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近年来，随着医疗水平和医疗技术的不断发展，越来越多的儿童侵袭性真菌感染被确诊，尤其在免疫缺陷、血液和肿瘤、器官移植以及需要重症和新生儿监护室的患儿中出现较高的发病率[1-3]，引起较高的病死率，或产生严重的后遗症[4]。伏立康唑[5]是第二代三唑类抗真菌药物，有着较广谱的抗菌谱。主要推荐作为侵袭性曲霉菌、对氟康唑耐药的念珠菌及其他不常见的侵袭性病原菌的一线治疗药物。血液稳态谷浓度是对伏立康唑在体内药动学的评价指标，与临床疗效及不良反应有着密不可分的关系。监测伏立康唑在儿童患者的血药浓度，对指导临床安全有效用药具有重要意义。
本研究通过收集2019年1月至12月期间68例使用伏立康唑的住院儿童信息，进行血药谷浓度监测，并对临床有效性和安全性进行分析，以期为真菌感染患儿临床用药提供参考。本研究通过医院伦理委员会的审批（批准号：2019-LDYY-036），所有患儿家属均签署知情同意书。
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本研究收集2019年1月至12月上海市宝山区罗店医院、上海市儿童医院及上海市同济医院住院治疗的真菌感染患儿病例，共收集到有血药浓度监测的病例68例，其中，男38例(56%)，女30例(44%)，年龄17天至15岁，详见表1。68例患儿中，6例来自新生儿病区，30例PICU，32例血液病区。感染部位涉及肺部、血液、腹腔、中枢、肠道、泌尿道。按照侵袭性真菌感染诊断标准分为确诊、临床诊断和拟诊[6]。本资料中28例患儿为确诊病例，40例患儿为临床诊断病例。所有案例均存在高危因素，并具有影像学变化。确诊病例即连续3次培养检出同一种真菌，确诊为真菌感染。临床诊断病例的1,3-β-D葡聚糖抗原（G试验）和/（或）半乳甘露聚糖（GM试验）阳性。
表 1 患儿一般资料分布情况
年龄 性别 例数（％） 男（%） 女（%） 新生儿 4（11） 2（7） 6（9） 29天~2岁 4（11） 4（13） 8（12） 2~12岁 24（63） 22（73） 46（67） 12~15岁 6（15） 2（7） 8（12） 合计 38（56） 30（44） 68（100） -
纳入标准：诊断为侵袭性真菌感染的儿童；接受伏立康唑治疗或改变剂量后持续用药至少3 d；接受伏立康唑血浆稳态谷浓度监测。排除标准：接受伏立康唑治疗不足3 d；未进行伏立康唑血药浓度监测；肝肾功能不全；缺乏完整的实验室评价指标，不能进行疗效和安全性评价者。
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注射用伏立康唑（美国辉瑞制药有限公司、晋城海斯制药有限公司），规格：200 mg/瓶，生产批号：Z572301、20210501。应用参考指征：①根据实验室检测结果及药敏试验。②根据临床表现及（G试验）和/（或）（GM试验）阳性，经验性给予抗真菌药物。68例患儿均予以静脉给药，q12h，使用前均告知家长可能的风险并征得家长的同意。
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研究对象接受伏立康唑治疗或改变剂量后持续用药至少 3 d后检测血清谷浓度。使用全自动二维液相色谱耦合仪LC-100HP（湖南德米特仪器有限公司）进行HPLC法测定药物浓度：血样本采集后静置至自然凝固，4500 r/min离心 5 min，获取血清样本；取 300 μl 血清加入900 μl 乙腈去蛋白溶液，涡旋震荡1 min，15000 r/min离心8 min，待分层完全后，取 1000 μl 上清液加入100 μl 乙腈去蛋白溶液进样，在色谱条件下检测，记录峰面积并计算伏立康唑谷浓度。
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采用 SPSS 20.0 软件进行统计学分析，计数资料以百分比表示，符合正态分布的计量资料以（
$ \overline{\text{x}}\text{±}\text{s} $ ）表示，两样本比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，非正态分布以中位数（四分位间距）表示，各组总体水平差异采用 Kruskal-Wallis 法检验，相关性分析采用 Spearman 相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 -
