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小檗碱是从毛茛科植物根茎中提取的一种季胺类异喹啉类生物碱，又称黄连素，为中药黄连的主要成分，临床多用其盐酸盐。盐酸小檗碱（BBR）的药理作用主要为清热解毒，属于传统的消化系统用药，临床上常用作抗菌剂，用于治疗细菌性痢疾、肠胃炎等肠道感染[1-2]。盐酸小檗碱溶解度低， 渗透性差，在口服给药时，还存在药物释放快、半衰期短、生物利用度低等缺陷。对于需要达到一定血药浓度为疗效前提的疾病来说，盐酸小檗碱的传统剂型还无法达到理想的治疗效果[3]。
纳米乳（NE）是由油相、水相、表面活性剂、助表面活性剂组成的脂质纳米给药载体。粒径范围为1～100 nm，液滴呈大小均匀的球形，外观呈透明或半透明。纳米乳是一种热力学稳定的胶体分散体系，制备工艺简单，所需能量低甚至能够自发形成。纳米乳处方中油相和表面活性剂、助表面活性剂等组成成分的增溶效果，可以显著提升难溶性药物的溶解度。纳米乳小且均匀的粒径，可透过胃肠道的水化层，改善胃肠上皮细胞对药物的吸收。纳米给药体系具有较低的表面张力，可提高膜的通透性，促进药物吸收，提高其生物利用度[4]。纳米乳自身的独特优势，使其具有广泛的临床应用范围，可通过口服、透皮、注射等多种途径给药[5-6]。
本研究结合纳米乳剂型的优势，制备了盐酸小檗碱口服纳米乳(BBR-NE)，采用伪三元相图法和星点设计-效应面法优化了制备工艺，并对其体外特性进行表征，从而解决盐酸小檗碱口服给药剂型溶解度差、生物利用度低等问题，提高药物的疗效，为小檗碱的临床应用提供新的给药剂型[4]。
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101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF 5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Zetasizer Nano ZS90 测定仪（英国马尔文公司）。
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盐酸小檗碱原料药（批号XC20170113，西安小草植物科技有限公司）；盐酸小檗碱对照品（批号110713-201212，纯度>86.7 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20181008，上海凌峰化学试剂有限公司）；吐温-80（批号2015021，上海凌峰化学试剂有限公司）；甘油（批号20191110，上海源叶生物科技有限公司）；聚乙二醇400（PEG400，批号970248，上海浦东高南化工厂）；聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH-40，批号19523275L0，德国 BASF 公司）；烷基糖苷0810（APG，平均聚合度1.2～1.8，批号170502，上海发凯化工有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号170857，上海嘉法狮贸易有限公司）；肉豆蔻酸异丙酯（IPM，批号F20160731，国药集团化学试剂有限公司）；橄榄油（批号F20180725，中国医药集团上海化学试剂公司）；中链脂肪酸（MCT，批号193717，嘉法狮（上海）贸易有限公司）；大豆油（批号20190801，江西金海棠药用油有限公司）；蓖麻油（批号20180815，上海凌峰化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；羟丙甲基纤维素（HPMC，批号H08827，阿拉丁生化科技股份有限公司）；水为重蒸水。
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色谱柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.05 mol/L与磷酸二氢钾（0.5 %三乙胺，磷酸调至pH=3）等度洗脱，比例：30∶70，流速1.0 ml/min，紫外检测波长345 nm，柱温25 ℃，进样量20 μl。
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精密称取盐酸小檗碱对照品1.0 mg，用甲醇稀释定容于10 ml量瓶中作为储备液，用甲醇逐级稀释成系列对照品溶液，按上述色谱条件进样测定。称取适量盐酸小檗碱纳米乳于10 ml 量瓶中，加入甲醇超声破乳30 min，10000 r/min离心5 min，取1 ml上清液于10 ml 量瓶中，加甲醇定容后过0.45 μm微孔滤膜即得供试品溶液。方法学考察表明，盐酸小檗碱在1.00～100.00 μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为：Y=37.059 X+16.952 （r=0.999 9）。低、中、高浓度的盐酸小檗碱对照品溶液的日内精密度分别为0.68 %、1.64 %、0.80 %，日间精密度分别为0.95 %、0.23 %、013 %，加样回收率RSD分别为1.42 %、0.70 %、1.57 %，表明该方法可用于纳米乳中盐酸小檗碱的含量测定。
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采用水滴加法制备盐酸小檗碱纳米乳。根据各类溶剂口服的安全性，筛选出以下各相备选溶剂，以BBR的溶解度为指标，确定各相最佳选择。
