-
侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis)是院内血液感染的第四大原因[1]。由于各类疾病导致的免疫力低下病人增多,光滑念珠菌(Candida glabrata)的感染率逐年递增,引起败血症的数量也随之增加。除白念珠菌外,光滑念珠菌已成为部分国家和地区侵袭性感染中第二常见的念珠菌种类[2]。光滑念珠菌是一种条件致病菌,它广泛存在于自然界,也在人体皮肤黏膜、消化道寄生。当人体免疫功能降低或皮肤黏膜环境发生改变时,光滑念珠菌即可大量繁殖,引起深部脏器感染。与其他念珠菌相比,光滑念珠菌对于抗真菌药物显著耐受[3],它可以在抗真菌治疗过程中迅速产生耐药性,最终导致治疗失败[4-5]。我国侵袭性真菌耐药监测网(CHIF-NET)2020年统计结果显示,临床常用抗真菌药物氟康唑和伏立康唑对光滑念珠菌的最低抑菌浓度(MIC90)分别32 μg/ml和1 μg/ml。目前治疗光滑念珠菌的药物主要包括广谱三唑类、棘白菌素类以及多烯类抗真菌药。本文对光滑念珠菌的耐药机制进行综述。
-
针对念珠菌属使用最广泛的药物当属唑类抗真菌药物。唑类药物通过作用14ɑ-去甲基化酶系统中的细胞色素P450,使环上氮原子与P450的血红素铁结合,阻碍麦角甾醇生物合成,同时致使其合成前体24-甲烯二氢羊毛甾醇累积,从而使念珠菌细胞膜损伤。麦角甾醇是保证念珠菌细胞膜稳定和流动性的重要成分,而ERG11编码的羊毛甾醇14ɑ-去甲基化酶作为关键酶,催化羊毛甾醇生成麦角甾醇。唑类药物通过结合14ɑ-去甲基化酶,阻碍催化过程,而麦角甾醇不足最终导致细胞膜结构改变,念珠菌增殖减少。
-
ERG11基因突变导致唑类药物作用靶酶羊毛甾醇14ɑ-去甲基化酶的结构发生变化,其与唑类药物的结合位点消失,无法结合,从而产生耐药性。Hull等[6]在临床耐药分离株中发现ERG11基因G315D突变位点,这导致菌株对唑类药物敏感性降低。Zhang等[7]在念珠菌血流分离株中发现6株光滑念珠菌耐药株,并在其中2株中检测到ERG11基因I166S突变位点,其他4株耐药株并未出现ERG11基因的突变,但仍能产生耐药。由此推测,ERG11基因突变或许不能作为光滑念珠菌耐药的主要原因。
-
ERG11基因高表达导致唑类药物的靶酶生成增加,药物无法完全抑制靶酶活性。Upc2A和Rpn4是光滑念珠菌ERG11表达的关键调节因子,RPN4与UPC2A的基因突变是ERG11高表达的主要原因[8-9]。Wang等[10]研究2株耐药分离株,其中1株的CDR1和ERG11高表达,而另1株只有CDR1高表达,尽管验证ERG11高表达确实会导致光滑念珠菌产生耐药,但由于耐药株均存在CDR1高表达,因而ERG11高表达不能作为光滑念珠菌耐药的唯一原因。
-
当麦角甾醇生物合成在缺氧或由于甾醇合成缺陷而受到抑制时,甾醇流入转运蛋白基因(AUS1和TIR3)和麦角甾醇生物合成通路中相关基因(ERG2、ERG3、ERG6等)在真菌细胞中表达明显上调。在低氧条件或唑类作用下,细胞中的AUS1表达增加,通过输入外源性胆固醇和麦角甾醇,可使光滑念珠菌得以存活[11]。
-
与其他念珠菌不同,光滑念珠菌细胞膜上与耐药性相关的外排泵主要是ABC转运蛋白家族(由念珠菌耐药性CDR1、CDR2、SNQ2基因编码),这类外排泵通过水解ATP获得能量,并通过细胞膜主动外排药物。
-
CDR1、CDR2及SNQ2基因高表达导致光滑念珠菌内药物被快速排出,从而对唑类药物产生耐药性。Zhang等[6]在念珠菌血流分离株中发现,光滑念珠菌耐药分离株的CDR1、CDR2基因表达显著增加。Wang等[10]研究两株耐药分离株,发现CDR1基因均高表达。有研究发现[12],CDR1、CDR2在16种耐药分离株中分别有12及8株高表达,且其中有4株耐药株CDR1、CDR2同时高表达;而有8株耐药株SNQ2表达仅相对升高,这可能说明SNQ2没有单独表达或并非主要外排泵,表明这些ABC转运蛋白之间可能存在相互作用。
-
PDR1是ABC转运蛋白家族的上游调节基因。研究发现,Pdr1和Pdr3是酿酒酵母中两种密切相关的蛋白同系物,作用与光滑念珠菌中的Pdr1相似。Yao[13]等在耐药菌株中发现PDR1中的新错义突变位点A848V。Khakhina [14]等发现光滑念珠菌PDR1的作用是酿酒酵母PDR1和PDR3自调节转录作用的结合,PDR1自调节在光滑念珠菌耐药性产生中起重要作用。PDR1基因的功能获得性突变(GOF),会导致CDR1表达上调。Hou[15]等对PDR1多态性进行研究,发现唑类耐药分离株的PDR1多态性比率(14个中的13个,92.9%)明显高于唑类敏感分离株(144个中的28个,19.4%)。
-
真菌耐药性产生大多缘于基因突变。DNA错配修复(MMR)系统纠正DNA聚合酶在DNA复制过程中产生的错误,以及修复由环境因素或内源性因素引起的DNA损伤。MSH2为该修复系统的关键基因之一。