本案例中28例明确检测到病原菌，其中，10例白色念珠菌，6例热带念珠菌，5例近平滑念珠菌，3例光滑念珠菌，2例曲霉菌，1例挪威假丝酵母菌，1例似平滑念珠菌。伏立康唑治疗真菌感染的患儿，有效58例，有效率85.3%（58/68例），无效10例，无效率14.7%（10/68例）（其中，死亡2例，4例放弃治疗自动出院，4例更换药物）。
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68 例患儿均静脉给药伏立康唑，使用疗程为7~38 d，平均为（13.2±9.0）d。患儿单次给药剂量3.6~8.0 mg/kg，平均（6.1±1.4) mg/kg。按单次不同给药剂量分为<4.0、4.0~7.0、>7.0 mg/kg 3组。其中，<4.0 mg/kg有6例，有效5例、无效1例；4.0~7.0 mg/kg有44例，有效37例、无效7例；>7.0 mg/kg有18例，有效16例、无效2例，具体见表2。
表 2 伏立康唑用药剂量和疗效的相关性
组别(μg/ml) 例数 有效（%） 无效（%） <4.0 6 5(83.3) 1(16.7) 4.0~7.0 44 37(84.1) 7(15.9) >7.0 18 16(88.9) 2(11.1) 合计 68 58(85.3) 10(14.7) -
根据稳态血清谷浓度值范围分为<1.0、1.0~5.5和>5.5 μg/ml 3组，其中，<1.0 μg/ml有14例，有效10例，无效4例；1.0~5.5 μg/ml有48例，有效44例，无效4例；>5.5 μg/ml有6例，有效4例，无效2例。采用单因素方差分析显示，3组间差异有统计学意义（χ2=5.360, P=0.039），见表3。
表 3 血清谷浓度值与疗效的相关性
组别(μg/ml) 例数 有效（%） 无效（%） χ２ P <1.0 14 10(71.4) 4(28.6) 5.360 0.039 1.0～5.5 48 44(91.7) 4(8.3) >5.5 6 4(66.7) 2(33.3) 合计 68 58(85.3) 10(14.7) -
对68例患儿进行78次谷浓度检测，其中复测10例。复测的病例中，7例为给药剂量上调后复测，3例为给药剂量下调后复测，本研究以第一次谷浓度值为准，复测值不计入其中。不同的给药剂量，检测出不同的谷浓度值。给药<4.0 mg/kg，谷浓度在0.4~3.31 μg/ml (r=0.613，P=0.195)；4.0~7.0 mg/kg，谷浓度0.35~7.02 μg/ml （r=0.325，P=0.018）；>7.0 mg/kg，谷浓度1.46~12.45 μg/ml (r=0.584，P=0.023)，给药剂量与药物浓度之间有相关性，并且3组间谷浓度有统计学差异(F=7.270, P=0.026)，见表4。
表 4 伏立康唑给药剂量与谷浓度的关系
组别(mg/kg) 例数 谷浓度（μg/ml）
中位数
（四分位间距）r P F P <4.0 6 1.59(0.40~2.76) 0.613 0.195 7.270 0.026 4.0～7.0 53 1.91(0.93~3.63) 0.325 0.018 >7.0 9 3.31(2.04~5.49) 0.738 0.023 -
给药后按照诺氏评估量表[7]评估患儿发生不良反应与伏立康唑的关联性，68例患儿中有10例存在与伏立康唑很可能有关的药物不良反应，主要表现为轻度肝功能损伤[8]，其中，2例总胆红素升高，5例（其中，1例为<2岁）谷丙转氨酶（ALT）升高，3例（其中1例新生儿）谷草转氨酶(AST)升高。本案例中未发现神经毒性（视觉障碍、脑病、神经系统疾病）、皮疹等不良反应。其中，低血清谷浓度组中有1例（7.1%）发生ALT升高，2例（33.3%）发生在高谷浓度组中（1例为总胆红素升高，1例为ALT升高），其余7例（14.6%）发生在目标谷浓度组中。
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儿童感染的真菌类型中，以念珠菌和曲霉菌最为常见，其他有隐球菌、毛霉菌、镰刀菌等[9]。伏立康唑因其抗菌谱广[10]、耐药率低等优点，被多项指南推荐为临床一线抗真菌药物。