油相：Capryol 90、蓖麻油、橄榄油、大豆油、IPM、MCT；表面活性剂：吐温-80、APG、RH-40；助表面活性剂：1,2-丙二醇、PEG400、甘油。在具塞玻璃离心管中加入5 ml 上述各溶剂与过量盐酸小檗碱，置于恒温（25 ℃）振荡器振摇（100 r/min）72 h，得到以上各溶剂的饱和盐酸小檗碱溶液。取该饱和溶液于5000 r/min 条件下离心10 min，吸取1 ml上清液置于5 ml量瓶中，加甲醇稀释定容之后过0.45 μm微孔滤膜，按“2.1.1”项下色谱条件进样检测。
结果如图1所示：油相中盐酸小檗碱的溶解度从大到小依次为：Capryol 90> MCT>蓖麻油>大豆油>橄榄油>IPM；表面活性剂的顺序为：吐温-80>APG>RH-40；助表面活性剂的顺序为：1,2-丙二醇>甘油>PEG400。即盐酸小檗碱在Capryol 90、吐温-80、1,2-丙二醇中溶解度最大，故选择Capryol 90为油相，吐温-80为表面活性剂，1,2-丙二醇为助表面活性剂。
图 1 盐酸小檗碱在各相溶剂中的溶解度
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按照上述筛选的结果，将表面活性剂和助表面活性剂按照Km分别为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1的比例混合，再取油相与此混合表面活性剂按照1∶9、2∶8；3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的质量比配制成混合溶液，在磁力搅拌下滴加蒸馏水。观察溶液的颜色、乳光和澄明度，判断临界点，记录体系由浑浊变澄清时的加水量，计算临界点时各组分的比例。用Origin 10.0软件绘制伪三元相图，图中各临界点连线下方的区域即为纳米乳区，比较该区域面积大小，确定表面活性剂与助表面活性剂的质量比[9-11]。结果见图2。图中阴影部分即为成乳区，且当Km为2∶1时达到最大，故将Km定为2∶1。然而在实际制备纳米乳过程中，处方中各组分的不同比例会产生交互影响作用，因此，需要进一步采用星点设计-效应面法优化盐酸小檗碱纳米乳的制备工艺。
图 2 不同Km值BBR纳米乳的伪三元相图
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选择对纳米乳影响较大的表面活性剂与助表面活性剂质量比Km（X1）和油相质量百分数（X2）作为考察因素，以多分散系数（PDI，Y1）和载药量（Y2）为考察指标。实验过程中发现当Km≥4时，大部分处方难以成乳；当Km≤1:2时，平均粒径>100 nm，故将Km范围定在1∶1至3∶1。当含油量增至0.5 g（50 %）时，平均粒径已接近100 nm，而当含油量范围在0.2～0.5 g（20 %～50 %）时，可将粒径控制在100 nm之内。根据单因素试验结果确定了Km的取值范围和油相质量百分数，并将两个评价指标进行归一化，将每个指标换算成0～1之间的“归一值（OD）”,并求算几何平均数，得总评“归一值”。计算公式如下: OD=(d1d2d3…... dk)1/k（k为指标数）。对取值越小越好的因素（PDI）和取值越大越好的因素（载药量）采用Hassan法[9]分别进行数学转换，求归一值dmin和dmax，公式如下：dmin=(Ymax−Yi)/(Ymax−Ymin)；dmax=(Yi−Ymin)/(Ymax−Ymin)。采用2因素5水平星点设计优化处方，因素水平见表1，星点设计各组实验结果见表2。
表 1 星点设计因素水平表
因素 水平 −1.41 −1 0 +1 +1.41 X1（Km） 1∶1 1.29∶1 2∶1 2.71∶1 3∶1 X2（含油量/g） 0.2 0.24 0.35 0.46 0.5 表 2 星点设计各组实验结果
编号 X1 X2 平均粒径
(l
/nm)Y1 Y2
(mg/g）dmin dmax OD 1 0 −1.41 46.32 0.29 0.72 0.54 0 0 2 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.367 0.558 3 −1 1 85.3 0.25 0.91 0.78 0.820 0.800 4 0 0 74.06 0.23 0.84 0.85 0.53 0.67 5 1 −1 76.58 0.35 0.72 0.21 0.01 0.04 6 1.41 0 59.8 0.36 0.76 0.12 0.15 0.13 7 1 1 101.4 0.38 0.78 0.04 0.34 0.12 8 −1.41 0 58.68 0.21 0.80 1.00 0.36 0.60 9 −1 −1 45.8 0.21 0.84 0.99 0.51 0.71 10 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.37 0.56 11 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.37 0.56 12 0 0 74.06 0.23 0.80 0.85 0.37 0.56 13 0 1.41 91.88 0.39 0.95 0.00 1.00 0.00 对X1进行二次式回归，得到方程R1=0.23+0.06 A+3.22×10−3B−2.75×10−3AB+0.03A2+0.03B2 ，（r=0.970 8），P<0.001；对X2进行二项式回归，得到方程R2=0.81−0.04A+0.06B+1.37×10−3AB−0.01A2+0.01B2，（r=0.913 5），P<0.05；对总归一值（OD）进行二项式回归，方程为OD=0.87−0.28A+0.03B−0.01AB−0.03A2−0.34B2，（r=0.910 2），P<0.05。以OD作为指标时，为使方程有效，对其进行方差分析，结果见表3。由表3可知，模型的P < 0.05，说明OD与X1、X2回归方程的非线性关系显著。回归方程的相关系数r=0.910 2，表明模型能说明91.02 %响应值的变化，拟合情况良好，回归方程具有较好的代表性，能准确预测实际情况[12]。