Healey[16]等发现有55%携带MSH2功能丧失的突变(LOF),导致体外和体内抗真菌药物耐药性的加速出现,这些突变在氟康唑处理后更为常见。但也有研究表明MSH2序列与氟康唑耐药性或基因型增加之间无明确关联,在这些研究中MSH2被认为是光滑念珠菌的管家基因,即该基因的多态性可能与遗传复合物的差异有关,而与抗真菌药物耐药性不直接相关[15,17]。尽管如此,不能否认MSH2功能丧失的突变引起错误的不匹配修复,进而参与真菌耐药性的发展,其相关性仍有待进一步研究。
-
β-葡聚糖是念珠菌细胞壁的基本成分,棘白菌素类药物通过抑制β-1,3-葡聚糖的合成,对念珠菌属发挥杀真菌活性。
多项研究表明,FKS基因突变导致其结合位点改变是棘白菌素耐药性产生的主要原因。Wang[10]等研究2株耐药分离株,对FKS测序显示,2种分离株在FKS2中都含有S663P突变且存在4个单核苷酸多态性(SNP),而FKS1则无突变。同时,FKS1和FKS2的表达均上调。Al-Baqsami[18]等在5种耐米卡芬净的分离株中,发现4株分离株FKS2含有非同义(S663P)突变,1株分离株含有FKS2热点-1(HS1)中的三核苷酸缺失(对应于F659;ΔF659)。Pham[19]等在1037株耐棘白菌素光滑念珠菌中进行FKS测序,检测出47株具有FKS突变。其中,检测出12种独特的突变:FKS1中的5种(15株)和FKS2中的7种(35株)。所有突变都发生在HS1中,没有检测到HS2突变。通过以上研究结果,可推测影响光滑念珠菌对棘白菌素易感性的大多数突变位于FKS1 HS1和FKS2 HS1区域,且FKS2的突变多于FKS1。
-
多烯类药物是广泛运用于临床的抗真菌感染的广谱抗菌药。两性霉素B是多烯类的代表药物,通过结合念珠菌细胞膜上的麦角甾醇,形成孔道,以改变念珠菌细胞膜通透性从而使念珠菌死亡。
-
真菌能够自身合成甾醇中间体完成代谢,但麦角甾醇缺乏,导致两性霉素B无作用靶点。Hull等[6]在多种临床耐药分离株中发现CG156分离株内仅可检测到14α-甲基化甾醇中间体这一种甾醇,即这种分离株内缺乏麦角甾醇,但该耐药株仍可以在没有外源性供应甾醇的情况下,用14α-甲基化甾醇中间体合成细胞所需的甾醇。
-
由ERG6中密码子Tyr192、Trp286或Leu341无义突变导致Erg6蛋白的过早终止;由ERG2中含有的G122S和G119S无义突变导致Erg2蛋白功能受损,最终均导致突变株细胞膜缺乏麦角甾醇,进而破坏细胞膜通透性和流动性[20-23]。
-
综上所述,光滑念珠菌作为临床上较为重要的致病菌之一,由于抗真菌药物种类有限,临床应用重复率高,导致的耐药问题日益严重。因此,一方面需要临床合理用药、联合用药,尽量避免耐药性的产生;另一方面,需要研发新型抗真菌药物。有研究表明[24-28],阿魏酸与卡泊芬净,薄荷醇、百里酚、替加环素、绒毛钩藤不溶性成分与唑类药物的协同作用,通过损伤念珠菌生物被膜等方式,可以有效降低唑类耐药菌的MIC。也有研究开辟新的思路,寻找新的药物靶点:合成的铋纳米颗粒可以潜在地用于改善氧化应激和各种微生物感染,对念珠菌病病例有强大抗真菌能力[29];4种双鸟胍衍生物(BG1-BG4)对光滑念珠菌和白念珠菌的MIC在2~15.6 μg/ml之间,其中BG3作用于DNA,扰乱复制转录过程,导致在细胞质膜外层的磷脂酰丝氨酸暴露,半胱氨酸蛋白酶活化,促进真菌细胞凋亡[30]。药物研发和探索是漫长的过程,需要一代代人的验证和实践,但可以预见,在不久的将来,这些药物最终会有一部分应用于临床实践中,为缓解临床耐药问题提供新的选择。
Research progress on drug resistance mechanism of Candida glabrata
-
摘要: 随着念珠菌病患者中感染光滑念珠菌的比例逐年增加,光滑念珠菌已成为除白念珠菌、热带念珠菌外较为常见的致病念珠菌之一。抗光滑念珠菌的药物种类有限,随之而来的耐药问题日益严重,为临床治疗带来困难。本文综述了光滑念珠菌对唑类、棘白菌素类及多烯类药物的耐药机制。Abstract: With the increasing proportion of Candida glabrata in patients with candidiasis, C. glabrata has become one of the most common pathogenic Candida in clinical practice. There are limited types of antifungal drugs, and the consequent problem of drug resistance is severely increasing, which brings difficulties to clinical treatment. The resistance mechanisms of C. glabrata to azoles, echinocandins and polyenes were reviewed in this paper.
