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疲劳是指机体由于某一生理变化过程不能维持其运动机能在某一特定水平或者不能维持其运动强度在某一预定水平[1]。疲劳是日常生活中非常普遍的生理现象，通常人们经过一定的体力或是脑力劳动后会感到疲乏无力，疲劳发生时可导致抑郁、焦虑等问题，通常被认为与认知障碍、睡眠质量差、身体功能障碍和能量失衡有关[2-3]。关于疲劳产生的机制有多种解释，主要包括能源衰竭学说、疲劳相关的代谢产物堆积和自由基学说等。其中，运动过程中产生的自由基攻击细胞和线粒体等生物膜，导致氧化与抗氧化作用失衡，被认为是运动性疲劳产生的主要原因之一[4-6]。目前临床上用于缓解疲劳的药物或疗法较少，因此，从疲劳产生机制出发，开发新型抗疲劳药物或潜在物质具有重大意义。
纳米硒（SeNPs）作为一种抗氧化剂，在治疗氧化应激相关疾病中具有潜在的应用前景。然而，SeNPs由于表面能高，通常稳定性较差，容易发生聚沉，形成灰色或黑色的元素硒[7]。功能化SeNPs具有较低的毒性和较高的生物兼容性及反应性，有助于提高疗效和临床应用价值[8]。虎奶菇[Pleurotus tuber-regium (Fr.) Singer]又称菌核侧耳、茯苓侧耳等，为担子菌纲口蘑科侧耳属真菌，性甘温，补气益血，主要分布在热带和亚热带地区，是一种珍贵的药食两用真菌[9]，在民间常被用于治疗哮喘、感冒发烧、胃病等疾病[10]。研究表明，多糖是虎奶菇重要的活性成分之一，具有增强小鼠免疫力、提高抗氧化应激能力和抑制肝脏脂质过氧化等多种药理活性[11-12]。
我们前期的试验利用非洲野生虎奶菇菌核多糖作为封端剂，制备出大小可控、高稳定性的新型纳米硒——虎奶菇多糖功能化纳米硒（PTR-SeNPs）[13]。研究表明，PTR-SeNPs具有显著的保肝、抗细菌、抗真菌、抗肿瘤和促进骨形成等多种生物药理活性，表现出巨大的潜在临床应用价值和开发前景[14-18]。本文探究PTR-SeNPs对游泳运动性疲劳的拮抗作用，以期为PTR-SeNPs作为天然补硒剂在抗疲劳保健品或药品的开发和应用提供实验依据。
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SPF级C57/BL6小鼠48只，雄性，6~8周龄，体质量20 g~25 g，由江苏赛业模式生物研究中心（太仓）有限公司提供，生产许可证号：SCXK（苏）2018-0003。于福建中医药大学动物实验中心SPF级动物房内饲养。
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PTR-SeNPs（香港理工大学未来食品研究院食品科学及营养学系黄家兴教授制备并提供，初始摩尔浓度为1.30 mmol/L）；生理盐水（福州海王福药制药有限公司)；血清尿素氮(BUN)、乳酸(LD)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛(MDA)、过氧化氢(CAT)和糖原(Glycogen)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；动物用异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。
5417R低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；LXJ-IIB低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；Th900超低温冰箱（美国Thermo公司）；DK-S24电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；AR2310电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；M-244超纯水机（德国Milipore公司）；BCD-216SDN 4℃冰箱（中国Haier集团）；Lab dancer S25涡旋仪（IKA公司）；M200 Pro多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；IMS-300全自动雪花制冰机（常熟市雪科电器有限公司）；BioSpec 70/20 USR小动物核磁共振成像仪（瑞士布鲁克公司）。
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C57/BL6小鼠48只，雄性，6～8周龄，体质量20～25 g，在SPF级实验动物房饲养，室内温度为20℃～26℃，相对湿度40%～70%，噪声<60 dB，光照明暗交替12 h/d，所有小鼠适应性喂养1周，待处理。将C57/BL6小鼠分为4组，每组12只，分别为对照组、游泳训练模型组（EC组）、PTR-SeNPs低剂量组[2.5 μmol/（kg·bw），LPTR-SeNPs组]、PTR-SeNPs高剂量组[10 μmol/(kg·bw)，HPTR-SeNPs组]。按所示剂量灌胃21 d，每天给药1次。第1～4天，给药30 min后，适应性游泳训练20 min，连续4 d，第5～7天每天比前1 d增加20 min，连续3 d，第8～20天每天游泳80 min，持续13 d。每日监测食物与水的摄取量，并定期记录小鼠体质量变化情况（第1、5、10、15和20天）。第21天给药30 min后，每组各取3只，游泳80 min后，MRI扫描小鼠后肢肌肉长度和宽度，其余小鼠进行负重力竭游泳训练后，眼球取血并摘取肝脏，进行疲劳相关生化指标检测（图1）。