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由于伏立康唑药代动力学的个体差异性较大，中国药理学会建议进行伏立康唑药物浓度监测和基因型检测的个体化用药[11]。美国感染病学会(IDSA)推荐2～12岁儿童无需使用负荷剂量，可直接给予维持量。本研究中的儿童均静脉使用了维持量，无1例使用负荷量及口服给药。美国FDA推荐如下：2~12岁儿童用药剂量为8 mg/(kg·次)，q12h。然而在实际使用过程中，考虑患儿的各器官功能，各项实验室指标，及独特的生理特点等因素，临床给药剂量范围有一定的上下浮动。本研究中伏立康唑的给药范围在3.6~8.0 mg/(kg·次)，q12h，分为<4.0、4.0~7.0和 >7.0 mg/kg 3种给药剂量。虽然本研究中部分案例给药剂量稍低，但所测得血药浓度在合理的暴露范围内，并未产生较高的治疗失败结果。本研究的给药剂量可以为伏立康唑的儿童用药剂量提供一些参考，实践证明，结合治疗药物浓度监测不仅能提高有效率，同时还能避免药物不良反应的发生。
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伏立康唑在各国指南中推荐的谷浓度各不相同，浓度下限的范围是0.5～2 mg/L[12-14]，浓度上限范围是4～6 mg/L[15-17]，目标浓度是1.0~5.5 mg/L。然而以上是成人的谷浓度参考范围，对于儿童的药物浓度推荐的此类研究却较少。本研究按测得的谷浓度值，分成<1.0、1.0~5.5和 >5.5 μg/ml，分别获得不同的有效率，其中，1.0~5.5 μg/ml的谷浓度范围的临床疗效高于另外2组，并且差异有统计学意义（χ2=5.360, P=0.039）。可见，达到伏立康唑的目标谷浓度有助于提高临床有效率（91.7%），低谷浓度影响了临床疗效（71.4%），但更高的谷浓度却未提高有效率（66.7%），反而容易发生不良反应（33.3%）。由此，为确保疗效，降低不良反应的发生，结合我们的研究结论，1.0~5.5 μg/ml可作为儿童伏立康唑的参考血药浓度范围。
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伏立康唑在治疗真菌感染过程中最为常见的不良反应为肝毒性、神经毒性（视觉障碍、脑病、神经系统疾病）、皮疹等。 考虑到药物的安全性和有效性数据尚不充分，美国FDA推荐2岁以上儿童使用该药物，然而在小婴儿重症感染时，往往会遇到其他抗生素耐药或无效时，结合临床及实验室检查等，权衡利弊后，选择使用伏立康唑。本研究中有14例（14/68，20.6%）儿童<2岁，但只有2例（1例为新生儿，1例为1岁儿童）发生肝功能的异常，经保肝治疗后恢复。同样有6例儿童的谷浓度>5.5 μg/ml，却有2例因高谷浓度而发生药物不良反应。临床医师根据药物浓度结果及肝损伤指标及时下调给药剂量，未产生严重后果。可见，伏立康唑在2岁以下婴儿中有较高的安全性，结合TDM更能减少不良反应的发生。与Park[18]等做的一项随机对照研究结果较相符合，此外，我们的研究结果如王晓晨[19]等建议的那样，治疗窗较窄的伏立康唑，为确保临床疗效，需设计合理的个体化给药方案。
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本研究中发现虽然给予合理的伏立康唑药物剂量，但测得的谷浓度仍低于<1.0 μg/ml，上调给药剂量后，复测谷浓度仍未出现明显上升。有研究显示[20]伏立康唑在儿童体内的代谢清除率速度较成人更快，更多的研究提示肝脏细胞色素P450同工酶代CYP2C19[21]对药物在体内的暴露、清除、代谢等起着至关重要的影响。而CYP2C19的基因型对伏立康唑的代谢快慢起到关键的作用，由此可在一定程度上解释合理的给药剂量却产生较低药物暴露量的原因。本研究中伏立康唑的总体安全性尚可，但仍需提醒，临床医师需要评估病情，根据循证医学、病原菌检测及药物敏感实验，结合医学伦理问题，权衡患儿风险及收益，可以谨慎使用。
本研究存在一定的局限性，只监测了伏立康唑的血药浓度，收集了给药剂量、肝肾功能等数据，初步得出了一些结论，并未深入研究目前热门的药物基因对伏立康唑代谢的影响。因样本量小，亦未对2岁以内的儿童进行详细的研究。总之，开展儿童使用伏立康唑的血药浓度监测，对药物的有效性和安全性起到一定的指导意义。
