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随着人口老龄化进程加快，以脑、脊髓结构或功能损伤导致的中枢神经系统（CNS）疾病的发病率和病死率逐年上升[1]。尽管对CNS疾病病因的认识已有重大进展，但是新药研发进程依旧进展缓慢，主要原因是CNS疾病发病机制复杂，以及在药物研发阶段缺少可靠有效的评价手段[2]。随着系统生物学技术的不断发展，1999年Nicholson等[3]提出的代谢组学通过研究生物体受到外界刺激或基因缺陷所导致的代谢终产物的变化情况，为研究疾病的发病机制和药物疗效评估提供了一种新手段。来源于患者或疾病动物模型的生物体样本，如血液、尿液、组织提取液等的代谢组学研究是目前的主要研究方向，但是实验研究需要大量样本数据支持，且受到伦理以及生物体内外混杂因素的影响，具有一定的局限性。细胞是构成生物体结构和功能的基本单位，体外细胞模型可建立单一症状的疾病模型、具有可控性强、有利于进行大规模药物筛选等特点而备受研究人员青睐。细胞代谢组学是以细胞为研究对象，通过现代分析方法监测细胞反应及药物作用于细胞后的代谢变化，在探寻CNS疾病的病理生理机制及治疗干预效果中展现出巨大潜力[4]。本文拟从细胞代谢组学的研究流程及其在中枢神经系统疾病中的应用进行综述，以期为从细胞层面探索中枢神经系统疾病发病机制和新药研发提供参考。
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细胞代谢组学通过现代分析方法对细胞新陈代谢后产生的差异代谢物进行定性、定量研究。介于细胞内和细胞外代谢之间的密切关系，完整的细胞代谢组学研究包括细胞内指纹(细胞内所有代谢物)和细胞外足迹(细胞外介质所有代谢物)两部分[5]，其主要流程为细胞培养、样品前处理、分析检测、代谢组学数据处理（图1）。
图 1 细胞代谢组学工作流程[6]
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细胞类型和培养方法的选择对模拟疾病状态和深入了解疾病的代谢框架至关重要。来源于生物体的原代细胞是疾病研究的理想细胞模型，但其寿命有限，纵向研究具有一定挑战性。因此，能够快速分裂的癌细胞和永生化细胞被广泛用于体外模型的构建中。有研究表明，体外和体内细胞培养条件不同易导致细胞特性的改变[7]。为了能更准确地模拟体内微环境，自20世纪初建立以来，改进细胞培养技术的尝试从未停止，如在二维单层培养的基础上，研发出三维培养技术、旋转式细胞培养系统、多细胞共培养等培养模式，更加贴近细胞在生物体的生存环境[8-10]。
提取目标代谢物是细胞代谢组学分析的关键步骤。一些代谢物在样品前处理过程中受到干燥-重构的影响易产生损失或变异，因而优化样品前处理方法、建立细胞代谢组学标准化分析流程显得尤为重要[11]。Wilkins等[12]比较胰蛋白酶消化、刮刀刮取、−80 ℃甲醇淬灭以及−80 ℃甲醇淬灭后去除甲醇这4种常用的细胞代谢物提取方法，结果显示，−80 ℃甲醇快速淬灭得到的细胞代谢物稳定性和富集程度较好，且样品在−80 ℃甲醇条件下可以储存长达1个月而没有明显的代谢物降解。Ser等[13]发现温度和添加剂对细胞代谢物的影响很小，而使用磷酸盐缓冲溶液或水洗涤样品对代谢物影响较大，并提出用冷甲醇提取且不经任何洗涤可以满足绝大多数代谢物的提取。随着质谱等检测仪器的不断开发和进步，不经任何前处理将采集到的细胞代谢物直接进样分析也成为了可能[14]。
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核磁共振波谱法（NMR）和质谱法（MS）是细胞代谢组学研究的常用分析方法。NMR可追踪代谢物流动来识别活跃的代谢途径、测量代谢通量或相应的示踪剂代谢变化，所需样品量少，具有出色的重现性、定量以及鉴定未知代谢物的能力。Saborano等[15]提出一种基于NMR法的哺乳动物细胞系和原代细胞系代谢研究框架，可用于糖酵解、戊糖磷酸循环等多种代谢途径分析。具体工作流程为将含有13C或15N标记的前体物质引入细胞培养基中培养细胞，使用甲醇-氯仿-水提取代谢物，通过异核单量子相干谱（HSQC）、二维NOE谱（NOESY）等技术采集带标记代谢物的光谱信息，探寻细胞系中健康和疾病状态的代谢差异。然而，NMR相对较低的灵敏度使其无法测量低丰度的代谢物。越来越多新型NMR方法包括多维NMR技术、快速脉冲NMR技术、核磁共振显微技术等也逐渐应用于细胞代谢组学研究，为生物标志物的寻找提供了有力手段。
