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河豚毒素（TTX）是一种强效生物毒素，是目前已知毒性最强的生物毒素之一，主要存在于河豚鱼和部分海洋生物中。据报道，河豚毒素能与电压门控钠离子通道1∶1结合，阻断钠离子内流，从而发挥抑制兴奋的作用[1]。基于其对钠离子通道不同亚型的阻断，河豚毒素在一定剂量范围可以起到镇痛、局麻等多种药用效果[2-6]。其中镇痛效用为当前主要研究领域，相较于临床常用的阿片类药物，河豚毒素发挥镇痛作用无成瘾性，副作用小，肝肾功能损害小，但其治疗剂量极低，且治疗窗口狭窄，低剂量往往带来频繁的给药次数，要想良好的发挥镇痛作用，就需要选取合适的剂型来更好的发挥其作用。微球作为长缓释制剂的优良载体，经常包载治疗窗狭窄、半衰期较短的药物以发挥长周期药效的作用，为测定微球中TTX含量等数据，需要一套适用的检测方法。
目前针对河豚毒素定量检测的方法多为生物样本检测，应用于动物体内河豚毒素检测和人河豚毒素中毒血液检测，针对河豚毒素的体外测定方法较少，药用制剂的检测方法更是稀少。本方法的建立适用于河豚毒素药用制剂中的含量检测，为河豚毒素药用开发的含量测定提供了新选择。主流的河豚毒素含量测定方法包括小鼠生物法[7-8]、免疫测定法[9-11]、高效液相色谱法（HPLC）[12-13]、液相色谱-质谱联用法[14-16]、气相色谱-质谱联用法[17]等。高效液相色谱法因其适用性广、稳定性好及灵敏度良好而备受欢迎。但由于河豚毒素不溶于任何有机溶剂，仅溶于弱酸水溶液，常见的方法难以较好地保留河豚毒素。本研究使用庚烷磺酸钠作为离子对试剂，通过河豚毒素与离子对试剂结合形成复合分子，提高其在色谱柱上的保留能力，从而更好地分离河豚毒素与其他物质 [18-19]。
根据河豚毒素的作用功效和缓释长效镇痛目标，本研究制备了河豚毒素缓释微球。为考察微球中河豚毒素的含量，需要建立相应的含量测定方法。因此，本研究采用HPLC方法建立针对河豚毒素缓释微球的含量分析方法，以期为河豚毒素微球中的含量测定提供依据。
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LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；电子天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；数显pH计（sartorius，德国），紫外可见分光光度计[安捷伦科技（中国）有限公司]；循环水式真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；SECURA125-1CN型十万分之一电子天平（赛多利斯，德国）；Arium@ mini超纯水机（赛多利斯，德国）。
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河豚毒素标准品（98%，中洋生物科技股份有限公司）；PBS缓冲液（武汉普诺赛生物科技有限公司）；聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA, RG 503H，sigma-Aldrich Company）；甲酸（色谱纯，国药集团）；三氟乙酸（色谱纯，sigma-Aldrich Company）；氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；泊洛沙姆-188（sigma-Aldrich Company）；叠氮钠（Sigma-Aldrich Company）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；乙腈（色谱纯，sigma-Aldrich Company）；二氯甲烷（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；河豚毒素-PLGA微球、空白PLGA微球（海军军医大学药剂学教研室提供）。
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色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：8 mmol/L庚烷磺酸钠（0.005%TFA，1 mol/L NaOH调节pH4.0）水溶液∶乙腈=95∶5；检测波长：200 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；分析时间：12 min；进样量：20 μl。
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精密称取叠氮钠、泊洛沙姆-188适量，加入磷酸盐缓冲液配制成含0.02%NaN3、0.02%F-68的释放介质，取10 mg河豚毒素标准品，用6 ml 0.1%甲酸溶液溶解，以PBS介质（0.02%NaN3、0.02%F-68）定容得100 μg/ml的对照品溶液。
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精密称取20.00 mg河豚毒素冻干微球，加入1 ml二氯甲烷（DCM）超声使完全溶解，加入经甲酸调节pH至4.0的释放介质，超声后充分振摇，取上层水相溶液过0.22 μm水系滤膜作为供试品溶液。