Study on the relationship between blood concentration and efficacy of voriconazole in the treatment of pediatric invasive fungal infection
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摘要:
目的 探索伏立康唑治疗儿童侵袭性真菌感染的剂量、血药浓度与疗效的相关性。 方法 收集2019年1月至2019年12月，使用伏立康唑治疗的68例儿童侵袭性深部真菌感染病例，采用高效液相色谱法检测伏立康唑的血药谷浓度，统计分析伏立康唑的不同剂量与血药浓度和临床疗效的相关性。 结果 检测显示不同给药剂量的血药谷浓度分别为：<4.0 mg/kg（6例），谷浓度在0.4~3.31 μg/ml (r=0.613，P=0.195)；4.0~7.0 mg/kg（44例），谷浓度在0.35~7.02 μg/ml（r=0.325，P=0.018）；>7.0 mg/kg（18例），谷浓度在1.46~12.45 μg/ml (r=0.584，P＜0.023)，3组间差异有统计学意义(F=7.270, P=0.026)。68例患儿中总体有效58例（85.3%），无效10例（14.7%）。上述不同谷浓度的疗效分别为：<1.0 μg/ml组14例，有效10例（71.4％），无效4例；1.0~5.5 μg/ml组48例，有效44例（91.7％），无效4例；>5.5 μg/ml组6例，有效4例（66.7%），无效2例。3组间差异有统计学意义（χ２=5.360, P=0.039）。10例出现不良反应（14.7%），主要为轻度肝功能损伤，不影响治疗，保肝治疗后可恢复。 结论 研究显示伏立康唑治疗儿童侵袭性真菌感染总体安全有效，且存在明显的剂量-血药浓度与疗效的相关性。因此，进一步开展药动学与疗效相关研究，有利于实现理想的个体化治疗。 Abstract:Objective To explore the correlation between dose, blood concentration and efficacy of voriconazole in the treatment of invasive fungal infection in children. Methods 68 children treated with voriconazole during January 2019 to December 2019 were collected. The plasma concentration of voriconazole was assayed by high performance liquid chromatography (HPLC). The correlation between blood concentration and clinical efficacy was statistically analyzed. Results Different drug blood concentrations were obtained with different dosages: <4.0 mg/kg (6 cases) with the trough concentration ranged from 0.4 to 3.31 μg/ml (r=0.613, P=0.195). (4.0 - 7.0) mg/kg (44 cases), ranged from 0.35 to 7.02 μg/ml (r=0.325, P=0.018); >7.0 mg/kg (18 cases), ranged from 1.46 to 12.45 μg/ml (r=0.584, P＜0.023). There was a difference between the three groups (F=7.270, P=0.026). The relationship between the drug blood concentration and the therapeutic effect was obvious. In the <1.0 μg/ml group of 14 cases, 10 cases (71.4%) were effective, and 4 cases were ineffective. In the 1.0 - 5.5 μg/ml group