表 3 星点设计-效应面法优化纳米乳处方方差分析表
来源 平方和 自由度 均方 F P 模型 1.48 5 0.18 5.88 0.0190 A-A 0.65 1 0.51 12.82 0.0090 B-B 7.73 1 3.600 0.15 0.7067 AB 4.40×10−5 1 0.016 8.74×10−3 0.9281 A2 6.32×10−3 1 0.37 0.13 0.7335 B2 0.83 7 0.026 16.41 0.0049 残差 0.35 3 0.058 纯误差 0.011 4 8.70×10-3 42.60 0.0017 总和 1.83 12 r 0.90 校正后r 0.82 C.V.% 35.29 信噪比 7.05 由拟合曲线可绘制X1、X2和OD值的关系，所绘制的三维效应面和二维等高线如图3所示。利用Design Expert 8.0软件的预测分析功能，根据拟合回归方程、三维效应面图和二维等高线图综合分析，得到最佳处方为X1= 0，X2=0.53，预测值OD为0.6214。故优化后的盐酸小檗碱纳米乳处方为：油相Capryol 90占体系的32.84 %，表面活性剂吐温-80占体系的33.90 %，助表面活性剂1,2-丙二醇占体系16.95 %，水相占体系15.25 %[4]。
图 3 因变量Y随自变量X变化的三维效应面和二维等高线图
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对最优处方进行处方验证，结果如表4所示，预测值OD为0.6214，实际OD值为0.6510，偏差为4.76 %。表明预测值与实测值之间偏差较小，表明星点设计-效应面法（CCD-RSM）可用于筛选盐酸小檗碱纳米乳，筛选的处方预测良好、可靠。
表 4 最优处方验证结果
评价指标 实测值 实际OD值 预测OD值 偏差（%） PDI 0.235±0.03 0.6510 0.6214 4.76 载药量（mg/g） 0.829 -
取适量BBR-NE于10 ml量瓶中，加甲醇超声破乳30 min，加甲醇稀释定容。4 ℃离心（10000 r/min，5 min），吸取1 ml上清液置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀释定容后即得样品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，计算纳米乳的载药量。测定结果如表5。
表 5 盐酸小檗碱纳米乳的载药量测定结果(
$\bar x $ ±s ，n=3)批号 盐酸小檗碱（mg/g） RSD（%） 201118 0.83±0.01 0.16 201119 0.83±0.02 0.21 201120 0.83±0.01 0.17 -
按照最优处方制备BBR-NE，稀释到适宜浓度，均匀分散后，采用马尔文激光粒度分析仪测定纳米乳的粒径大小。粒径结果如图4和图5所示。所制备的BBR-NE粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（68.85±8）nm，PDI为(0.245±0.03)，表明该制剂粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。
图 4 最优处方（201119）纳米乳粒径分布图
图 5 最优处方（201119）纳米乳电位分布图
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采用透射电镜（TEM）观察所制备的BBR-NE的形态。取适量BBR-NE滴于铜网上，自然干燥后滴加2 %磷钨酸（pH=7.4）溶液于铜网上负染3 min，晾干后置于透射电镜下观察其外观形貌。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图6所示。结果表明，BBR-NE呈均一圆整的球形，具明显层状结构，粒径大小约为68 nm。
图 6 最优处方（201119）纳米乳的透射电镜图
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取制备好的盐酸小檗碱纳米乳2 ml，置于透析袋（分子截留值为7 000）中。于pH 1.2的人工胃液中释放2 h，再于pH 6.8的人工小肠液中释放22 h，溶出介质体积满足漏槽条件。将透析袋置于离心管中（含30 ml透析液），在恒温振荡器（37 ℃，100 r/min）中释放24 h，分别于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24 h定时取样1 ml，随后立即补加等温等体积释放介质。收集的样品过0.45 μm滤膜后，按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算累积释放度。释放曲线如图7所示，拟合方程如表6所示。
图 7 盐酸小檗碱纳米乳的体外释放曲线 (
$\bar x $ ±s ，n=6)表 6 盐酸小檗碱纳米乳释药曲线的拟合方程
释药模型 拟合方程 r 零级动力学方程 Q=29.352 t–4.123 0.816 4 一级动力学方程 ln(1–Q)=92.395 t+0.240 0.962 3 希古契（Higuchi）方程 Q=20.952 t 1/2–6.735 0.889 6 由释放曲线可以看出，BBR-NE在人工胃液中（0～2 h）累积释放度很低（<20%），进入人工小肠液后（2～24 h）释放度逐渐上升，累积释放度达到80 %以上，表明该制剂具有一定缓释效果，其释药行为符合一级动力学方程。