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配制以下样品，考察方法专属性：① 1ml PBS释放介质加入50 μl 1%甲酸，为空白释放介质；② 甲酸调节pH的PBS介质稀释得的10 μg/ml TTX标准品溶液；③ 精密称取10 mg空白微球于5 ml EP管，加入1 ml二氯甲烷超声2 min使完全溶解，加入1 ml PBS介质及50 μl 1%甲酸，充分振摇后超声10 min，取上层水相过0.22 μm水系膜，为空白微球样品；④ 精密称取10 mg 空白微球于5 ml EP管，准确加入10 μg/ml TTX标准液1ml，加入1 ml二氯甲烷超声2 min使完全溶解，甲酸调节pH的PBS溶液提取，过膜处理后为河豚毒素微球样品。按照“2.1”项下方法进样检测，图谱如图1。实验结果表明，该方法专属性良好，河豚毒素得到了较好的分离。
图 1 色谱系统适应性考察色谱图
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精密量取对照品溶液于10 ml量瓶，加入PBS介质，分别稀释得20、15、12、10、5、2、1 μg/ml的系列浓度标准液。按照“2.1”项下方法进样检测，记录TTX峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，河豚毒素的浓度（Xr μg/ml）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=22 216X+591.8，r=0.999 9，证明本方法在1~20 μg/ml浓度范围内线性良好。
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由对照品溶液配制低、中、高三个浓度的河豚毒素标准液，分别为2、10、20 μg/ml，进行日内精密度及日间精密度测定。日内精密度测定方法为样品测定5次，计算日内相对偏差；日间精密度测定法为3个浓度样品连续测定5 d，计算日间相对偏差。3个浓度由低到高的日内精密度RSD值分别为0.81%、0.43%、0.58%，日间精密度RSD值分别为1.32%、1.10%、0.68%，均小于2.0%，符合精密度要求。
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按照“2.2.2”项下方法，平行制备5份河豚毒素供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示，RSD值为1.49%，表明该方法重复性良好。
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选取低、中、高3个浓度标准溶液，分别为2、10、20 μg/ml，称取10 mg空白微球于5 ml EP管，加入1 ml 二氯甲烷超声溶解和1 ml 标准溶液及50 μl 1%甲酸，充分振摇后超声10 min，超声后取上层水相过膜进样检测，计算回收率，结果见表1。
表 1 河豚毒素加样回收率试验结果（n=3）
加入量（μg/ml） 测得量（μg/ml） 回收率（%） RSD（%） 2 1.96 1.98 1.99 98.88±0.82 0.83 10 10.04 9.96 10.00 100.00±0.43 0.43 20 20.04 20.18 20.08 100.49±0.37 0.37 试验结果表明，低、中、高3个浓度的回收率均在98.0%~102.0%之间，3组不同浓度的RSD均小于2%，符合方法学要求。
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为了考察该方法能否测定微球中还未释放的河豚毒素含量，本实验进行微球中药物含量测定。精密称取河豚毒素-PLGA微球20 mg，加入0.5 ml DCM超声溶解，再加入1%甲酸调节pH至4的PBS溶液2.5 ml，充分振摇后超声10 min，取上清液过膜后进样检测。测定河豚毒素浓度为2.52 μg/ml，换算后计算微球包封率（EE）及载药量（DL），计算方法如下：
$$ \begin{split} &\text{包封率}({\%})=\frac{\text{微球内药物量}}{\text{投入总药物量}}\times 100\\&{\text{载药量}}({\%})=\frac{\text{微球中包含药物量}}{\text{微球总重量}}\times 100 \end{split}$$ 换算可得微球包封率为60.77%，载药量为0.024%。因此，通过此方法可以计算微球的载药量和包封率，为下一步微球释放情况考察时通过测定微球中未释放含量从而间接测定微球的释放量提供依据。
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由于河豚毒素溶液受温度影响较大，温度越高，河豚毒素降解越快，在微球长期释放过程中，已释放的河豚毒素发生降解会影响体外释放的测定，故对河豚毒素标准品溶液进行4、25、37 ℃条件下释放介质中的稳定性考察，样品pH均为7.4。4 ℃和25 ℃样品分别在第1、3、5、7、 14、 21、28天取样检测；37 ℃样品在第1周每天取样，其后隔天取样。取12 μg/ml TTX标准品溶液分别置于4、25、37 ℃，100 r/min条件下考察，用于测定TTX在体外释放条件下稳定性，结果见图2。
图 2 河豚毒素温度稳定性降解曲线
结果表明，河豚毒素在水溶液中稳定性受温度影响比较大。28 d考察中，河豚毒素在4 ℃放置降解约1.53%，25 ℃放置降解约32.67%，37 ℃放置降解约74.96%。所以，在河豚毒素微球释放测定时不能直接测定释放介质中的河豚毒素含量，而应测定微球中还未释放的河豚毒素含量，从而间接测定微球的释放。