of 48 cases, 44 cases (91.7%) were effective, and 4 cases were ineffective. In the >5.5 μg/ml group of 6 cases, 4 cases (66.7%) were effective and 2 cases ineffective. The difference among the three groups was obvious (χ2=5.360, P=0.039). Among the 68 cases, 58 cases (85.3%) were effective, and 10 cases (14.7%) were ineffective. Adverse reactions occurred in 10 cases (14.7%) with mild liver function injury, which did not affect the treatment and recovered with liver protection treatment. Conclusion This study showed that voriconazole was generally safe and effective in the treatment of invasive fungal infections in children. There was a significant dose-blood concentration and efficacy correlation. Further studies on pharmacokinetics and efficacy should be carried out to optimize the individualized treatment. -
Key words:
- voriconazole /
- invasive fungal infection /
- children /
- drug concentration /
- clinical efficacy
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随着社会经济发展和饮食结构改变，功能性便秘（FC）发生率逐年攀升，并具有顽固性、复发性的特点，无根治特效药[1]，目前临床上对于便秘的干预措施主要包括药物、按摩、膳食调理等，但都存在依从性低、副作用明显、疗效不可靠等弊端[2]，新型抗便秘产品的研发具有迫切需求。黑蒜是一种发酵大蒜，在高温高湿条件下发酵一定时间制得[3]。黑蒜主要化学成分包括多糖、类黑精、蛋白质、多酚、含硫化合物等[4]，研究表明其具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖[5-9]等作用，近年，黑蒜在通便相关的药食同源产品研发领域应用较多，但关于黑蒜抗便秘作用的研究较少，抗便秘功效成分更不明确，相关产品进一步研发与推广缺乏足够的科学依据。且黑蒜用于抗便秘每日需服用20 g以上[10]，易导致依从性差，难以长期坚持等问题。有研究发现大蒜多糖具有一定抗便秘作用[11]，而大蒜在加工成黑蒜的过程中糖类物质含量可增加数倍[12-13]，可合理推测黑蒜多糖可能具有更显著的抗便秘作用，是黑蒜抗便秘作用的物质基础之一，但目前还没有相关的研究。因此，本文建立复方地芬诺酯（CO.D）诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用，为新型抗便秘产品的研发提供科学依据。
1. 材料与仪器
1.1 实验材料
黑蒜（批号：20231030，上海明可名生物科技有限公司）；乳果糖口服液（规格：667 mg/ml，批号：22110047，北京韩美药品有限公司）；复方地芬诺酯片（2.5 mg/片，批号：210804，仁和堂医药连锁股份有限公司）。
1.2 实验试剂
D-无水葡萄糖（批号：S22J12H137237，源叶生物）；无水乙醇（批号：P2708277，泰坦科技）；生理盐水（批号：230327042，雷根生物）；4%多聚甲醛（批号：HP184401，博光生物）；浓硫酸（批号：
