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侵袭性念珠菌病（invasive candidiasis）是院内血液感染的第四大原因[1]。由于各类疾病导致的免疫力低下病人增多，光滑念珠菌（Candida glabrata）的感染率逐年递增，引起败血症的数量也随之增加。除白念珠菌外，光滑念珠菌已成为部分国家和地区侵袭性感染中第二常见的念珠菌种类[2]。光滑念珠菌是一种条件致病菌，它广泛存在于自然界，也在人体皮肤黏膜、消化道寄生。当人体免疫功能降低或皮肤黏膜环境发生改变时，光滑念珠菌即可大量繁殖，引起深部脏器感染。与其他念珠菌相比，光滑念珠菌对于抗真菌药物显著耐受[3]，它可以在抗真菌治疗过程中迅速产生耐药性，最终导致治疗失败[4-5]。我国侵袭性真菌耐药监测网（CHIF-NET）2020年统计结果显示，临床常用抗真菌药物氟康唑和伏立康唑对光滑念珠菌的最低抑菌浓度（MIC90）分别32 μg/ml和1 μg/ml。目前治疗光滑念珠菌的药物主要包括广谱三唑类、棘白菌素类以及多烯类抗真菌药。本文对光滑念珠菌的耐药机制进行综述。
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针对念珠菌属使用最广泛的药物当属唑类抗真菌药物。唑类药物通过作用14ɑ-去甲基化酶系统中的细胞色素P450，使环上氮原子与P450的血红素铁结合，阻碍麦角甾醇生物合成，同时致使其合成前体24-甲烯二氢羊毛甾醇累积，从而使念珠菌细胞膜损伤。麦角甾醇是保证念珠菌细胞膜稳定和流动性的重要成分，而ERG11编码的羊毛甾醇14ɑ-去甲基化酶作为关键酶，催化羊毛甾醇生成麦角甾醇。唑类药物通过结合14ɑ-去甲基化酶，阻碍催化过程，而麦角甾醇不足最终导致细胞膜结构改变，念珠菌增殖减少。
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ERG11基因突变导致唑类药物作用靶酶羊毛甾醇14ɑ-去甲基化酶的结构发生变化，其与唑类药物的结合位点消失，无法结合，从而产生耐药性。Hull等[6]在临床耐药分离株中发现ERG11基因G315D突变位点，这导致菌株对唑类药物敏感性降低。Zhang等[7]在念珠菌血流分离株中发现6株光滑念珠菌耐药株，并在其中2株中检测到ERG11基因I166S突变位点，其他4株耐药株并未出现ERG11基因的突变，但仍能产生耐药。由此推测，ERG11基因突变或许不能作为光滑念珠菌耐药的主要原因。
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ERG11基因高表达导致唑类药物的靶酶生成增加，药物无法完全抑制靶酶活性。Upc2A和Rpn4是光滑念珠菌ERG11表达的关键调节因子，RPN4与UPC2A的基因突变是ERG11高表达的主要原因[8-9]。Wang等[10]研究2株耐药分离株，其中1株的CDR1和ERG11高表达，而另1株只有CDR1高表达，尽管验证ERG11高表达确实会导致光滑念珠菌产生耐药，但由于耐药株均存在CDR1高表达，因而ERG11高表达不能作为光滑念珠菌耐药的唯一原因。
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当麦角甾醇生物合成在缺氧或由于甾醇合成缺陷而受到抑制时，甾醇流入转运蛋白基因（AUS1和TIR3）和麦角甾醇生物合成通路中相关基因（ERG2、ERG3、ERG6等）在真菌细胞中表达明显上调。在低氧条件或唑类作用下，细胞中的AUS1表达增加，通过输入外源性胆固醇和麦角甾醇，可使光滑念珠菌得以存活[11]。
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与其他念珠菌不同，光滑念珠菌细胞膜上与耐药性相关的外排泵主要是ABC转运蛋白家族（由念珠菌耐药性CDR1、CDR2、SNQ2基因编码），这类外排泵通过水解ATP获得能量，并通过细胞膜主动外排药物。
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CDR1、CDR2及SNQ2基因高表达导致光滑念珠菌内药物被快速排出，从而对唑类药物产生耐药性。Zhang等[6]在念珠菌血流分离株中发现，光滑念珠菌耐药分离株的CDR1、CDR2基因表达显著增加。Wang等[10]研究两株耐药分离株，发现CDR1基因均高表达。有研究发现[12]，CDR1、CDR2在16种耐药分离株中分别有12及8株高表达，且其中有4株耐药株CDR1、CDR2同时高表达；而有8株耐药株SNQ2表达仅相对升高，这可能说明SNQ2没有单独表达或并非主要外排泵，表明这些ABC转运蛋白之间可能存在相互作用。