图 1 PTR-SeNPs对运动训练小鼠抗疲劳活性实验示意图
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第21天给药30 min后，每组各取3只，异氟烷气体麻醉小鼠，MRI扫描小鼠后肢肌肉，利用ImageJ软件分析各组的肌肉长度和宽度，计算各组与对照组之间的比值，即得各组的肌肉相对长度和宽度。
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第21天给药30 min后，在尾部绑上重量为小鼠体质量5%的铅丝，将其放入水温为（30±2）℃、50 cm×40 cm×40 cm的水箱中进行负重力竭游泳测试。适当用玻璃棒搅拌水，或拨弄小鼠，使小鼠一直处于运动状态。小鼠的头部沉下水面8 s不能浮出即判断为力竭，记录每只小鼠从开始游泳至力竭的时间[19]。每只小鼠测试过后更换新的超纯水，避免小鼠留在水中的警戒物质对其他小鼠产生干扰。负重力竭游泳结束后立即进行眼球取血，脱颈处死，摘取肝脏，保存于−80℃，待测。
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小鼠眼球取血，3 500 r/min，4℃离心15 min，取血清，参照试剂盒说明书检测血清中BLA、BUN、ALT、AST和LDH含量。
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取适量肝组织，用生理盐水漂洗，吸净水分，参照试剂盒说明书检测肝脏中SOD、CAT活性和MDA、HG水平。
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采用SPSS 23.0软件对实验数据统计分析，以（
$ \bar{x}\pm {s} $ ）表示，采用ANOVA单因素方差分析数据，以P<0.05差异有统计学意义。 -
MRI扫描小鼠后肢肌肉（图2），ImageJ软件分析并计算各组小鼠后肢肌肉的相对长度和宽度，结果如图3所示。与对照组比较，HPTR-SeNPs能显著增加后肢肌肉相对长度（P<0.05）。结果表明，PTR-SeNPs可通过增加后肢肌肉长度，改变肌肉结构，可能与提高机体的耐力相关。
图 2 MRI观察PTR-SeNPs对运动训练小鼠后肢肌肉的影响
图 3 PTR-SeNPs对运动训练小鼠后肢肌肉的影响（
$ \bar{{x}}\pm \mathit{s} $ ，n=3） -
疲劳是机体复杂的生理变化过程，运动耐力可作为客观直接的判断标准[20]。由图4A-C可知，与对照组比较，给药21 d后，L/HPTR-SeNPs对运动训练小鼠的体质量、摄食和摄水量均无显著影响。小鼠连续灌胃给予PTR-SeNPs 21 d后，通过负重力竭游泳实验考察PTR-SeNPs对小鼠运动性疲劳的影响，结果如图4D所示，与对照组比较，HPTR-SeNPs显著提高小鼠的负重力竭游泳时间（P<0.05）；与EC组或LPTR-SeNPs组比较，HPTR-SeNPs能显著提高小鼠的负重力竭游泳时间（P<0.01），说明PTR-SeNPs可以显著提高小鼠运动耐力，明显缓解小鼠疲劳症状。
图 4 PTR-SeNPs对运动训练小鼠负重力竭游泳的影响（
$ \bar{{x}}\pm \mathit{s} $ ，n=9） -
糖原作为机体主要的供能物质，运动产生疲劳时，大量ATP被消耗，此时机体糖酵解过程增强，糖酵解过程最终代谢产物为BLA，BLA在机体内大量堆积，使机体内环境呈酸性，细胞正常的能量转换和物质代谢受到影响，最终导致机体产生疲劳[21-23]。当机体能量消耗达到一定程度，体内的蛋白质开始分解，参与能量代谢，使得血清中BUN含量急剧升高[24]。小鼠血清BLA含量检测结果如图5A所示，与对照组比较，EC组BLA含量显著升高（P<0.05）；与EC组比较，LPTR-SeNPs组与HPTR-SeNPs组BLA含量显著下降（P<0.05或P<0.01）。表明PTR-SeNPs可能通过促进葡萄糖更充分氧化分解，减少BLA的生成，或者加快BLA代谢，从而提供更为充足的ATP，减少运动小鼠BLA的蓄积。血清BLA含量检测结果如图5B 所示，与对照组比较，EC组和LPTR-SeNPs组BUN含量显著升高（P<0.01）；而HPTR-SeNPs组的BUN含量则无显著性差异。与EC组比较，HPTR-SeNPs组BUN含量显著下降（P<0.05）。提示PTR-SeNPs可能通过提高葡萄糖的利用，减少蛋白质分解，降低疲劳小鼠血清BUN的生成。
图 5 PTR-SeNPs对运动训练小鼠血清血乳酸和血尿素氮含量的影响（
$ \bar{\mathit{x}}\pm \mathit{s} $ ，n=9） -