-
Key words:
- Candida glabrata /
- azole /
- echinocandin /
- polyene /
- drug resistance
-
花椒为芸香科植物红花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.或青花椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.的干燥成熟果皮,味辛,性温,具有温中止痛、杀虫止痒的功效,主治脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛[1]。生物碱是花椒的主要特征性成分,组成丰富、结构多样,具有抗炎、镇痛、抗菌、抗氧化、降脂和抗肿瘤等多种药理活性[2-8]。其中,不饱和脂肪酰胺类生物碱如羟基-α-山椒素(HAS)、羟基-β-山椒素(HBS)已经被证实能够调节脂质代谢,对非酒精性脂肪肝病等代谢性疾病的预防具有潜在效果[9]。然而,对花椒生物碱的制备、富集纯化工艺优化的研究较少。花椒生物碱高效提取与纯化是其后续活性评价和产品开发的基础,有利于花椒药用价值的深度开发,因此优化花椒生物碱的富集纯化工艺具有重要意义。
大孔吸附树脂法是最常用的富集纯化手段,具有选择性好、吸附能力强、富集效果好、环保绿色等优点,在中药材、中药制剂方面应用广泛[10-11]。因此,本实验以HAS、HBS的得率为指标,筛选适宜纯化花椒生物碱的大孔树脂类型,采用单因素实验和正交试验确定树脂的最佳吸附、除杂、洗脱条件,建立大孔树脂富集纯化花椒生物碱的最佳工艺。采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MSE)技术鉴定成分,以期为花椒生物碱的物质基础研究和进一步的综合开发利用提供科学依据。
1. 材料
1.1 样品
花椒药材(批号:20220705-2,购于陕西省渭南韩城市),经海军军医大学张成中副教授鉴定为芸香科花椒属红花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim)的干燥果皮。
1.2 仪器与试剂
1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Acquity I-CLASSTM UPLC 超高效液相色谱系统、Xevo G2-XS 四级杆串联飞行时间质谱(美国沃特世科技有限公司);R-100型旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司);XS205DU电子分析天平(梅特勒托利多科技公司)。
HAS对照品(纯度≥98%,批号:P2834270,源叶);HBS对照品(纯度≥98%,批号:P2832664,诗丹德);95%乙醇(分析纯,上海泰坦科技股份有限公司);甲酸、甲醇、乙腈(色谱纯,赛默飞世尔科技公司);APS-17型、NKA-9型、HP-20型、AB-8型大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司);HPD-400型大孔吸附树脂(上海一飞生物科技有限公司);HP-20型大孔吸附树脂(日本三菱化学株式会社)。
2. 方法
2.1 花椒中生物碱成分含量测定方法的建立
2.1.1 溶液的配制
称取50 g花椒于圆底烧瓶中,加入500 ml的50%乙醇,95℃水浴加热,回流提取1 h,共提取3次。过滤后合并滤液,45℃减压浓缩至无醇味,过滤,加水分散至250 ml,即得上样液。
取216 ml上样液,上样于直径为2.7 cm、高度为18.9 cm的三菱HP-20型大孔树脂柱,动态吸附30 min,静置1 h后,取216 ml 20%乙醇除杂24 min;540 ml 80%乙醇洗脱1 h。收集洗脱液,45℃减压浓缩并干燥,即得提取物粉末。
对照品溶液:精密称定HAS、HBS对照品适量,加50%乙醇定容,分别制成0.61 mg/ml、0.11 mg/ml的对照品溶液。
供试品溶液:精密称定适量提取物粉末,加50%乙醇定容后,0.45 μm微孔滤膜过滤,即为供试品溶液。
2.1.2 色谱条件
色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm);流速:0.3 ml/min;检测波长:270 nm;柱温:30℃;进样量:5 μl。流动相:乙腈(A)-0.1%三乙胺(B);洗脱梯度:0~18 min,10%→35%A;18~30 min,35%→50%A;30~36 min,50%→90%A,36~39 min,90%A,39~40 min,90%→10%A。
2.1.3 线性关系
取HAS对照品溶液、HBS对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ml置于5个5 ml容量瓶中,50%乙醇定容至刻度,摇匀后得到系列梯度浓度的标准工作溶液,0.45 μm微孔滤膜过滤,在“2.1.2”项下色谱条件下进样。
2.1.4 精密度
取“2.1.1”项下对照品溶液2.0 ml置于5 ml容量瓶中,50%乙醇定容至刻度,混匀后0.45 μm微孔滤膜过滤,连续进样6次。
2.1.5 稳定性
取“2.1.1”项下的供试品溶液,于0、1、2、4、8、24 h分别进样。
2.1.6 重复性
按照“2.1.1”项方法平行制备供试品溶液 6 份,在“2.1.2”项下色谱条件进样测定。
2.1.7 加样回收率
精密称取已知HAS、HBS含量的花椒生物碱粉末适量, 共取9份,分别准确加入HAS、HBS对照品适量,按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液,进样分析并计算加样回收率。
2.2 大孔树脂纯化富集工艺优化
2.2.1 树脂类型
95%乙醇浸泡树脂24 h,充分溶胀后湿法装柱,95%乙醇淋至洗脱液澄清透明,水洗至洗脱液无醇味,备用。取预处理后的不同类型的大孔树脂,按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液并进样,计算HAS、HBS的总得率。
2.2.2 上样量
湿法装柱,取“2.1.1”项下制备的上样液450 ml,以2 BV/h上样,流出液每30 ml收集1份。按“2.1.2”项下色谱条件进样,以累计上样体积(V/ml)为横坐标(X),以HAS、HBS的总泄漏率(%)为纵坐标(Y),绘制泄漏曲线。