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PDR1是ABC转运蛋白家族的上游调节基因。研究发现，Pdr1和Pdr3是酿酒酵母中两种密切相关的蛋白同系物，作用与光滑念珠菌中的Pdr1相似。Yao[13]等在耐药菌株中发现PDR1中的新错义突变位点A848V。Khakhina [14]等发现光滑念珠菌PDR1的作用是酿酒酵母PDR1和PDR3自调节转录作用的结合，PDR1自调节在光滑念珠菌耐药性产生中起重要作用。PDR1基因的功能获得性突变（GOF），会导致CDR1表达上调。Hou[15]等对PDR1多态性进行研究，发现唑类耐药分离株的PDR1多态性比率（14个中的13个，92.9%）明显高于唑类敏感分离株（144个中的28个，19.4%）。
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真菌耐药性产生大多缘于基因突变。DNA错配修复（MMR）系统纠正DNA聚合酶在DNA复制过程中产生的错误，以及修复由环境因素或内源性因素引起的DNA损伤。MSH2为该修复系统的关键基因之一。
Healey[16]等发现有55%携带MSH2功能丧失的突变（LOF），导致体外和体内抗真菌药物耐药性的加速出现，这些突变在氟康唑处理后更为常见。但也有研究表明MSH2序列与氟康唑耐药性或基因型增加之间无明确关联，在这些研究中MSH2被认为是光滑念珠菌的管家基因，即该基因的多态性可能与遗传复合物的差异有关，而与抗真菌药物耐药性不直接相关[15,17]。尽管如此，不能否认MSH2功能丧失的突变引起错误的不匹配修复，进而参与真菌耐药性的发展，其相关性仍有待进一步研究。
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β-葡聚糖是念珠菌细胞壁的基本成分，棘白菌素类药物通过抑制β-1,3-葡聚糖的合成，对念珠菌属发挥杀真菌活性。
多项研究表明，FKS基因突变导致其结合位点改变是棘白菌素耐药性产生的主要原因。Wang[10]等研究2株耐药分离株，对FKS测序显示，2种分离株在FKS2中都含有S663P突变且存在4个单核苷酸多态性（SNP），而FKS1则无突变。同时，FKS1和FKS2的表达均上调。Al-Baqsami[18]等在5种耐米卡芬净的分离株中，发现4株分离株FKS2含有非同义（S663P）突变，1株分离株含有FKS2热点-1（HS1）中的三核苷酸缺失（对应于F659；ΔF659）。Pham[19]等在1037株耐棘白菌素光滑念珠菌中进行FKS测序，检测出47株具有FKS突变。其中，检测出12种独特的突变：FKS1中的5种（15株）和FKS2中的7种（35株）。所有突变都发生在HS1中，没有检测到HS2突变。通过以上研究结果，可推测影响光滑念珠菌对棘白菌素易感性的大多数突变位于FKS1 HS1和FKS2 HS1区域，且FKS2的突变多于FKS1。
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多烯类药物是广泛运用于临床的抗真菌感染的广谱抗菌药。两性霉素B是多烯类的代表药物，通过结合念珠菌细胞膜上的麦角甾醇，形成孔道，以改变念珠菌细胞膜通透性从而使念珠菌死亡。
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真菌能够自身合成甾醇中间体完成代谢，但麦角甾醇缺乏，导致两性霉素B无作用靶点。Hull等[6]在多种临床耐药分离株中发现CG156分离株内仅可检测到14α-甲基化甾醇中间体这一种甾醇，即这种分离株内缺乏麦角甾醇，但该耐药株仍可以在没有外源性供应甾醇的情况下，用14α-甲基化甾醇中间体合成细胞所需的甾醇。
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由ERG6中密码子Tyr192、Trp286或Leu341无义突变导致Erg6蛋白的过早终止；由ERG2中含有的G122S和G119S无义突变导致Erg2蛋白功能受损，最终均导致突变株细胞膜缺乏麦角甾醇，进而破坏细胞膜通透性和流动性[20-23]。
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综上所述，光滑念珠菌作为临床上较为重要的致病菌之一，由于抗真菌药物种类有限，临床应用重复率高，导致的耐药问题日益严重。因此，一方面需要临床合理用药、联合用药，尽量避免耐药性的产生；另一方面，需要研发新型抗真菌药物。有研究表明[24-28]，阿魏酸与卡泊芬净，薄荷醇、百里酚、替加环素、绒毛钩藤不溶性成分与唑类药物的协同作用，通过损伤念珠菌生物被膜等方式，可以有效降低唑类耐药菌的MIC。也有研究开辟新的思路，寻找新的药物靶点：合成的铋纳米颗粒可以潜在地用于改善氧化应激和各种微生物感染，对念珠菌病病例有强大抗真菌能力[29]；4种双鸟胍衍生物（BG1-BG4）对光滑念珠菌和白念珠菌的MIC在2~15.6 μg/ml之间，其中BG3作用于DNA，扰乱复制转录过程，导致在细胞质膜外层的磷脂酰丝氨酸暴露，半胱氨酸蛋白酶活化，促进真菌细胞凋亡[30]。药物研发和探索是漫长的过程，需要一代代人的验证和实践，但可以预见，在不久的将来，这些药物最终会有一部分应用于临床实践中，为缓解临床耐药问题提供新的选择。