20230420）、 丙酮（批号：20230807 ）、石油醚（批号：20220507 ）均购自国药集团；三氯乙酸（批号：C14990699）、活性炭粉（批号：C14853603）、阿拉伯树胶粉（批号：C15109301）、苯酚（批号：C15031044）均购自麦克林生化；所有水均为超纯水机所制一级水。1.3 实验仪器
鼓风干燥箱DAG-924（满贤经贸）；循环水式多用真空泵SHB-III（明杰仪器）；万分之一天平JA1003（恒平仪器）；电热恒温水浴锅HWS-12（一恒仪器）；高速离心机M18G（创宜生物）；旋转蒸发器RE-52AA（亚荣仪器）；超纯水机Smart-S（和泰仪器）。
1.4 实验动物
SPF级C57雄性小鼠，体重18 ~22 g，许可证号： SCXK（浙）2019-00004，杭州子源实验动物科技有限公司。
2. 方法
2.1 黑蒜多糖的提取
取10 g黑蒜，按下列步骤处理： ①脱脂：剥去外壳，研磨成泥，85%乙醇水溶液（V/V）浸渍，常温静置8 h，抽滤，滤渣用85%乙醇水溶液洗涤2次，置于烘箱60℃挥干至无醇味，充分研磨获得脱脂黑蒜粉。②水提：所得脱脂黑蒜粉用80℃热水浸提1 h，料液比为1∶50，抽滤，滤液减压浓缩至原体积1/2。③脱蛋白：在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸水溶液，充分混匀，4℃静置10 h，离心取上清液。④醇沉：上清液加入无水乙醇，调节乙醇水溶液浓度为80%，充分混匀，4℃静置12 h，离心取沉淀。⑤干燥：挥干有机溶剂，烘箱60℃干燥，去除残留溶剂，得黑蒜多糖干燥粉末。
2.2 多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[14]测定多糖含量。
2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制
精密称取D-无水葡萄糖适量，配置为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别吸取250 μl于离心管中，依次加入6%苯酚溶液150 μl、浓硫酸625 μl，迅速振摇，静置反应30 min，吸取200 μl于96孔板，设置3个复孔，测量490 nm处吸光度。绘制葡萄糖标准曲线，求得回归方程。
2.2.2 样品测定
精密称取适量黑蒜多糖干燥粉末，加入蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，根据酶标仪检测范围进行稀释。吸取250 μl多糖溶液于96孔板中，按照2.2.1项下方法进行测定，计算样品中多糖的含量，进一步计算黑蒜多糖的得率和纯度。
计算公式：黑蒜多糖得率（%）=
$ \dfrac{W2}{W1}\times 100\text{%} $ 黑蒜多糖纯度（%）=
$ \dfrac{C\times V\times D}{W2}\times 100\text{%} $ 式中：
$ W $ 1为黑蒜质量（g）；$ W $ 2为黑蒜多糖粉末质量；$ C $ 为样品中多糖的质量浓度（mg/ml）；$ V $ 为提取溶剂体积（ml）；$ D $ 为样品稀释倍数。2.3 动物实验给药剂量及配置
乳果糖口服液：乳果糖含量为667 mg/ml，正常成人用药量15 ml/d[15]，换算可得小鼠的用药剂量为4 g/（kg·d）。量取乳果糖口服液6 ml，加蒸馏水14 ml，配置成200 mg/ml的乳果糖口服液。
CO.D混悬液：参考贾红慧等[16]研究结果，选用5 mg/kg剂量CO.D造模，模型稳定、灵敏。取CO.D 4片，研磨成细粉，加蒸馏水20 ml，配置成0.5 mg/ml的 CO.D混悬液，使用前需充分混匀。
黑蒜多糖低、中、高剂量溶液：参考胡淼等[17]研究结果，黑蒜多糖低、中、高剂量组剂量分别选用0.25、0.5、1 g/kg。称取0.5、1、2 g黑蒜多糖干燥粉末，分别加蒸馏水20 ml，配置成25、50、100 mg/ml的黑蒜多糖溶液。
墨汁[18]：阿拉伯树胶于蒸馏水中加热至完全溶解，料液比为1∶8。加入5 g活性炭粉末，混合均匀，重复煮沸3次，冷却后定容至100 ml，使用前需充分混匀。
含药墨汁：取适量受试药，加入墨汁，配制成与上述受试药剂量相同的含药墨汁。
2.4 实验动物分组及给药方法
2.4.1 小鼠小肠墨汁推进实验
小鼠60只，适应性饲养1周，正常饮食饮水。给药前按照体重随机分为空白组、模型组、阳性组、黑蒜多糖低、中、高剂量组，每组10只。