MS的优势在于其灵敏度高、覆盖面广、可与多种色谱技术联用实现代谢物的有效分离。气相色谱-质谱联用法(GC-MS）可用于氨基酸、核苷酸和脂肪酸等挥发性代谢物的分析，具有较强的针对性。为简化样品制备过程中对挥发性代谢物的衍生化步骤，Araujo等[16]优化了一种基于顶空固相微萃取（HS-SPME）结合GC-MS方法，通过纤维涂层对细胞外代谢物中挥发性组分萃取后直接进样分析，可实时监测挥发性有机物的代谢过程。液相色谱-质谱联用法(LC-MS)包括反相液相色谱（RPLC）和亲水作用液相色谱（HILIC）与MS的联用，其中RPLC总体上表现出比HILIC更好的适用性和重复性，被广泛应用于细胞代谢物的分析中，尤其适用于非极性和弱极性代谢物，而HILIC对亲水性、极性和离子性代谢物如糖、氨基酸和核酸有更好的分离效果[17]。Sun等[18]采用UHPLC-QQQ/MS法对细胞外代谢物进行分析，液相分离条件的优化分别考察了7根反相UHPLC柱和5根HILIC柱，以峰面积、半峰宽、拖尾因子、峰面积CV（%）、保留时间及其SD值共6个指标评价分离效果，最终选择了其中的1根反相UHPLC柱和流动相，单次检测时间仅17 min，实现了同时检测氨基酸、糖类等93种代谢物，为开展实时监测细胞代谢物水平变化提供了可能性。
考虑到细胞间存在异质性，为获得更加丰富的细胞代谢物信息，现代生命科学研究将目光投向了单个细胞。微流控芯片可以在与细胞大小相当的微通道内进行细胞培养、样品制备、分离检测等一系列操作，是单细胞代谢组学分析的重要技术平台[19]，相比于LC-MS，微流控芯片质谱法操作简单，可直接进样分析，但存在选择性差和离子抑制等问题，Xu等[20]将微流控芯片与纳米电喷雾电离质谱相联用，通过对金纳米颗粒进行特异性标记，大大提高单细胞水平内源代谢物检测的灵敏度和兼容性。得益于质谱成像仪器的快速发展，空间分辨代谢组学技术可以对目标代谢物在细胞中的分布进行定位，提供多维度代谢组学信息，是目前单细胞代谢组学研究的强有力工具[21]。
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代谢物的存在和浓度变化可以直接体现细胞对周围化学和物理微环境的反应，具有高度动态性和未知性，庞大的数据集使得细胞代谢组学的数据分析和解释需借助生物信息学[22]。基于R、Python、C/C++ 等编程语言的代谢组学数据处理的软件资源有很多，但是尚未研发出通用的数据处理软件，需要用户根据分析目的对多种软件程序整合后优化使用[23]。Zhou等[24]在IP4M代谢组学数据分析集成平台的基础上，开发出IMAP集成代谢组学分析平台，不仅可以实现一站式完整的代谢组数据分析，而且有多种可供选择的分析方法和工作流程，可用于建立和验证预测模型以及相关的网络构建和分析，适用于批量或有特殊要求的数据分析。孙海涛等[25]提出了一种基于开源软件Mzmine和谱峰预识别算法，多个计算资源并行的云计算代谢组学数据处理方法，所提出的并行数据处理方法与单计算节点相比，计算速度得到显著提升且大大降低了研究费用，可满足海量代谢组学的数据处理需求。
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CNS疾病影响着全球数百万患者的生命健康，其发病机制复杂，涉及神经细胞凋亡、神经炎症、氧化应激、兴奋性损伤等多种病理特征，给疾病的早期诊断和预后评估带来了很大的困难。构建单一病理状态的体外细胞模型，可以进行大规模的靶向研究和药物筛选，大大缩短了新药研发时间[26]。尽管已有各种类型的CNS疾病体外细胞模型，但其中只有少数被用于代谢组学研究。随着细胞代谢组学在探索CNS疾病发病机制以及药物作用特点中的作用日益突出，越来越多潜在的生物标志物被发现。表1归纳了2015年以来有关细胞代谢组学在CNS疾病研究的一些应用实例，包括常见CNS疾病相应的细胞模型构建、细胞代谢组学分析手段、差异代谢物筛选、通路分析及药物干预结果等。