Research progress on drug resistance mechanism of Candida glabrata
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摘要: 随着念珠菌病患者中感染光滑念珠菌的比例逐年增加，光滑念珠菌已成为除白念珠菌、热带念珠菌外较为常见的致病念珠菌之一。抗光滑念珠菌的药物种类有限，随之而来的耐药问题日益严重，为临床治疗带来困难。本文综述了光滑念珠菌对唑类、棘白菌素类及多烯类药物的耐药机制。Abstract: With the increasing proportion of Candida glabrata in patients with candidiasis, C. glabrata has become one of the most common pathogenic Candida in clinical practice. There are limited types of antifungal drugs, and the consequent problem of drug resistance is severely increasing, which brings difficulties to clinical treatment. The resistance mechanisms of C. glabrata to azoles, echinocandins and polyenes were reviewed in this paper.
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Key words:
- Candida glabrata /
- azole /
- echinocandin /
- polyene /
- drug resistance
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目前全球抑郁症的发病率为4.2%，中国已达6.9%，据世界卫生组织报道，抑郁症已成为导致人类死亡和致残的第二大类疾病[1]。百合知母汤始见于张仲景的《金匮要略•百合狐惑阴阳毒病脉证并治第三篇》，由知母和百合两味中药组成，两药配伍有养阴清热、除烦润燥之效，以润养心肺为大法，主治百合病[2]。百合病与现代医学的失眠多梦和抑郁症有很大关联[3]，而百合知母汤也已成为中医药治疗抑郁症、失眠、焦虑等精神神经性疾病的经典方药[4]。知百安神口服液来源于经典古方百合知母汤，按照方中百合与知母2∶1配比制备而成，在海军军医大学长征医院临床使用多年，用于抑郁症、失眠等症的治疗，疗效显著。本研究采用正交试验设计法，以主要成分芒果苷的含量为检测指标，对知百安神口服液制备工艺进行优化，并进行稳定性研究，为其质量控制、工业生产提供科学依据。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent 1200系列高效液相色谱仪（Agilent，美国）；台式高速冷冻离心机（Eppendorf，德国）；CPA225D十万分之一天平（Sartorius，德国）；WL-901涡旋振荡混合器（其林贝尔仪器制造有限公司，海门）；SK7200H型超声仪（科导超声仪器有限公司，上海）；SHH-250SD药物稳定性试验箱（重庆永生实验仪器厂，温度：15～65 ℃，±2 ℃，湿度：15%～95%，±5%）。
1.2 试药
知百安神口服液（中药材购自铜陵禾田中药饮片股份有限公司，口服液由海军军医大学长征医院制剂室制备）；芒果苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111607-201503，含量98.4%）；甲醇、乙腈、二氯甲烷为色谱纯试剂（Merck，德国）；甲酸为分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）；水为纯净水。
2. 方法与结果
2.1 芒果苷的含量测定
2.1.1 色谱条件
色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长为246 nm；流速1 ml/min；柱温30 ℃；进样量为5 μl。理论塔板数按芒果苷计算应不低于20 000。
表 1 梯度洗脱程序时间（t/min） A. 乙腈（%） B. 0.2%甲酸水溶液（%） 0 5 95 5 10 90 10 10 90 20 13 87 25 13 87 30 5 95 2.1.2 对照品溶液的制备