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目前针对河豚毒素定量检测的方法多为生物样本检测，应用于动物体内河豚毒素检测和人河豚毒素中毒血液检测，针对河豚毒素的体外测定方法较少，药用制剂的检测方法更是稀少。本方法的建立适用于河豚毒素药用制剂中的含量检测，为河豚毒素药用开发的含量测定提供了借鉴。
针对河豚毒素微球的含量测定，我们尝试了许多方法，发现常规的反相色谱法对这类物质分离度不高，而反相离子对色谱法分离效果好。为了取得更佳的分离效果，分别考察了Agilent Zorbax SB-C8柱（4.6mm×150mm, 5μm）、shim-pack GIST C18-AQ（4.6mm×250mm, 5μm）、Agilent Zorbax SB C18柱（4.6mm×150mm, 5μm）等不同色谱柱对河豚毒素的分离效能及峰型的影响。结果显示，当色谱柱为Agilent Zorbax SB C18柱时，河豚毒素的分离效果及峰形最佳。
在离子对色谱法中，河豚毒素的分离及峰型等受到多种因素影响，在该方法建立过程中，我们考察了流动相pH、流动相比例等条件对河豚毒素分离效果的影响。流动相pH：我们考察了流动相中pH3.0、4.0、4.5和5.0，不同pH对其峰型有一定的影响，对比筛选后，我们确定了pH4.0时为最佳峰型。流动相比例：流动相比例对TTX出峰时间存在较大的影响，我们考察了90∶10、92∶8、94∶6、95∶5、98∶2等比例，保留时间在4~25 min不等，在保证出峰完整的情况下，调整进样时间至适宜，最终确定比例为95∶5。
微球中的河豚毒素提取我们尝试了不同的有机溶剂破乳，其中包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈等有机溶剂，最终选用速度最快、溶解最完全的二氯甲烷溶剂破乳提取。
结果证明选用本方法测定缓释微球中的河豚毒素在一定浓度范围内线性良好，专属性强，精密度和回收率均符合方法学要求，可以作为TTX微球含量、释放量的测定方法。
Establishment of determination of tetrodotoxin sustained-release microspheres
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摘要:
目的 建立测定河豚毒素（TTX）缓释微球中的含量检测方法。 方法 采用HPLC法，色谱柱为Agilent Zorbax SB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为5％乙腈-95％ 8 mmol/L庚烷磺酸钠溶液（0.005％TFA，pH4.0）；流速1.0 ml/min；紫外检测波长200 nm；柱温30 ℃。 结果 该方法专属性好，TTX在1~20 μg/ml浓度范围内线性良好，该方法日内精密度、日间精密度、稳定性、重复性均符合要求，加样回收率范围为98.0%~102.0%。 结论 本研究建立了适用于缓释微球中河豚毒素含量测定的HPLC方法，该方法准确可靠，专属性强，可以实现定量检测。 Abstract:Objective To establish a detection method for the determination of tetrodotoxin (TTX) in sustained-release microspheres. Methods The HPLC separation of tetrodotoxin was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18 column (4.6mm×150mm,5 μm) with acetonitrile, 8mmol/L sodium heptane sulfonate containing 0.005% TFA (5:95) (pH 4.0) as the mobile phase. The flow rate was 1.0 ml/min. The UV detection wavelength was 200 nm and the column temperature was 30 °C. Results The method had good specificity and linearity of TTX in the concentration range of 1−20 μg/ml. The intra-day precision, inter-day precision, stability and repeatability of the method were good, and the average recoveries were found between 98.0% and 102.0%. Conclusion This study established an HPLC method which was suitable for the determination of tetrodotoxin sustained-release microspheres. The method is accurate and reliable within the applicable range, with strong specificity, which could lead to quantitative detection. -
Key words:
- Tetrodotoxin /
- HPLC /
- sustained-release microspheres /