按照0.1 ml/10 g灌胃给药。①给药：空白组和模型组小鼠给予蒸馏水，阳性组和黑蒜多糖组小鼠分别给予乳果糖口服液和黑蒜多糖溶液。1次/d，连续给药1周，观察并记录小鼠体重变化及一般状态。②造模：末次给药后禁食12 h，自由饮水，空白组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组小鼠灌胃CO.D溶液。③给药：30 min后空白组、模型组灌胃墨汁，其它组小鼠灌胃相应含药墨汁。25 min后处死，剖取小鼠小肠（幽门至盲肠上端），平铺成直线，测量小肠总长度和墨汁推进距离，避免拉伸小肠，影响实验结果。
计算公式：小肠墨汁推进率（%）=墨汁推进距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%
2.4.2 小鼠排便实验
分组、给药剂量及方法同“2.4.1”项下实验方法，给药后，记录每只小鼠首次排出黑便的时间、6 h内排出黑便的数量及重量，并进行粪便含水量测定，同时观察粪便性状。含水量测定方法为：将小鼠新鲜粪便置于提前干燥、称重的容器中，称重，于烘箱中干燥至重量不再变化，计算粪便含水量。
计算公式：粪便含水量（%）=
$ \dfrac{M1-M2}{M1}\times 100\text{%} $ 式中：M1为干燥前粪便质量（g），M2为干燥后粪便质量（g）。
2.5 统计学方法
采用SPSS 24统计软件进行数据分析，以均数±标准差（
$ \bar{X} $ ±S）表示计量资料。两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。3. 结果与分析
3.1 黑蒜多糖的得率和纯度
精密称量所得黑蒜多糖干燥粉末质量为0.832 g，代入公式计算可得黑蒜多糖的得率为8.32%。以葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，可得回归方程为Y=
2.2829 X+0.0764 ，相关系数r=0.9982 ，线性关系较好，代入回归方程计算可得黑蒜多糖的纯度为58.23%。3.2 黑蒜多糖对小鼠体重的影响
从表1可以看出，与空白组相比，各组小鼠体重均正常增长，无显著性差异，表明黑蒜多糖不会对正常小鼠体重产生影响。实验过程中，各组小鼠饮食正常，状态良好，无腹泻等不良反应，为后续实验提供前提保证。
表 1 黑蒜多糖对小鼠体重的影响组别 小鼠小肠墨汁推进实验 排便实验 初始体重
（m/g）最终体重
（m/g）初始体重
（m/g）最终体重
(m/g)空白组 21.28±1.15 22.23±1.19 21.80±1.02 22.90±0.61 模型组 21.20±1.36 22.24±1.22 21.58±1.00 22.64±0.84 阳性组 21.17±1.18 22.31±1.28 21.42±1.01 22.81±0.91 黑蒜多糖
低剂量组21.44±1.32 22.38±1.54 21.98±1.20 23.02±1.20 黑蒜多糖
中剂量组21.06±1.13 22.16±0.77 21.59±1.10 22.38±1.08 黑蒜多糖
高剂量组21.42±1.15 22.54±1.26 21.79±1.29 22.85±0.98 3.3 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响
从表2可以看出，与空白组相比，模型组墨汁推进率极显著减小，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠墨汁推进率均显著增大，分别增大了24.75%、56.95%、95.25%，表明黑蒜多糖对FC模型小鼠小肠运动具有促进作用，且成剂量依赖性。
表 2 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响组别 碳末推进距离
（l/cm）小肠总长度
（l/cm）墨汁推进率
（%）空白组 28.86±3.25 34.87±1.60 82.90±9.97 模型组 9.60±0.73*** 34.09±2.31 29.50±1.35*** 阳性组 26.94±3.55### 34.15±1.60 79.00±9.92### 黑蒜多糖
低剂量组12.58±1.15### 34.35±1.67 36.80±4.42# 黑蒜多糖
中剂量组16.01±2.06### 34.48±3.18 46.30±4.19### 黑蒜多糖