2.2.3 单因素实验考察上样条件
除变量外固定其他工艺条件(树脂类型、上样量与树脂体积比、除杂溶剂、除杂体积、除杂流速、洗脱溶剂、洗脱体积及洗脱流速分别为三菱HP-20型、1 g∶2.5 ml、10%乙醇,2 BV、5 BV/h、70%乙醇、5 BV及5 BV/h)不变的情况下,分别考察上样液浓度(0.1、0.2、0.4 g生药/ml)、树脂柱径高比(1∶5、1∶7、1∶9)及吸附流速(1、2、4 BV/h)对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响。
2.2.4 正交试验考察除杂、洗脱条件
在单因素实验的基础上,采用L9(33)正交试验进一步分析除杂条件(除杂溶剂、体积、流速)、洗脱条件(洗脱溶剂、体积、流速)对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响(表1),总结最佳工艺并进行验证。统计分析使用SPSS 26.0 软件。
表 1 除杂、洗脱条件正交试验因素水平表条件 水平 因素 A因素溶剂 B因素体积(BV) C因素流速(BV/h) 除杂 1 蒸馏水 1 2 2 10%乙醇 2 3 3 20%乙醇 3 5 洗脱 1 55%乙醇 3 2 2 70%乙醇 5 3 3 80%乙醇 8 5 2.3 花椒生物碱的化学成分分析
2.3.1 样品制备
精密称定“2.2.4”项下以最佳工艺制备的花椒生物碱粉末5.0 mg,50%甲醇定容至25 ml,0.45 μm微孔滤膜过滤备用。
2.3.2 色谱条件
色谱柱:Waters ACQUITY HSS T3柱(2.1×100 mm, 1.7 μm);检测波长:270 nm;流速:0.3 ml/min;柱温:30℃;进样量:3 μl。流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸水(B),洗脱梯度:0~18 min,10%→35%A;18~24 min,35%→46%A;24~30 min,46%→90%A;30~32 min,90%A;32~33 min,90%~10%A;33~36 min,10%A。
2.3.3 质谱条件
电喷雾离子源(ESI),正离子模式扫描。离子源温度120℃,雾化气流速为800 L/h,毛细管电压为3.0 kV。锥孔电压40 V,补偿电压80 V。低能量扫描电压6 eV,高能量扫描电压30~60 eV;喷雾器压力为6.5×105 Pa,气帘气体积流量为50 L/h,扫描范围m/z为50~
1500 。亮氨酸-脑啡肽(m/z∶ 554.261 5 [M-H]−)和(m/z∶ 556.277 1[M+H]+)作为外标进行质量实时校正,体积流量设为5 μl/min。MassLynx V4.1工作站使用MSE模式采集质谱数据。
3. 结果与分析
3.1 HPLC图与方法学实验结果
3.1.1 花椒生物碱的HPLC图
供试品HPLC图如图1所示,该色谱条件下,HAS与HBS色谱峰分离度大于1.5、理论塔板数均大于
30000 、峰形稳定、无干扰,能够满足样品分析检测要求。3.1.2 线性关系考察结果
以对照品溶液的浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),得到HAS的回归方程Y=
3312.7 X−8.887,r=0.999;HBS的回归方程Y=33030 X+12.061,r=0.999。即HAS、HBS分别在进样浓度为24.4~488 μg/ml、4.4~88 μg/ml范围内呈良好的线性关系。3.1.3 精密度实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.94%、0.34%,仪器精密度良好,符合定量测定要求。
3.1.4 稳定性实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.20%、0.43%,表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。
3.1.5 重复性实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.26% 和0.26%,表明方法重复性良好。
3.1.6 加样回收率实验结果
计算得到HAS低、中、高浓度的加样回收率分别为(103.66±0.62)%、(100.22±3.10)%、(102.47±1.24)%;HBS的低、中、高浓度的加样回收率分别为(101.35±0.89)%、(98.58±2.48)%、(98.86±1.02)%。结果表明该测定方法准确性好,可用于样品中HAS、HBS的含量测定。
3.2 大孔树脂纯化富集工艺
3.2.1 树脂类型的确定
使用三菱HP-20型树脂富集花椒生物碱类成分时,HAS、HBS两成分的总含量(X)最高且结果稳定,结果见表2。因此,优选三菱HP-20型大孔吸附树脂进行后续实验。
表 2 不同类型树脂对HAS、HBS总得率的影响(n=3)树脂类型 HAS、HBS
总浓度(mg/ml)HAS、HBS
总含量(%)$ \bar{X} $±SD(%) APS-17 2.42 4.06 4.06±2.17 NKA-9 2.08 3.50 3.50±1.76 宝恩HP-20 3.68 6.19 6.19±1.09 AB-8 3.58 6.02 6.02±1.28 HPD-400 3.59 6.03 6.03±0.98 三菱HP-20 4.10 6.89 6.89±0.62 3.2.2 上样量的确定
由图2可知,当上样液体积为90 ml时,花椒生物碱开始少量泄漏;随着上样体积增加,流出液中生物碱浓度呈现上升趋势;当上样液为210 ml时,累计泄漏率为9.61%,接近上样液中HAS、HBS总浓度的10%[12]。因此确定最大上样量为210 ml,即上样生药量与树脂体积比约为1 g∶2.5 ml。
3.2.3 上样条件的确定
由图3可知,当上样液浓度为0.2 g生药/ml时,HAS和HBS的得率最高;随着浓度升高,杂质增多,与生物碱竞争吸附活性位点,得率下降;此外高浓度上样液在静置吸附过程中较容易发生絮凝和沉淀现象[13-14]。故优选上样液浓度为0.2 g生药/ml。树脂径高比为1∶7、吸附流速为4 BV/h时,HAS和HBS的总得率最高。故选用树脂径高比为1∶7的三菱HP-20型树脂柱,动态吸附流速为4 BV/h。