- sodium heptane sulfonate
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据国际癌症研究机构（IARC，https://www.iarc.who.int/）提供的数据显示，2020年女性乳腺癌现已成为全球最常见的癌症之一[1]。其中有15%～25%的乳腺肿瘤存在人类表皮生长因子受体2（HER2）过表达。HER2阳性的乳腺癌浸润性强、无病生存期短、预后差，对化疗敏感性差，且易复发[2]。曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。虽然曲妥珠单抗单药对乳腺癌治疗起到了很好的改善的效果, 但其疗效还有所不足，如对HER2过表达的乳腺癌患者初次治疗有效率仅在30%左右[3]。EGCG是绿茶中主要的多酚[4]，有抑制肿瘤细胞生长、增殖、转移和血管生成，诱导细胞凋亡和增强抗肿瘤免疫等多种抗肿瘤作用[5-9]。据报道，EGCG在乳腺癌、胃癌、白血病、膀胱癌治疗中均显示有抗肿瘤作用[10-13]。本实验旨在探讨曲妥珠单抗与EGCG对HER2过表达细胞株是否具有协同增殖抑制作用，为HER2高表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
EGCG（MedChemExpress公司），CCK-8检测试剂盒（美国bimake生物科技有限公司）；GAPDH一抗、AKT一抗、p-AKT一抗、MAPK一抗、p-MAPK一抗、EGFR一抗、p-EGFR一抗、HER2一抗、p-HER2一抗、抗兔IgG一抗、抗鼠IgG一抗、HRP抗体二抗（美国Cell Signaling Technology公司），凝胶过滤层析标准品（美国BIO-RAD公司），二抗Goat pAb to Human IgG（英国Abcam公司）。
1.1.2 细胞株
人乳腺癌细胞系BT474、SK-BR-3（购自中国科学院细胞库并保存于本实验室）。
1.1.3 仪器
AKTA Avant 25蛋白纯化仪、Imager 600超灵敏多功能成像仪（美国Cytiva公司）； Agilent 1200 series高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Spark多功能酶标仪（瑞士TECAN）； Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪（德国赛多利斯）。
1.2 方法
1.2.1 曲妥珠单抗的表达与纯化
用含有曲妥珠单抗重链和轻链表达载体的质粒共转染Expi293F细胞7 d后收集培养上清液，用Protein A亲和层析法进行纯化。SEC-HPLC对抗体的纯度进行检测，并用流式细胞术检测曲妥珠单抗抗体与HER2过表达细胞株SK-BR-3、BT474的结合活性。
1.2.2 流式细胞术
细胞按3×104个细胞/孔铺于V型底96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗按100 nmol/L的起始浓度，3倍比稀释，分成11个浓度梯度，末孔为PBS作为阴性对照，加入铺有细胞的96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗与细胞4℃共孵育1～2 h，用含0.1% BSA的PBS洗1遍，加入二抗Goat pAb to Human IgG，1∶200稀释，每孔30 μl，4℃孵育30 min。二抗孵育结束，用含0.1% BSA的PBS洗2遍，每孔加入30 μl 含0.1% BSA的PBS，用 Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪进行检测。
1.2.3 细胞培养
采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养SK-BR-3细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养BT474细胞，培养条件为5% CO2，37℃。当细胞密度达到80%～90%时进行传代，每周2～3次。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.4 CCK8检测细胞增殖
将细胞按1×104个细胞/孔的数量接种于96孔板中，在37℃、5% CO2条件下培养24 h。每孔加入100 μl含设定浓度药物的培养基，培养48 h后，弃去孔内培养基，每孔加入100 μl含10%CCK8试剂的培养基，继续培养1～3 h，用酶标仪在450 nm测定光密度值（A），并计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（A对照−A实验）/（A对照−A背景）。联合给药组用CompuSyn软件计算CI值（药物联合指数），通过CI值的数值可以定量判断药物间相互作用的强度以及性质（CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用；CI<1为协同作用）。
1.2.5 Western blot检测
根据分组将细胞按5×105个细胞/孔的数量接种于6孔板培养24 h。弃去原培养基，加入含设定浓度药物的培养基继续培养24 h。采用细胞裂解液试剂盒提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按每泳道30 μg蛋白样品的上样量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。一抗、二抗均按照抗体使用说明书稀释。洗膜后，加ECL发光液，用超灵敏多功能成像仪进行显影，并用ImageJ软件对条带进行灰度值分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值 。