表 1 细胞代谢组学在中枢神经系统疾病药物研究中的应用
疾病 研究对象 研究药物 检测手段 主要研究结果 参考文献 阿尔茨海默病 PC12细胞
（Aβ25~35）柚皮苷 GC-MS 筛选出甘氨酸、谷氨酸等27种AD差异代谢物，影响氨基酸代谢、碳水化合物代谢及脂质代谢等代谢通路 [27] 脑微血管内皮细胞（Aβ1~42） 丹参 UHPLC-QTOF- MS 发现了33个差异代谢物，涉及精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢等多条代谢通路 [28] SH-SY5Y细胞
（冈田酸）丹参、知母 UHPLC-QTOF- MS 发现了色氨酸、苯丙氨酸等45个潜在AD生物标志物，涉及12条代谢通路，筛选出与丹参相关的30种差异代谢物，与知母相关的7种差异代谢物 [29] SH-SY5Y细胞
（谷氨酸）人参皂苷 Rb1 1H NMR 发现谷氨酸、牛磺酸等7种差异代谢物，涉及5条不同的代谢通路 [30] 帕金森病 SH‐SY5Y细胞
（MPP+）胶质细胞源性神经营养因子 LC‐MS/MS 三酰甘油、磷脂酰胆碱等多种脂质代谢物受到影响 [31] SH-SY5Y细胞
（6-OHDA）花茶 UPLC-TOF-MS 发现多种与神经保护作用相关的代谢物 [32] SH-SY5Y细胞
（A53T基因突变）L-天冬酰胺酶 GC-MS/MS 可以调节谷氨酰胺代谢起到神经保护作用 [33] 抑郁症 PC12细胞
（皮质酮）阿魏酸 UPLC-QTOF-MS 发现24个差异代谢物，涉及氨基酸代谢、能量代谢和甘油磷脂代谢等代谢通路 [34] PC12细胞
（皮质酮）甘草苷 LC-MS 鉴定出谷氨酸、谷胱甘肽等11种潜在差异代谢物，涉及8条不同的代谢通路 [35] PC12细胞
（皮质酮）香附 UPLC-Q-TOF-MS 发现鞘磷脂、甘油磷脂等11种潜在差异代谢物 [36] PC12细胞 氯胺酮、羟基去甲氯胺酮对映体 GC-MS和CE-MS 发现甘油酸盐、柠檬酸盐、亮氨酸等49种潜在生物标志物 [37] 星形胶质细胞 氟西汀 1H NMR 发现17种潜在生物标志物，涉及脂质和氨基酸代谢通路 [38] 星形胶质细胞 文拉法辛 1H NMR 发现赖氨酸、酪氨酸、谷氨酸等31 种涉及能量、氨基酸和脂质代谢的差异代谢物 [39] -
阿尔茨海默病（AD）是一种常见于老年人的神经退行性疾病，临床表现为记忆力减退、认知和交流功能障碍[40]。常用的AD细胞模型有：β淀粉样蛋白（Aβ）诱导神经毒性模型、Tau蛋白异常磷酸化模型、氧化应激模型和基因转染模型[41]。Aβ聚集沉积易使细胞产生突触受损、线粒体功能障碍以及促进Tau蛋白病理化，当前AD防治的研究热点也集中于Aβ[42]。Aβ是由淀粉样前体蛋白(APP)经分泌酶水解产生，APP的异常突变与AD的发展密切相关，Xiong等[43]对APP过表达的转基因(N2a/APP695swe)细胞用作AD体外模型的可行性进行验证，并将其应用于缬氨霉素改善AD的作用机制研究，GC-MS结果显示，缬氨霉素作用N2a/APP695swe细胞3 h后Aβ1~42和Aβ1~40水平降低，此时，三磷酸腺苷(ATP)水平和柠檬酸、苹果酸、丙酮酸等ATP相关代谢产物显著增加。但是6~12 h其ATP代谢产物却呈现水平下降趋势，提示缬氨霉素的作用时间应加以控制，才能有效促进ATP产生，起到改善AD的作用。有研究指出载脂蛋白E（APOE）不同亚型携带者患AD的风险不尽相同，可能与影响大脑葡萄糖摄取有关。为了解构成APOE相关遗传风险的分子机制，Williams等[44]采用稳定同位素示踪技术探究APOE中3种亚型基因产生的星形胶质细胞葡萄糖代谢差异，结果显示，相较于E2和E3，受E4影响的星形胶质细胞葡萄糖摄取受损，相应的糖代谢、三羧酸循环以及戊糖磷酸途径发生变化，谷胱甘肽合成增加，详见图2所示。与人类APOE表达E4基因的小鼠模型的研究结果相印证[45]，证实了AD发病与遗传基因的相关性。为深入了解E4和代谢损伤对大脑影响的生物学基础，进一步阐明AD的发病机制提供了科学依据。