机体在进行剧烈运动时，会生成大量的自由基，使机体产生氧化应激，导致肝脏、心肌和肌肉等组织器官出现受损，血清中ALT、AST和LDH水平亦可作为评价小鼠在游泳应激过程中的敏感指标[25]。由图6可知，与对照组比较，EC组血清中的ALT、AST和LDH含量显著升高。LPTR-SeNPs组的ALT和LDH含量以及L/HPTR-SeNPs组AST含量均显著升高。与EC组比较，HPTR-SeNPs组ALT水平显著降低（P<0.05），见图6A；L/HPTR-SeNPs组的AST水平显著降低（P<0.05），见图6B；HPTR-SeNPs组的LDH活性水平显著降低（P<0.01），见图6C。结果提示PTR-SeNPs改善运动性疲劳过程中的肝脏生理功能。
图 6 PTR-SeNPs对运动训练小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶含量的影响（
$ \bar{{x}}\pm \mathit{s} $ ，n=9） -
机体内含有的多种抗氧化活性酶，如SOD和CAT，可减少体内活性氧自由基的含量，保护肌细胞。抗氧酶活性的提高能够延缓运动疲劳，MDA水平可作为判断机体内物质氧化程度的指标[26-27]。由图7可知，与对照组比较，HPTR-SeNPs组的CAT活力和HG含量显著升高（P<0.01）。与EC组比较，LPTR-SeNPs组小鼠肝脏中SOD活力和HG含量显著升高（P<0.05），HPTR-SeNPs组小鼠肝脏中CAT活力和HG含量显著升高（P<0.01）。表明PTR-SeNPs可以提高体内SOD、CAT活力，清除体内自由基，减缓小鼠剧烈运动后MDA堆积对肌细胞所造成的损害，同时提高机体HG含量。提示PTR-SeNPs能够显著提高机体的抗氧化应激能力和HG储备能力，从而有效改善运动性疲劳。表明PTR-SeNPs具有增强肝脏生理功能的作用，能有效拮抗游泳训练疲劳的发生。
图 7 PTR-SeNPs对运动训练小鼠肝脏生化指标的影响（
$ \bar{{x}}\pm \mathit{s} $ ，n=9） -
目前，疲劳已严重影响到人们的身心健康和生活质量，受到了国内外专家的关注，并逐渐成为学者研究的热门课题。硒是生物体中必需的微量元素，在预防癌症、心血管疾病和提高免疫力中具有重要作用。近年来，SeNPs作为一种新型补硒药物出现，具有更好的生物利用度以及更小的毒性[2]。然而，SeNPs不稳定、极易聚集的性质，限制了其在临床上的应用。近年来，天然生物大分子作为SeNPs的修饰剂，可提高其稳定性和生物活性，并逐渐成为研究热点[15]。蘑菇多糖具有丰富的羟基，能有效地吸附在SeNPs上，避免其聚积和沉淀[28]。研究表明，蘑菇多糖修饰的SeNPs其稳定性大幅增强，且具有抗肿瘤、抗氧化、保肝和抗疲劳活性等多种生物活性[29]。
本研究结果表明，PTR-SeNPs能显著拮抗小鼠的游泳训练疲劳，其抗疲劳作用可能与改善肝脏生理功能、增加糖原储备、减少代谢物堆积及增强机体抗氧化能力有关。因此，深入探究PTR-SeNPs的抗疲劳活性作用机制，为其在抗疲劳药物及保健品的开发应用提供重要的实验参考依据。
Anti-fatigue activity of selenium nanoparticles functionalized by polysaccharides from Pleurotus tuber-regium sclerotium
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摘要:
目的 通过检测小鼠后肢肌肉相对长度、负重游泳时间及其血清和肝脏相关指标，探究虎奶菇菌核多糖功能化纳米硒（PTR-SeNPs）的体内抗疲劳功效。 方法 48只雄性C57/BL6小鼠分为4组，每组12只，即对照组、游泳训练组（EC组）、PTR-SeNPs低剂量组（LPTR-SeNPs组）、PTR-SeNPs高剂量组（HPTR-SeNPs组），分别给予生理盐水（对照组与EC组）、LPTR-SeNPs[2.5 μmol/(kg·bw)]和HPTR-SeNPs[10 μmol/(kg·bw)]，1次/d，连续灌胃21 d。通过磁共振成像系统分析PTR-SeNPs对小鼠游泳训练后肢肌肉结构的影响，同时测定小鼠的负重游泳时间并检测血清中血乳酸（BLA）、血尿素氮（BUN）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）含量及肝脏中肝糖原（HG）、丙二醛（MDA）水平和过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活力。 结果 与对照组比较，EC组小鼠血清BLA、BUN、ALT、AST及LDH含量显著升高（P<0.05或P<0.01），HPTR-SeNPs组小鼠肝脏中CAT含量显著升高（P<0.01），小鼠后肢肌肉相对长度显著增长（P<0.05），负重力竭游泳时间提高（P<0.05），L/HPTR-SeNPs组MDA水平无明显差异；与EC组比较，HPTR-SeNPs组小鼠负重游泳时间显著延长（P<0.01），BLA及BUN含量均显著降低（P<0.05或P<0.01），L/HPTR-SeNPs组HG含量显著增加（P<0.05或P<0.01），HPTR-SeNPs组血清ALT、AST及LDH水平均显著降低（P<0.05或P<0.01），肝脏CAT活力显著升高（P<0.01），LPTR-SeNPs组血清AST活力显著降低（P<0.05）、肝脏SOD活力显著升高（P<0.05）。 