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纳米乳的处方筛选过程中，目前常采用绘制伪三元相图、正交试验设计法、星点设计-效应面法等方法。其中，伪三元相图法的精度不高，常用于初筛[13-14]；正交试验设计法在因素水平较少时试验次数虽不多，但由于采用线性模型拟合，预测性较差[15]；而星点设计-效应面法各因素对效应的影响拟合结果多数是非线性，可从效应面上选择最佳效应区域，适合于多因素、多水平的处方优化。
在应用伪三元相图筛选Km时，随着表面活性剂和助表面活性剂质量比的增加，形成纳米乳区域的面积逐渐增加，当Km为2∶1 时最大，而后稍有减小。这是由于加入吐温-80的比例增加，纳米乳的乳化作用增强。因此需要综合考虑选择最佳的Km值。
本研究在单因素筛选的基础上，利用星点设计-效应面法，以载药量及外观形态为考察指标，优化并确定了盐酸小檗碱纳米乳的最优处方：油相 Capryol 90占体系32.84 %，表面活性剂吐温−80占体系33.90 %，助表面活性剂1,2-丙二醇占体系16.95 %，水相占体系15.25 %，载药量为0.829 mg/g。 外观形态分析，表明所制备的BBR-NE 呈圆整均一的球体且具有明显的层状结构，平均粒径为 (68.85±8) nm，呈正态分布，多分散系数为(0.245±0.03)，说明该制剂粒径大小符合纳米乳粒径要求且均匀性好[4]。由验证试验结果可知，该制备工艺稳定可行，有望为盐酸小檗碱临床应用提供一种新的给药剂型。
Preparation and in vitro evaluation of berberine hydrochloride nanoemulsion oral drug delivery systems
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摘要:
目的 制备盐酸小檗碱纳米乳，优选其处方组成和制备工艺，并对其外观、粒径及体外释放行为等进行评价。 方法 采用水滴加法制备盐酸小檗碱纳米乳，绘制纳米乳伪三元相图。选择星点设计-效应面法对纳米乳处方进行优化，确定最优处方组成比例。对制备的盐酸小檗碱纳米乳的粒径、电位、外观形态、体外释药行为等进行表征。 结果 确定了盐酸小檗碱纳米乳的最优处方为油相Capryol 90占体系的32.84 %，表面活性剂吐温-80占体系的33.90 %，助表面活性剂1,2-丙二醇占体系16.95 %，水相占体系15.25 %，制备的纳米乳呈澄清透明、形状规则、大小均一的球状，平均粒径为(68.85±8)nm，多分散系数为(0.245±0.03)，载药量为0.83 mg/g。纳米乳的体外释药行为考察，表明其具有一定的缓释效果，其体外释药行为符合一级释放动力学方程。 结论 本研究制备的盐酸小檗碱纳米乳可为该药的临床用药提供新的给药剂型。 Abstract:Objective To prepare berberine hydrochloride nanoemulsion, optimize its formulation composition and preparation process, and investigate its in vitro characteristics. Methods BBR-NE was prepared by water drop addition and pseudo-ternary phase diagram was drawn. The formulation of NE was optimized by central composite design-response surface methodology to choose the optimal formulation composition. The particle size, potential and appearance of the prepared BBR-NE were characterized. Results The optimal prescription of BBR-NE was determined as the oil phase Capryol 90 accounted for 32.84% of the system, the surfactant Tween-80 accounted for 33.90%, the co-surfactant 1,2-propylene glycol accounted for 16.95%, and water relative system accounted for 15.25%. The prepared NE was clear and transparent in appearance, regular in shape and uniform in size, with an average particle diameter of (68.85±8) nm, polydiseperse index of (0.245±0.03) and drug loading of 0.83 mg/g. The in vitro drug release results of NE showed that the in vitro drug release behavior was passive diffusion, which had a certain slow releasing effect and met the first-order release equation. Conclusion The BBR-NE can provide a new dosage form for the clinical use of berberine. -