图 2 不同亚型的载脂蛋白E对星形胶质细胞葡萄糖代谢的影响[44]
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帕金森病（PD）为第二大中枢神经退行性疾病，患者常出现运动迟缓、静止性震颤和强直等症状。PD 是一种由遗传、环境和生活方式等多因素共同作用的疾病，其病理特征表现为黑质多巴胺能神经元损伤丢失和α-突触核蛋白聚集[46]。神经毒素如百草枯、6-羟基多巴胺(6-OHDA)、1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子（MPP+）可诱导细胞多巴胺能神经元变性死亡，从而产生类似帕金森的病理特征，所建立的细胞模型可操作性强、重复性好，是目前最常用的PD细胞造模方法。Lei等[47]采用NMR与直接输注电喷雾电离质谱（DI-ESI-MS）联用的代谢组学方法探究百草枯诱导SH-SY5Y细胞产生的代谢谱变化，结果显示，磷酸戊糖途径中6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖等代谢物增加，糖酵解与TCA 循环受到抑制。Xicoy等[48]运用LC-MS法研究6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞的脂类代谢变化，结果发现除了磷脂酰丝氨酸水平降低外，磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和胆固醇水平变化情况均与PD患者血浆代谢组学结果相同[49]。进一步探究降胆固醇他汀类药物对该PD模型的神经保护作用，发现他汀类药物未展现相应的保护作用，反而是低剂量的胆固醇使SH-SY5Y细胞免受6-OHDA毒性，提示该细胞模型不适用于胆固醇参与的PD发生发展机制的研究。星形胶质细胞是人脑中含量最丰富的细胞类型，在维持PD患者大脑胆固醇稳态扮演着重要角色[50]。近年来，星形胶质细胞在PD发病机制中作用开始被发现。Sonninen等[51]通过UPLC-Q-TOF-MS法探究星形胶质细胞的代谢变化，发现LRRK2和GBA基因突变的PD星形胶质细胞出现α-突触核蛋白生成增加、钙水平升高、溶血磷脂酰乙醇胺等多种氨基酸代谢改变。
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缺血性脑卒中（IS）是中风的一种常见形式，涉及神经炎症、氧化应激、兴奋性中毒等病理机制，患病后易导致脑损伤或残疾，严重者将危及生命，对人类健康构成极大威胁[52]。IS患者因急性血管闭塞所引起的脑组织缺血、缺氧，易使细胞自由基受损、钙离子超载、能量代谢紊乱，因此保护细胞免受缺氧缺糖的影响，是体外研究IS的思路之一。脑微血管内皮细胞是IS中损伤最严重的细胞，韩晨阳等[53]采用HPLC法发现该细胞在体外缺氧缺糖环境下产生ATP、二磷酸腺苷(ADP）含量降低，磷酸腺苷(AMP）含量增加等异常能量代谢变化，而这些病理变化与IS造成的细胞损伤相似。进一步探究丁苯酞对该模型的作用机制发现，丁苯酚可以有效调节细胞在氧糖剥离条件下产生的能量紊乱、钙离子超载。Wang等[54]运用GC-MS法研究杜仲防治IS的作用，采用缺氧缺糖条件下的脑微血管内皮细胞造模，发现杜仲具有促进苯丙氨酸代谢，抑制线粒体活性氧产生的作用。上述IS体外细胞模型的构建采用的是物理方法，即将细胞置于缺糖或缺血培养基与缺氧环境下培养，对设备要求较高，需将连二亚硫酸钠（Na2S2O4)、氯化钴(CoCl2)等化学性缺氧试剂用于IS模型的构建。王宇翔[55]在PC12细胞的无糖培养基中加入Na2S2O4建立氧糖剥离模型，采用HPLC法探究染料木黄酮对所构建细胞模型的保护作用，通过测定细胞神经递质类氨基酸随时间含量变化情况，发现染料木黄酮可逆转缺氧缺糖所引起的谷氨酸、天冬氨酸等兴奋性氨基酸水平变化，发挥神经保护作用。