结论 PTR-SeNPs具有改善肝脏生理功能、增加糖原储备、减少代谢物堆积及增强机体抗氧化能力，以及减缓疲劳的作用，具有开发成保健品或药品的潜力。 Abstract:Objective To investigate the anti-fatigue effect of PTR-SeNPs in vivo by measuring the muscle relative length of hindlimb, load-bearing swimming time as well as serum and liver indexes of mice. Methods 48 male C57/BL6 mice were randomly assigned into 4 groups with 12 mice in each group, including vehicle control group （control group）, swimming training exercise group （EC group） with vehicle treatment, swimming training exercise with low dose of PTR-SeNPs group （LPTR-SeNPs） and high dose of PTR-SeNPs group （HPTR-SeNPs）. The mice were intragastrically administrated with normal saline in both control group and EC group, as well as 2.5 and 10 μmol/（kg·bw） PTR-SeNPs in LHPTR-SeNPs group, respectively, once per day for consecutively 21 days. After swimming training exercise, the muscle structures in the hind limb of mice were examined by magnetic resonance imaging. Furthermore, the burdened swimming time was measured, the serum content of blood lactic acid （BLA）, urea nitrogen （BUN）, alanine aminotransferase （ALT）, glutamic oxalate aminotransferase （AST） and lactate dehydrogenase （LDH）, as well as the hepatic level of glycogen （HG）, malondialdehyde （MDA） and activity of catalase （CAT） and superoxide dismutase （SOD） were determined. Results Compared with the control group, the serum contents of BLA, BUN, ALT, AST and LDH in EC group （P<0.05 or P<0.01） and hepatic CAT in HPTR-SeNPs group （P<0.01） were significantly increased. The muscle relative length of hind limbs and the burdened swimming time were extended by HPTR-SeNPs markedly （P<0.05）. There was no significant difference in MDA level in LHPTR-SeNPs group. Compared with EC group, the burdened swimming time of mice was significantly prolonged （P<0.01）, the contents of BLA and BUN were obviously decreased in the HPTR-SeNPs group （P<0.05 or P<0.01）, the level of HG was significantly increased in the LHPTR-SeNPs groups （P<0.05 or P<0.01）, the serum content of ALT, AST and LDH were markedly decreased