高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品与试剂
姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
2. 方法与结果
2.1 姜黄素纳米乳的制备
姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立
2.2.1 色谱质谱条件[8]
色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
2.2.2 方法学考察
取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究
2.3.1 给药方案
18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
2.3.2 药动学参数计算
药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 2.4 药效学研究
2.4.1 动物分组、造模及给药
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
2.4.2 统计学处理
实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。2.4.3 肝脏指数
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片
取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平
第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
3. 讨论
姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
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表 2 星点设计各组实验结果
编号 X1 X2 平均粒径
(l
/nm)Y1 Y2
(mg/g）dmin dmax OD 1 0 −1.41 46.32 0.29 0.72 0.54 0 0 2 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.367 0.558 3 −1 1 85.3 0.25 0.91 0.78 0.820 0.800 4 0 0 74.06 0.23 0.84 0.85 0.53 0.67 5 1 −1 76.58 0.35 0.72 0.21 0.01 0.04 6 1.41 0 59.8 0.36 0.76 0.12 0.15 0.13 7 1 1 101.4 0.38 0.78 0.04 0.34 0.12 8 −1.41 0 58.68 0.21 0.80 1.00 0.36 0.60 9 −1 −1 45.8 0.21 0.84 0.99 0.51 0.71 10 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.37 0.56 11 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.37 0.56 12 0 0 74.06 0.23 0.80 0.85 0.37 0.56 13 0 1.41 91.88 0.39 0.95 0.00 1.00 0.00 
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表 3 星点设计-效应面法优化纳米乳处方方差分析表
来源 平方和 自由度 均方 F P 模型 1.48 5 0.18 5.88 0.0190 A-A 0.65 1 0.51 12.82 0.0090 B-B 7.73 1 3.600 0.15 0.7067 AB 4.40×10−5 1 0.016 8.74×10−3 0.9281 A2 6.32×10−3 1 0.37 0.13 0.7335 B2 0.83 7 0.026 16.41 0.0049 残差 0.35 3 0.058 纯误差 0.011 4 8.70×10-3 42.60 0.0017 总和 1.83 12 r 0.90 校正后r 0.82 C.V.% 35.29 信噪比 7.05
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表 5 盐酸小檗碱纳米乳的载药量测定结果(
$\bar x $ ±s ，n=3)批号 盐酸小檗碱（mg/g） RSD（%） 201118 0.83±0.01 0.16 201119 0.83±0.02 0.21 201120 0.83±0.01 0.17
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表 6 盐酸小檗碱纳米乳释药曲线的拟合方程
释药模型 拟合方程 r 零级动力学方程 Q=29.352 t–4.123 0.816 4 一级动力学方程 ln(1–Q)=92.395 t+0.240 0.962 3 希古契（Higuchi）方程 Q=20.952 t 1/2–6.735 0.889 6
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