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抑郁症是一种复杂的精神障碍疾病，以持续的心境低落为主要临床特征。谷氨酸循环和糖皮质激素浓度异常与抑郁症的发生发展密切相关，目前体外实验主要使用皮质酮、谷氨酸诱导细胞产生神经损伤构建抑郁症细胞模型。Zhang等[56]采用超高效液相色谱结合四极杆飞行时间质谱法（UPLC-QTOF-MS）探究皮质酮对PC12细胞的细胞毒性机制，鉴定出15种潜在生物标志物，涉及甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、脂肪酸氧化、甘油脂代谢和甾醇脂物在内的5种代谢途径，为后续实验研究提供了有力支撑。何小燕等[57]运用1H-NMR法探究谷氨酸和皮质酮诱导下PC12细胞的代谢差异，结果显示两种刺激方式产生的代谢物不同，但影响的代谢通路却无显著差别，提示将差异代谢物与其代谢通路结合分析的重要性。中医药具有多层次、多靶点的整体调控作用，在防治抑郁症方面具有独特优势。但由于相关中医学证候模型的缺乏，在一定程度上制约了中医药防治抑郁症的进一步发展。付爽等[58]使用含10%肝郁脾虚证的血清诱导肝癌HepG2细胞构建抑郁症证候模型，对所建立的抑郁症肝郁脾虚证细胞模型与肝郁脾虚证血清进行代谢组学分析，发现了溶血磷脂酰胆碱、卵磷脂、甘油磷酰胆碱等19个相同的代谢差异物，涉及9条代谢通路，该证候细胞模型的建立为中医药辩证治疗的科学性和有效性提供了依据。
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细胞代谢组学通过“细胞模型-生物标志物-疾病机制/作用功效”的对应关系，对细胞代谢产物进行分析，从细胞水平认识疾病，为中枢神经系统疾病的防治打开一扇新的大门。但是仍面临着一些挑战：①理想的细胞模型应该与相应疾病有高度的相似性、可重复性和可操作性，但是疾病的发生发展往往与多个细胞相关，因此需要在确保研究结果可靠的基础上选择合适的细胞造模方法。②细胞代谢物丰富但是含量少，虽然使用液氮或低温有机溶剂对细胞进行萃取可以最大程度上减少代谢物的损失，但是不同细胞模型所采用的前处理方法不尽相同，目前尚未有标准化前处理流程可以适用所有细胞代谢物的提取分析。③细胞代谢组学的分析对象是相对分子质量小于1 000的代谢物，需要不断更新、优化高通量和高分辨率的分析仪器，提高代谢物的检测灵敏度，以获取更多的细胞代谢物数据。④细胞代谢组学隶属于体外研究的范畴，与生物体复杂的代谢变化存在着一定的差异，为提高研究结果的准确性和可靠性，未来细胞代谢组学的研究方向需整合多组学和多学科的信息，以期更加全面的了解CNS病理机制，获取疾病相关生物标志物信息，进一步评价药物的药效，从而为CNS疾病的新药研发提供参考依据[59-60]。相信随着更多细胞模型的构建以及分析技术的不断发展，细胞代谢组学在CNS疾病研究中将会有更广阔的应用前景。
Application of cellular metabolomics in central nervous system diseases
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摘要: 细胞代谢组学是代谢组学的重要分支，通过细胞代谢组学技术可以动态监测细胞反应及药物作用于细胞后的代谢变化，寻找具有潜在价值的生物标志物，阐明疾病的病理生理机制及药物治疗干预效果，近年来已被广泛应用于疾病机制、药效评价、新药研发等领域。综述细胞代谢组学的研究流程及其在中枢神经系统疾病中的应用，以期为深入研究中枢神经系统疾病的发病机制和药物防治提供理论依据。