in the HPTR-SeNPs group （P<0.05 or P<0.01）. Hepatic SOD activity was remarkably increased in LPTR-SeNPs group （P<0.05）, the level of CAT was evidently increased （P<0.01） and AST was decreased （P<0.05） in the HPTR-SeNPs group. Conclusion PTR-SeNPs could improve the liver physiological function, increase glycogen storage, reduce the accumulation of metabolites and enhance the body’s antioxidant capacity to ameliorate fatigue significantly, which could present the potential to be developed into health care products or drugs. -
Key words:
- PTR-SeNPs /
- swimming training exercise /
- antioxidant stress /
- anti-fatigue effect
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高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品与试剂
姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
2. 方法与结果
2.1 姜黄素纳米乳的制备
姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立
2.2.1 色谱质谱条件[8]
色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
2.2.2 方法学考察
取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究
2.3.1 给药方案
18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
2.3.2 药动学参数计算
药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 2.4 药效学研究
2.4.1 动物分组、造模及给药
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
2.4.2 统计学处理
实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。2.4.3 肝脏指数
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片
取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平
第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
3. 讨论
姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
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图 3 PTR-SeNPs对运动训练小鼠后肢肌肉的影响（
$ \bar{{x}}\pm \mathit{s} $ ，n=3）A.相对长度；B.相对宽度*P<0.05，与对照组比较。
图 4 PTR-SeNPs对运动训练小鼠负重力竭游泳的影响（
$ \bar{{x}}\pm \mathit{s} $ ，n=9）A.体质量；B.摄水量；C.摄食量；D.负重力竭游泳时间*P<0.05，与对照组比较；ΔΔP<0.01，与HPTR-SeNPs组比较。
图 5 PTR-SeNPs对运动训练小鼠血清血乳酸和血尿素氮含量的影响（
$ \bar{\mathit{x}}\pm \mathit{s} $ ，n=9）A.血乳酸；B.血尿素氮*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01，与EC组比较。
图 6 PTR-SeNPs对运动训练小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶含量的影响（
$ \bar{{x}}\pm \mathit{s} $ ，n=9）A.谷丙转氨酶；B.谷草转氨酶；C.乳酸脱氢酶*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01，与EC组比较。
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