3.2.4 除杂、洗脱条件的确定
如表3所示,以HAS、HBS总得率为指标时,影响三菱HP-20型大孔树脂纯化花椒总生物碱的除杂因素依次为除杂溶剂(A)>除杂流速(C)>除杂体积(B)。除杂的最佳条件为20%乙醇、流速为5 BV/h。除杂体积由2 BV提升到3 BV,结果差异并不明显,为节约溶剂、提高效率,优选2 BV为除杂体积。
表 3 除杂条件L9(33)正交设计及结果编号 因素 总得率(%) 除杂溶剂(A) 除杂体积(B) 除杂流速(C) 1 1 1 1 7.87 2 1 2 2 9.09 3 1 3 3 9.31 4 2 1 2 10.33 5 2 2 3 10.42 6 2 3 1 10.67 7 3 1 3 11.82 8 3 2 1 10.73 9 3 3 2 11.66 k1 8.75 10.06 9.71 − k2 10.44 10.07 10.34 − k3 11.37 10.48 10.52 − R 2.62 0.64 0.81 − 由表4可知,洗脱因素对HAS、HBS总得率的影响次序依次为洗脱溶剂(A)>洗脱流速(C)>洗脱体积(B);最佳组合条件为洗脱溶剂80%乙醇,洗脱体积为5 BV,洗脱流速5 BV/h。
表 4 洗脱条件L9(33)正交设计及结果编号 因素 总得率
(%)洗脱溶剂(A) 洗脱体积(B) 洗脱流速(C) 1 1 1 1 2.55 2 1 2 2 5.38 3 1 3 3 7.15 4 2 1 2 5.75 5 2 2 3 8.11 6 2 3 1 9.57 7 3 1 3 9.20 8 3 2 1 8.28 9 3 3 2 6.36 k1 5.03 5.83 6.80 − k2 7.81 7.26 5.83 − k3 7.95 7.69 8.15 − R 2.92 1.86 2.32 − 3.2.5 花椒生物碱富集纯化最佳工艺及验证
实验确立花椒生物碱制备的最佳工艺为料液比1∶10,溶剂为50%乙醇,95℃水浴加热,每次回流提取1 h,提取3次,过滤后合并滤液;45℃减压浓缩至无醇味,纱布过滤,加水分散至生药浓度相当于0.2 g/ml的上样液;按上样生药量与大孔吸附树脂的体积比1 g∶2.5 ml,上样于三菱HP-20型大孔树脂,树脂柱径高比1∶7,动态吸附流速4 BV/h,静置1 h后,2 BV、20%乙醇以5 BV/h除杂;80%乙醇洗脱,体积5 BV,流速5 BV/h。收集洗脱液,45℃减压浓缩并干燥,即得花椒生物碱提取物。
由表5可知,三次重复实验花椒生物碱得膏率相近,富集纯化后HAS、HBS总含量的RSD为0.87%,证明本方法确定的大孔树脂富集纯化花椒生物碱的工艺稳定可靠,重复性高。此外,经纯化后花椒生物碱中HAS、HBS的含量分别为4.71%、1.02%,与富集纯化前相比,花椒生物碱的含量得到明显升高。
表 5 最佳工艺验证结果编号 得膏率
(%)富集前
总含量(%)富集后
总含量(%)富集后
总含量RSD(%)1 6.88 0.82 5.73 0.87 2 6.91 0.81 5.72 0.87 3 6.95 0.82 5.64 0.87 3.3 生物碱类化合物的鉴定
通过中药系统药理学数据库与分析平台、PubChem、Web of science等数据库和国内外文献,收集花椒的化学成分信息,包括绘制化学结构、整理化合物名称与分子式、利用MasslynxV4.1计算化合物精确质量等,建立共包含95种生物碱的花椒化学成分数据库。
由图4可知,在正离子模式下,生物碱类化合物得到了较好的分离。结合质谱数据、相关文献对照品的裂解规律和紫外吸收,并与自建的花椒化学成分数据库进行对比分析,共识别鉴定或推导出20种生物碱类化合物,包括木兰花碱、茵芋碱、HAS、HBS等(见表6)。
表 6 正离子模式下花椒生物碱类成分碎片离子及鉴定结果峰号 保留时
间(t/min)化合物 分子式 离子模式 理论值
(m/z)实测值
(m/z)误差
(ppm)碎片离子
(m/z)参考
文献1 4.716 木兰花碱 C20H24NO4+ [M]+ 342.170 5 342.169 0 −4.38 342.169 0[M]+, 297.110 6[M-C2H7N]+, 282.088 2[M-C2H7N-CH3]+, 265.085 2[C17H13O3]+, 222.065 3[C15H10O2]+, 191.084 6[C15H11]+, 194.071 4[C14H10O]+, 165.069 3[C13H9]+ [17] 2 5.483 ZP-amide D C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 3 5.877 ZP-amide E C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 320.182 5[M+Na]+ [18] 4 6.043 ZP-amide A C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19] 5 6.724 ZP-amide B C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19] 6 6.793 ZP-amide C C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18, 20] 7 7.222 ZP-amide L C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 8 7.902 ZP-amide K C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 9 12.427 ZP-amide N C18H31NO4 [M+Na]+ 348.215 1 348.213 0 −6.03 349.217 7[M+H+Na]+, 348.213 0[M+Na]+ [18] 10 16.168 茵芋碱 C14H13NO4 [M+H]+ 260.092 3 260.092 3 0.00 229.037 0[M-2CH3]+, 227.056 6[C13H9NO3]+, 202.046 8[C11H8NO3]+, 199.062 5[C12H9NO2], 184.037 9[C11H6NO2]+, 156.043 4[C10H6NO]+, 77.037 7[C6H5]+ [21] 11 22.312 羟基-ε-山椒素 C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 302.171 4[M+K]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [22] 12* 22.701 羟基-α−