1.2.6 统计学方法
采用 GraphPad prism 8.0软件（Version X，USA）进行统计学分析和作图，用compuSyn软件计算联合指数。两组数据之间比较采用t检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 SEC-HPLC检测曲妥珠单抗的纯度
将表达纯化后的曲妥珠单抗用SEC-HPLC进行检测，结果显示曲妥珠单抗的纯度为100%，且分子量大小在150 kDa（1kDa=1×103）左右（图1）。
2.2 流式细胞术验证曲妥珠单抗与SK-BR-3、BT474的结合活性
采用流式细胞术测定曲妥珠单抗与HER2过表达乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474的结合活性。结果显示，曲妥珠单抗以浓度依赖性的方式结合SK-BR-3和BT474细胞，其中，曲妥珠单抗与SK-BR-3细胞株结合的EC50值为1.128 nmol/L，与BT474细胞株结合的EC50值为1.203 nmol/L，两者EC50值大约一致（图2）。
2.3 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对BT474的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对BT474的增殖抑制作用。图3A和图3B结果显示， EGCG和曲妥珠单抗对BT474细胞均显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图3C结果显示EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图3D结果显示EGCG在一定浓度范围内（45～200 μmol/L）与16.67 nmol/L 曲妥珠单抗联用时显示有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 3 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞增殖的影响注：A.EGCG对BT474细胞增殖的影响；B.曲妥珠单抗对BT474细胞增殖的影响；C.16.67 nmol/L曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、45 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与45 μmol/L EGCG联用对BT474细胞增殖的影响；D.16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对BT474细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；*P<0.05，****P<0.0001，与空白组比较；△△△△P<0.0001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.4 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对SK-BR-3细胞的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对SK-BR-3的增殖抑制作用。图4A和图4B结果显示，EGCG和曲妥珠单抗均对SK-BR-3细胞显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图4C结果显示，EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图4D结果显示，EGCG在一定浓度范围内（7.5～120 μmol/L）与16.67 nmol/L曲妥珠单抗联用时有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 4 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对SK-BR-3细胞增殖的影响注：A.EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响；B. 曲妥珠单抗对SK-BR-3细胞增殖的影响；C. 16.67 nmol/L 曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、15 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与15 μmol/L EGCG联用对SK-BR-3细胞增殖的影响；D. 16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；△△△P<0.001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.5 Western blot法检测EGCG、曲妥珠单抗单用及二者联用对BT474细胞中EGFR、HER2、Akt、MAPK及其磷酸化蛋白表达的影响