取芒果苷对照品适量，精密称定，用70%乙醇溶液溶解并稀释制成每1 ml中含0.15 mg芒果苷的溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备
精密量取知百安神口服液10 ml，用10 ml二氯甲烷萃取，震摇，静置，待完全分离。精密量取水相4 ml，加水定容至25 ml，经0.45 μm薄膜过滤，作为供试品溶液。
2.1.4 标准曲线的制备
取芒果苷对照品适量，精密称定，用70%乙醇溶液溶解并稀释，制成每1 ml中含1.04 mg芒果苷的溶液，作为对照品母液，采用逐级稀释的方法，将芒果苷配制成208、156、104、78、52、26、10.4 μg/ml的对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积对浓度进行线性回归分析，得回归方程为Y=16.56X−5.412（r=0.999 9），结果表明芒果苷在10.4～208 μg/ml范围内线性关系良好。
2.1.5 精密度试验
取“2.1.2”项下对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积，计算得到芒果苷峰面积的RSD为0.24%，表明仪器精密度良好。
2.1.6 稳定性试验
精密量取知百安神口服液（批号：120208）适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24 h后进样测定，计算得到芒果苷含量的RSD为0.72%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.1.7 重复性试验
精密量取知百安神口服液（批号：120208）适量，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。计算得到芒果苷含量的RSD为1.18%，结果表明该方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验
精密量取知百安神口服液（批号：120208）6份，每份5 ml，分别加入104 μg/ml的芒果苷对照品溶液各5 ml，混匀，按照“2.1.3”项下方法制备，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。计算得芒果苷的平均加样回收率为99.47%，RSD为0.86%，表明该方法准确度良好。
2.2 提取方法的选择
水提醇沉法是广泛应用于中药的提取方法，其操作方法简单，生产成本低廉，更适合于规模化生产。本实验依据大生产实际情况对制备工艺采用正交设计，拟对中药水醇提取法影响较大的因素即提取加水量、提取时间、提取次数和醇沉浓度为影响因素进行考察，但参照文献[5]发现，提取次数不适合加入到正交设计中，经过预实验结果并结合工艺化大生产能源等消耗考虑，确定提取次数为2次，可达到提取要求。因此，参照L9(34)设计正交试验，加水量为药材总量的6、10、12倍，提取时间为1、2、3 h，醇沉浓度为40%、60%、80%，以芒果苷的含量为检测指标，优选最佳提取工艺，见表2。
表 2 正交试验因素水平表水平 A因素加水量
（倍）B因素提取时间
（t/h）C因素醇沉浓度
（%）1 6 1 40 2 10 2 60 3 12 3 80 2.3 知百安神口服液正交试验结果
按处方称取各味药材共9份，按表2条件进行提取，按“2.1”项下方法进行含量测定，结果折合知百安神口服液芒果苷的含量（μg/ml），结果见表3。
表 3 正交试验结果编号 因素 芒果苷含量（μg/ml） A B C 1 1 1 1 371.58 2 1 2 2 453.26 3 1 3 3 282.74 4 2 1 2 504.40 5 2 2 3 300.59 6 2 3 1 370.01 7 3 1 3 440.91 8 3 2 1 293.82 9 3 3 2 381.15 K1 369.19 438.96 343.86 K2 391.67 349.22 446.27 K3 371.96 344.63 341.41 R 22.48 94.33 104.86 从正交试验结果可以看出，A、B、C三因素影响大小排序为C>B>A，即醇沉浓度为最大影响因素，经过极差分析并结合能源成本和工业操作的简便有效性，确定最佳工艺为A2B1C2，即10倍量水煎煮1 h，以60%醇浓度为醇沉浓度。
结合课题组前期研究和以上试验结果，知百安神口服液制备工艺的一般流程为：称取百合667 g、知母333 g，加10倍量水煎煮2次，每次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.24（50 ℃）的清膏，加入乙醇使含醇量达60%，4 ℃静置72 h，滤过，加单糖浆200 ml，加水至1000 ml，搅匀、煮沸、放冷、滤过、灌封、灭菌即得。