山椒素C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [23] 13* 23.113 羟基-β−
山椒素C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.187 5[M-OH]+ [23] 14 23.605 Zanthoamides A C18H27NO4 [M-OH]+ 304.191 3 304.191 3 0.00 345.184 4[M+H+Na]+, 344.181 6[M+Na]+ [24] 15 26.156 羟基-γ−山椒素 C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22] 16 26.379 羟基-γ−
异山椒素C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22] 17 26.786 bungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15] 18 26.957 isobungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15] 19 27.586 α−山椒素 C16H25NO [M+H]+ 248.201 4 248.201 2 −0.81 286.178 3[M+K]+ [23] 20 29.068 四氢花椒素 C18H33NO2 [M+H]+ 296.259 0 296.257 7 −4.39 318.237 8[M+Na]+, 279.137 4[M+H-OH]+ [25] *:为与对照品比对的化合物。 4. 讨论
实验前期,考察了酸提碱沉法与乙醇回流提取法,经比较发现两方法制备得到的花椒生物碱中HAS、HBS含量差别不显著。但以酸性溶液浸提生物碱时,耗时长、水溶性杂质较多,而且酸性溶液可能会使部分生物碱吸收氢离子导致质子化从而发生重排反应,破坏分子结构,综合考虑下本实验选择乙醇回流提取法。
HAS、HBS是花椒的代表性酰胺类生物碱,具有降脂、抗氧化、麻醉、神经营养等多种活性,受到研究者的广泛关注[15-16]。本实验确立的工艺能够有效富集花椒生物碱,显著提高HAS、HBS含量,为后续HAS、HBS单体化合物的制备提供了基础。实验过程中尝试通过优化除杂条件、分段收集乙醇洗脱液等方法分离黄酮与生物碱类成分,但UPLC-Q-TOF-MSE得到的BPI图中,8~11 min仍存在着部分响应较高的黄酮类物质无法完全分离,后续还需要探索其他有效的方法进一步去除黄酮类成分。
本实验在单因素实验基础上采用正交设计考察了花椒生物碱的最佳纯化工艺,利用UPLC-Q-TOF-MSE对生物碱成分进行分析鉴定,使用HPLC对制备得到的花椒生物碱中的HAS、HBS进行含量测定。本纯化工艺简单可行、稳定有效,可为花椒生物碱的综合开发利用及工业化生产提供科学依据,对提升花椒的综合经济价值具有深远意义。
-
[1] GRABOWSKI R, DUGAN E. Disseminated candidiasis in a patient with acute myelogenous leukemia[J]. Cutis,2003,71(6):466-468. [2] ARASTEHFAR A, LASS-FLÖRL C, GARCIA-RUBIO R, et al. The quiet and underappreciated rise of drug-resistant invasive fungal pathogens[J]. JoF,2020,6(3):138. doi: 10.3390/jof6030138 [3] HEALEY K R, PERLIN D S. Fungal resistance to echinocandins and the MDR phenomenon in Candida glabrata[J]. J Fungi (Basel),2018,4(3):105. doi: 10.3390/jof4030105 [4] GROSSET M, DESNOS-OLLIVIER M, GODET C, et al. Recurrent episodes of Candidemia due to Candida glabrata, Candida tropicalis and Candida albicans with acquired echinocandin resistance[J]. Med Mycol Case Rep,2016,14:20-23. doi: 10.1016/j.mmcr.2016.12.004 [5] WON E J, CHOI M J, KIM M N, et al. Fluconazole-resistant Candida glabrata bloodstream isolates, south Korea, 2008-2018[J]. Emerg Infect Dis,2021,27(3):779-788. doi: 10.3201/eid2703.203482 [6] HULL C M, PARKER J E, BADER O, et al. Facultative sterol uptake in an ergosterol-deficient clinical isolate of Candida glabrata harboring a missense mutation in ERG11 and exhibiting cross-resistance to azoles and amphotericin B[J]. Antimicrob Agents Chemother,2012,56(8):4223-4232. doi: 10.1128/AAC.06253-11 [7] TEO J Q M, LEE S J Y, TAN A L, et al. Molecular mechanisms of azole resistance