图5A-F结果显示，EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联用组均能显著降低BT474细胞中p-Akt、p-MAPK、p-EGFR的表达。图5G-H结果显示，曲妥珠单抗单药组能显著降低BT474细胞p-HER2的表达，EGCG单药组虽然无显著性差异（P>0.05），但对p-HER2的表达有一定抑制作用。与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞p-Akt、p-MAPK、p-EGFR、p-HER2蛋白的表达。
图 5 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞中MAPK、Akt、EGFR、HER2及其磷酸化蛋白的表达的影响注：A. p-Akt、Akt的蛋白表达水平；B. p-Akt、Akt的相对蛋白表达量；C. p-MAPK、MAPK的蛋白表达水平；D. p-MAPK、MAPK的相对蛋白表达量；E. p-EGFR、EGFR的蛋白表达水平；F. p-EGFR、EGFR的相对蛋白表达量；G. p-HER2、HER2的蛋白表达水平；H. p-HER2、HER2的相对蛋白表达量；****P<0.0001，与对照组比较；##P<0.01、###P<0.001、 ####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较3. 讨论
ErbB-2(HER-2/neu)是一种分子量为1.85×105的穿膜受体络氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族[14]。该家族由4个紧密相关的络氨酸激酶（TK）受体组成：HER1(EGFR)、HER2、HER3和HER4。HER2主要是通过与家族中的其他成员形成同源或异源二聚体，激活下游的RAS/MAPK和磷脂酰肌醇-3/激酶（PI3K）/ATK信号通路，进而促进细胞增殖、迁移、血管生成以及抑制细胞的凋亡[15-16]。ERK/MAPK通路是参与细胞增殖控制的主要细胞内信号通路之一。 PI3K/ATK信号通路在控制Her-2/neu过表达细胞的生长和转化表型中起重要作用[17-18]。HER2过表达的癌症表现出较强的转移能力和浸润能力，对化疗敏感性差，且易复发。
曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。1998年，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准应用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌[19]。曲妥珠单抗可能通过下调HER2受体在细胞膜上的表达，阻断HER2和HER3形成异源二聚体从而抑制下游通路，导致细胞周期阻滞，以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性活性[20]等。虽然曲妥珠单抗单药治疗起到了一定的效果, 但大部分HER2过表达的乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗不产生反应，初次治疗有效率大约在30%, 即使对曲妥珠单抗产生反应的患者也有约50%会在1年内发生耐药。
茶多酚可以抑制多种与细胞增殖和肿瘤进展相关的酶活性。EGCG是茶多酚中的主要成分之一。研究显示，在人A431表皮样癌细胞中，EGCG可能通过阻断EGF与其受体的结合进而抑制EGFR活性[21]。EGCG能抑制结肠癌细胞中EGFR、HER2、HER3的激活，并抑制细胞生长[22]。
为了进一步提高HER2靶向治疗疗效，在本研究中我们探讨了曲妥珠单抗和EGCG在乳腺癌细胞的联合抗肿瘤作用。实验结果发现EGCG与曲妥珠单抗在一定浓度范围内可以协同抑制HER2过表达乳腺癌细胞的生长，提示临床治疗中如果利用EGCG和曲妥珠单抗联合治疗则需重点关注两者各自的剂量。可以先利用乳腺癌荷瘤小鼠模型对不同剂量的EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用进行评价，并参考动物体内药效实验的结果进行EGCG和曲妥珠单抗联合用药临床试验的设计，通过临床试验的结果确定临床治疗时最佳的联合用药剂量。
本研究还对EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用机制进行了阐明：与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞中p-EGFR、p-HER2和p-Akt、p-MAPK的表达，提示EGCG和曲妥珠单抗联用对HER2过表达乳腺癌细胞的协同增殖抑制活性可能与其显著增强的对Akt和MAPK信号通路的抑制作用有关。本研究为EGCG与曲妥珠单抗的联合应用提供了理论支持，并为HER2过表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
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表 1 河豚毒素加样回收率试验结果（n=3）
加入量（μg/ml） 测得量（μg/ml） 回收率（%） RSD（%） 2 1.96 1.98 1.99 98.88±0.82 0.83 10 10.04 9.96 10.00 100.00±0.43 0.43 20 20.04 20.18 20.08 100.49±0.37 0.37 
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