依据上述优化的工艺，于本院制剂室扩大生产，依据“2.1”项下芒果苷的测定方法对3批（批号：170406、180104、180713）中试产品进行测定，所测芒果苷的含量分别为780.9、657.7、621.0 μg/ml。
2.4 知百安神口服液稳定性研究
根据制剂稳定性试验指导原则（《中国药典》2020年版四部制剂通则9000）及口服溶液剂（《中国药典》2020年版四部制剂通则0123）有关规定，取3批知百安神口服液（批号：170406-1、170406-2、170406-3），在温度（40±2）℃、相对湿度（75±5）%的条件下放置6个月进行加速试验，于第0、1、2、3、6个月末分别取样，按稳定性重点考察项目检测。另取3批知百安神口服液（批号：170406、180104、180713），在温度（25±2）℃、相对湿度（60±10）%的条件下放置12个月进行长期试验，分别于第0、3、6、9、12个月取样，按稳定性重点考察项目进行检测。稳定性加速试验和长期试验结果提示，知百安神口服液在12个月内稳定。结果见表4、表5。
表 4 知百安神口服液稳定性加速试验结果批号 检查项目 考察时间 性状 pH值 相对密度 芒果苷含量
（μg/ml）170406-1 0个月 棕褐色液体 4.30 1.08 780.9 1个月 棕褐色液体 4.34 1.09 660.9 2个月 棕褐色液体 4.45 1.08 654.1 3个月 棕褐色液体 4.24 1.07 531.2 6个月 棕褐色液体 4.46 1.05 456.8 170406-2 0个月 棕褐色液体 4.31 1.09 750.0 1个月 棕褐色液体 4.64 1.08 630.5 2个月 棕褐色液体 4.35 1.08 588.8 3个月 棕褐色液体 4.54 1.08 541.9 6个月 棕褐色液体 4.59 1.07 406.1 170406-3 0个月 棕褐色液体 4.30 1.08 789.1 1个月 棕褐色液体 4.19 1.09 671.3 2个月 棕褐色液体 4.13 1.07 611.9 3个月 棕褐色液体 4.39 1.06 500.6 6个月 棕褐色液体 4.56 1.05 438.9 表 5 知百安神口服液稳定性长期试验结果批号 检查项目 考察时间 性状 pH值 相对密度 芒果苷含量
（μg/ml）170406 0个月 棕褐色液体 4.30 1.08 780.9 3个月 棕褐色液体 4.91 1.08 667.9 6个月 棕褐色液体 4.71 1.07 604.8 9个月 棕褐色液体 4.24 1.06 540.6 12个月 棕褐色液体 4.15 1.04 434.0 180104 0个月 棕褐色液体 4.60 1.09 657.7 3个月 棕褐色液体 4.64 1.08 603.4 6个月 棕褐色液体 4.57 1.08 432.0 9个月 棕褐色液体 4.77 1.06 354.0 12个月 棕褐色液体 4.69 1.05 352.0 180713 0个月 棕褐色液体 4.43 1.09 621.0 3个月 棕褐色液体 5.09 1.08 703.2 6个月 棕褐色液体 4.70 1.08 524.0 9个月 棕褐色液体 4.69 1.07 483.1 12个月 棕褐色液体 4.78 1.07 439.9 3. 讨论
本课题组在前期研究工作中对知百安神口服液的质量标准进行了系统研究[6]，笔者选取芒果苷作为工艺研究的指标及所用芒果苷的含量测定方法，即以前期研究工作为基础进行。
前期工作中发现，随着放置时间的延长，该口服液的pH值变化较大，发现原因是口服液瓶盖中的胶塞材质为天然橡胶，天然橡胶塞长时间与药液接触会对药液pH值产生影响，更换为硅胶塞后，稳定性试验结果显示口服液的pH值可保持稳定，本研究中采用的均为更换后的现行包装。
文献报道[7]芒果苷可能受溶液pH值和温度的影响而不稳定，知百安神口服液的稳定性试验结果也证实了这点。从结果可以看出，芒果苷在水溶液的状态下，3个月内含量可稳定在10%以内，超过3个月会加速降解。《中国药典》2020年版对知母含量测定要求是检测芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量，但知母皂苷BⅡ需要应用蒸发光散射检测器检测，由于蒸发光散射检测器的检测误差较大，并不适用于制剂工艺考察。考虑到芒果苷是知百安神口服液的主要成分[6]，且制剂工艺考察周期并不长（不超过1个月），芒果苷又利于快速便捷检测，因此，选择芒果苷作为指标成分，优化知百安神口服液的提取工艺，而利用稳定性考察结果制订制剂的有效期则需考察多种检验因素，还需进一步研究。
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