 280 15.96 6.31 坎地沙坦酯片 2.18 4.45 武田制药 0.49 49 105 4.48 12.56 替米沙坦片 1.54 2.54 勃林格殷格翰 0.61 119 014 3.64 11.82 替米沙坦氢氯噻嗪片 4.60 5.39 勃林格殷格翰 0.85 16 639 1.37 1.31 奥美沙坦酯片 4.59 6.49 第一三共制药 0.71 101 654 3.89 19.27 氯吡格雷片① 3.34 13.10 赛诺菲 0.25 74 032 191.82 72.26 阿托伐他汀钙片① 0.94 6.11 辉瑞 0.15 137 977 123.19 71.29 瑞舒伐他汀钙片① 1.31 5.54 阿斯利康 0.24 80 661 20.07 34.13 节省费用总计 403.63 333.99 费用节省率，% 61% 注：①表示该药品为“4+7”带量采购目录中药品 政策实施前后，11种目标药物仿制药与原研药的日费用比分别在0.42～0.91、0.15～0.85之间。两组中日费用比差异最大的分别是坎地沙坦酯片和阿托伐他汀钙片，最小的是瑞舒伐他汀钙片和替米沙坦氢氯噻嗪片。该政策实施后，原研药和仿制药销售总金额减少了403.63万元。如果将政策实施前后目标药品原研药全部替换成仿制药，则该医院分别可节省潜在费用为337.03、333.99万元；潜在费用节省率为35%、61%。由于带量采购政策实施后，除硝苯地平、替米沙坦、阿托伐他汀和瑞舒伐他汀外，原研药品种使用数量下降，而原研药与仿制药DDDc差值下降并不明显，导致潜在节省费用减少了66.41万元，故政策实施后潜在节省费用下降不是十分明显。因为潜在节省费用变化不大，而原研药使用金额却大幅下降，所以潜在费用节省率相对于政策实施前变化十分明显。
3. 讨论
3.1 带量采购政策对仿制药替代和药品费用的影响
带量采购政策实施后，仿制药使用数量DDDs大幅增加，原研药使用数量下降，患者的药品费用明显减少。仿制药使用数量急剧上升是因为大部分中选品种为仿制药，该政策执行下，医院每月必须要完成约定额度的中选品种使用数量，否则将受到处罚，如政府部门减少对医院改革的奖励资金、取消医院的医保定点资格以及降低医院的等级等[10]。同时对医生处方用药产生一定的行政压力，如医院对未优先使用带量采购药品的医生进行经济惩罚和约谈等，利用行政措施促使医生使用中选品种。由于以量换价政策的实施，药品价格降低，在医生和药师的用药教育下，部分患者愿意接受效果相同而价格更低的仿制药进行治疗。并且中选药品价格下降对未中选的药品产生“波纹效应”[11]，导致药品的整体价格下降。
3.2 带量采购政策对仿制药使用的数量和金额占比产生影响
政策实施后，11种目标药品仿制药使用数量及金额占比上升明显，如仿制药使用金额占比分别由13.98%上升到21.84%，这一结果与北京市85家二、三级公立医院调查的结果相似，其心血管类仿制药金额占比为18.93%[12]。然而，长期以来，在医师和患者中业已形成了仿制药质量和疗效远不及原研药的认知。只有保证仿制药质量和效果与原研药相同，仿制药才能真正的替代原研药，因此我国仍需要加快仿制药一致性评价。研究中发现仿制药使用率低于原研药，可能与医生的处方习惯和患者对仿制药的态度有关。本文未中选品种有一半以上，医生受到的带量采购政策的约束较少，在临床诊疗过程中，可能会优先选择同样治疗心血管疾病且存在原研产品的药物。虽然药监部门宣称仿制药与原研药拥有相同的质量和疗效，但临床疗效评价的真实世界证据的缺乏，使医生和患者对于仿制药的效果仍然有很多顾虑[13]。因此，政府部门应鼓励相关企业和医疗机构开展仿制药与原研药一致性研究，确证仿制药在临床实际使用过程中是否能够真正有效替代原研药，并及时公布相关研究结果。同时，需要制定更详细的临床用药指南来规范医师的处方行为；完善奖励机制，鼓励医生和药师优先使用仿制药，如向医生和患者普及仿制药的相关知识，提高仿制药的替代使用率。对仿制药宣传教育活动进行适当的资金支持；扩大在权威媒体上的宣传；积极进行社区教育，帮助患者了解仿制药和一致性评价制度，减少医患之间的矛盾。
3.3 带量采购政策对原研药与仿制药价格差异的影响
政策实施后11种目标药物的原研药比仿制药价格高出548.03%～17.15%，大部分药品超过了原研与仿制药价格差应在30%以下的规定[14]。这一结果与我国某省198个样本药品调查结果吻合，该省原研药与仿制药价格差异倍数的均值为3.6倍[15]。原研药因其质量优势通常与仿制药实行区别定价，缺乏竞争导致价格水平较高，仿制药竞争激烈导致价格较低。并且带量采购政策实施后，仿制药价格下降明显，原研药价格降幅较小，导致原研药与仿制药价格差进一步增大。因此，政府应该发挥主导作用，加强对原研和仿制药品价格的监管力度；药品企业在降价时，应该以保证药品质量为前提，遵循经济规律，避免出现过去集中招标采购的断供和弃标现象。
综上，带量采购政策实施后，心血管类原研药使用数量和金额下降，仿制药使用数量上升，患者的药品费用支出减少；仿制药的替代率仍然较低，存在很大的费用节省空间；原研药与仿制药价格差距增大。本文中，带量采购政策实施对药物利用的经济性方面产生了积极影响。带量采购的目的，通过促进竞争，推动药品降价和仿制药替代，通过量价挂钩、及时回款降低医药企业销售费用和财务成本，进一步降低药品价格。通过设定质量门槛，让患者以更低廉的价格用上质量高效的药品。本文发现政策实施后药品价格下降，仿制药替代效应明显， DDDc下降的同时DDDs上涨，总体使用金额下降，改革基本达到预期目标。当然，带量采购还面临着如何保障质量、如何提升药品企业参与一致性评价的积极性、医院使用中选药品的积极性等挑战，需要配套政策加以完善。比如，应当进一步加大仿制药替代原研药的政策宣传，扩大政策实施的范围，加快仿制药一致性评价进程和采取措施避免原研药与仿制药价格差距的扩大。
本研究不足之处是在上海市的1家公立三级医院进行的研究，仅选择了治疗心血管疾病的11种药物，分析范围有一定局限性。未来的研究可以进一步扩大研究范围，将该城市不同级别医院都作为研究对象，按照治疗的不同疾病，分析各药品的原研药和仿制药使用情况，提供更全面的参考。
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图 3 不同浓度的毒胡萝卜素联合吉非替尼对PC9/GR增殖的影响
A. 吉非替尼取0.5倍的IC50值的浓度与毒胡萝卜素联合作用对PC9/GR细胞增殖的影响；B. 吉非替尼取IC50值的浓度与毒胡萝卜素联合作用对PC9/GR细胞增殖的影响*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001,与吉非替尼组比较。
图 5 吉非替尼、毒胡萝卜素及两者联合用药对PC9/GR细胞凋亡的影响
A. 对照组；B. 吉非替尼组（9 μmol/L）；C. 毒胡萝卜素组（10 nmol/L）；D. 联合用药组，吉非替尼浓度为9 μmol/L，毒胡萝卜素浓度为10 nmol/L；E. 凋亡数据统计图**P<0.01,与吉非替尼组比较。
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