in Candida bloodstream isolates[J]. BMC Infect Dis,2019,19(1):63. doi: 10.1186/s12879-019-3672-5 [8] PAIS P, CALIFÓRNIA R, GALOCHA M, et al. Candida glabrata transcription factor Rpn4 mediates fluconazole resistance through regulation of ergosterol biosynthesis and plasma membrane permeability[J]. Antimicrob Agents Chemother,2020,64(9):e00554-e00520. [9] VU B G, STAMNES M A, LI Y, et al. The Candida glabrata Upc2A transcription factor is a global regulator of antifungal drug resistance pathways[J]. PLoS Genet,2021,17(9):e1009582. doi: 10.1371/journal.pgen.1009582 [10] WANG Q Q, LI Y, CAI X, et al. Two sequential clinical isolates of Candida glabrata with multidrug-resistance to posaconazole and echinocandins[J]. Antibiotics (Basel),2021,10(10):1217. doi: 10.3390/antibiotics10101217 [11] LI Q Q, TSAI H F, MANDAL A, et al. Sterol uptake and sterol biosynthesis act coordinately to mediate antifungal resistance in Candida glabrata under azole and hypoxic stress[J]. Mol Med Rep,2018,17(5):6585-6597. [12] WHALEY S G, ZHANG Q, CAUDLE K E, et al. Relative contribution of the ABC transporters Cdr1, Pdh1, and Snq2 to azole resistance in Candida glabrata[J]. Antimicrob Agents Chemother,2018,62(10):e01070-e01018. [13] YAO D T, CHEN J, CHEN W Q, et al. Mechanisms of azole resistance in clinical isolates of Candida glabrata from two hospitals in China[J]. Infect Drug Resist,2019,12:771-781. doi: 10.2147/IDR.S202058 [14] KHAKHINA S, SIMONICOVA L, MOYE-ROWLEY W S. Positive autoregulation and repression of transactivation are key regulatory features of the Candida glabrata Pdr1 transcription factor[J]. Mol Microbiol,2018,107(6):747-764. doi: 10.1111/mmi.13913 [15] HOU X, XIAO M, WANG H, et al. Profiling of PDR1 and MSH2 in Candida glabrata bloodstream isolates from a multicenter study in China[J]. Antimicrob Agents Chemother,2018,62(6):e00153-e00118. [16] HEALEY K R, ZHAO Y N, PEREZ W B, et al. Prevalent mutator genotype identified in fungal pathogen Candida glabrata promotes multi-drug resistance[J]. Nat Commun,2016,7:11128. doi: 10.1038/ncomms11128 [17] BORDALLO-CARDONA M Á, AGNELLI C, GÓMEZ-NUÑEZ A, et al. MSH2 gene point mutations are not antifungal resistance markers in Candida glabrata[J]. Antimicrob Agents Chemother,2018,63(1):e01876-e01818. [18] AL-BAQSAMI Z F, AHMAD S, KHAN Z. Antifungal drug susceptibility, molecular basis of resistance to echinocandins and molecular epidemiology of fluconazole resistance among clinical Candida glabrata isolates in Kuwait[J]. Sci Rep,2020,10(1):6238. doi: 10.1038/s41598-020-63240-z [19] PHAM C D, IQBAL N, BOLDEN C B, et al. Role of FKS mutations in Candida glabrata: MIC values, echinocandin resistance, and multidrug resistance[J]. Antimicrob Agents Chemother,2014,58(8):4690-4696. doi: 10.1128/AAC.03255-14 [20] BELENKY P, CAMACHO D, COLLINS J J. Fungicidal drugs induce a common oxidative-damage cellular death pathway[J]. Cell Rep,2013,3(2):350-358. doi: 10.1016/j.celrep.2012.12.021 [21] AHMAD S, JOSEPH L, PARKER J E, et al. ERG6 and ERG2 are major targets conferring reduced susceptibility to amphotericin B in clinical Candida glabrata isolates in Kuwait[J]. Antimicrob Agents Chemother,2019,63(2):e01900-e01918. [22] VANDEPUTTE P, TRONCHIN G, BERGÈS T, et al. Reduced susceptibility to polyenes associated with a missense mutation in the ERG6 gene in a clinical isolate of Candida glabrata with pseudohyphal growth[J]. Antimicrob Agents Chemother,2007,51(3):982-990. doi: 10.1128/AAC.01510-06 [23] VANDEPUTTE P, TRONCHIN G, LARCHER G, et al. A nonsense mutation in the ERG6 gene leads to reduced susceptibility to polyenes in a clinical isolate of Candida glabrata[J]. Antimicrob Agents Chemother,2008,52(10):3701-3709. doi: 10.1128/AAC.00423-08 [24] CANTURK Z. Evaluation of synergistic anticandidal and apoptotic effects of ferulic acid and caspofungin against Candida albicans[J]. J Food Drug Anal,2018,26(1):439-443. doi: 10.1016/j.jfda.2016.12.014 [25] SHARIFZADEH A, KHOSRAVI A R, SHOKRI H, et al. Synergistic anticandidal activity of menthol in combination with itraconazole and nystatin against clinical Candida glabrata and Candida krusei isolates[J]. Microb Pathog,2017,107:390-396. doi: 10.1016/j.micpath.2017.04.021 [26] SHARIFZADEH A, KHOSRAVI A R, SHOKRI H, et al. Potential effect of 2-isopropyl-5-methylphenol (thymol) alone and in combination with fluconazole against clinical isolates of Candida albicans, C. glabrata and C. krusei[J]. J De Mycol Médicale,2018,28(2):294-299. [27] HOOPER R W, ASHCRAFT D S, PANKEY G A. In vitro synergy with fluconazole plus doxycycline or tigecycline against clinical Candida glabrata isolates[J]. Med Mycol,2019,57(1):122-126. doi: 10.1093/mmy/myy008 [28] MORAES R C, CARVALHO A R, DALLA LANA A J, et al. In vitro synergism of a water insoluble fraction of Uncaria tomentosa combined with fluconazole and terbinafine against resistant non-Candida albicans isolates[J]. Pharm Biol,2017,55(1):406-415. doi: 10.1080/13880209.2016.1242631 [29] DAS P E, MAJDALAWIEH A F, ABU-YOUSEF I A, et al. Use of A hydroalcoholic extract of Moringa oleifera leaves for the green synthesis of bismuth nanoparticles and evaluation of their anti-microbial and antioxidant activities[J]. Materials (Basel),2020,13(4):876. doi: 10.3390/ma13040876 [30] LAZIĆ J, AJDAČIĆ V, VOJNOVIC S, et al. Bis-guanylhydrazones as efficient anti-Candida compounds through DNA interaction[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2018,102(4):1889-1901. doi: 10.1007/s00253-018-8749-3 -

计量
- 文章访问数: 5939
- HTML全文浏览量: 2264
- PDF下载量: 39
- 被引次数: 0