Abstract: Cell metabolomics is an important branch of metabolomics, which could dynamically monitor cell response and metabolic changes after drugs acting on cells, and look for potential biomarkers. Cell metabolomics has been widely used in illustration of disease mechanism, evaluation of drug efficacy and development of new drug through elucidating the pathophysiological mechanism of the disease and the effect of drug treatment intervention. The researches process of cellular metabolomics and its application in central nervous system diseases were reviewed in order to provide theoretical basis for in-depth study of the pathogenesis and prevention and treatment of central nervous system diseases.
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Key words:
- cellular metabolomics /
- central nervous system diseases /
- cell model /
- biomarkers
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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表 1 细胞代谢组学在中枢神经系统疾病药物研究中的应用
疾病 研究对象 研究药物 检测手段 主要研究结果 参考文献 阿尔茨海默病 PC12细胞
（Aβ25~35）柚皮苷 GC-MS 筛选出甘氨酸、谷氨酸等27种AD差异代谢物，影响氨基酸代谢、碳水化合物代谢及脂质代谢等代谢通路 [27] 脑微血管内皮细胞（Aβ1~42） 丹参 UHPLC-QTOF- MS 发现了33个差异代谢物，涉及精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢等多条代谢通路 [28] SH-SY5Y细胞
（冈田酸）丹参、知母 UHPLC-QTOF- MS 发现了色氨酸、苯丙氨酸等45个潜在AD生物标志物，涉及12条代谢通路，筛选出与丹参相关的30种差异代谢物，与知母相关的7种差异代谢物 [29] SH-SY5Y细胞
（谷氨酸）人参皂苷 Rb1 1H NMR 发现谷氨酸、牛磺酸等7种差异代谢物，涉及5条不同的代谢通路 [30] 帕金森病 SH‐SY5Y细胞
（MPP+）胶质细胞源性神经营养因子 LC‐MS/MS 三酰甘油、磷脂酰胆碱等多种脂质代谢物受到影响 [31] SH-SY5Y细胞
（6-OHDA）花茶 UPLC-TOF-MS 发现多种与神经保护作用相关的代谢物 [32] SH-SY5Y细胞
（A53T基因突变）L-天冬酰胺酶 GC-MS/MS 可以调节谷氨酰胺代谢起到神经保护作用 [33] 抑郁症 PC12细胞
（皮质酮）阿魏酸 UPLC-QTOF-MS 发现24个差异代谢物，涉及氨基酸代谢、能量代谢和甘油磷脂代谢等代谢通路 [34] PC12细胞
（皮质酮）甘草苷 LC-MS 鉴定出谷氨酸、谷胱甘肽等11种潜在差异代谢物，涉及8条不同的代谢通路 [35] PC12细胞
（皮质酮）香附 UPLC-Q-TOF-MS 发现鞘磷脂、甘油磷脂等11种潜在差异代谢物 [36] PC12细胞 氯胺酮、羟基去甲氯胺酮对映体 GC-MS和CE-MS 发现甘油酸盐、柠檬酸盐、亮氨酸等49种潜在生物标志物 [37] 星形胶质细胞 氟西汀 1H NMR 发现17种潜在生物标志物，涉及脂质和氨基酸代谢通路 [38] 星形胶质细胞 文拉法辛 1H NMR 发现赖氨酸、酪氨酸、谷氨酸等31 种涉及能量、氨基酸和脂质代谢的差异代谢物 [39] 
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