高剂量组19.95±1.60### 34.66±1.96 57.60±4.06### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01， ###P<0.001，与模型组比较。 3.4 黑蒜多糖对小鼠排便的影响
从表3可看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排出黑便时间极显著延长，6 h排便粒数显著减少，6 h排便重量极显著减少，粪便含水量极显著降低，粪便呈球形或短椭圆形，部分串联，质地干硬，颜色普遍偏黑，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠首次排出黑便时间均极显著缩短，分别缩短了42.55%、44.99%、45.81%；6 h排便重量显著增加，分别增加了68.42%、78.95%、78.95%；粪便含水量极显著增大，分别增大了29.96%、32.78%和35.82%，粪便呈长椭圆形，质地较软，颜色为深棕色，无腹泻现象；除黑蒜多糖低剂量组外，中、高剂量组小鼠6 h排便粒数有统计学差异，分别增加了31.45%和32.52%。表明黑蒜多糖可能通过增大FC模型小鼠粪便含水量发挥促排便作用，各剂量组间效果差异不明显。
表 3 黑蒜多糖对小鼠排便及粪便含水量的影响组别 首黑便时间
（t/min）6 h排便数
（粒）6 h排便湿重
（m/g）6 h排便干重
（m/g）含水量
（%）空白组 111.50±8.98 16.50±3.51 0.46±0.10 0.22±0.04 52.16±2.53 模型组 241.50±19.54*** 11.13±2.75** 0.19±0.02*** 0.13±0.01*** 32.58±2.35*** 阳性组 121.50±110.81### 15.13±4.09# 0.41±0.12### 0.20±0.06## 50.06±1.83### 黑蒜多糖低剂量组 138.75±10.79### 13.75±2.71 0.32±0.08## 0.19±0.42# 42.34±2.27### 黑蒜多糖中剂量组 132.88±8.34### 14.63±3.66# 0.34±0.10## 0.19±0.05## 43.26±2.68### 黑蒜多糖高剂量组 130.88±9.09### 14.75±3.73# 0.34±0.12## 0.19±0.05## 44.25±6.72### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较。 4. 讨论
CO.D是一种止泻药，可通过抑制肠道平滑肌上的肠黏膜感受器抑制肠道运动，减慢排便进程，减少排便次数，同时肠内容物与肠粘膜接触时间延长，可促进肠内容物水分的重吸收，降低粪便含水量，是常用的FC小鼠模型造模药[19]。因此，本研究建立CO.D诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用。实验结果表明，黑蒜多糖可显著促进CO.D诱导的FC模型小鼠小肠蠕动，缩短排便时间，增加粪便含水量，从而发挥抗便秘作用。有研究显示成人每日服用约2 g黑蒜多糖便可达到较好疗效，用量仅为黑蒜的1/10[10]。给药期间小鼠状态良好、体重正常，未产生腹泻等副作用。因此，黑蒜多糖用于FC治疗可有效规避依从性差、副作用明显、疗效不可靠等弊端，前景广阔。此外，有相关研究发现，采用CO.D 10 mg/kg和15 mg/kg灌胃造模（大鼠）都存在停药后恢复的情况[20]，提示我们使用CO.D进行慢性便秘造模，在造模成功后的治疗给药阶段也需要持续用药，以维持药效。目前该便秘模型的建立没有统一标准，后续可对造模时间、造模剂量进行优化，为更深入的黑蒜多糖抗便秘机制研究提供基础。
FC是典型的胃肠动力障碍性疾病，现代研究普遍认为，其发病机制主要与卡哈尔间质细胞（ICCs）数量、功能以及分布异常、肠神经递质水平异常、水通道蛋白表达异常、氧化应激指标失衡、肠道菌群紊乱等有关[21-22]。大蒜多糖主要为果聚糖，占干重的65%，在发酵生成黑蒜的过程中，果聚糖因高温作用大量降解为低聚果糖（FOS）、果糖等小分子糖[23]。FOS在国际营养学界被称作“具有优良难消化性的水溶性膳食纤维”，还是典型的“超强双歧因子”。因其无法被肠道吸收，可被双歧杆菌等益生菌分解利用，短时间内促进双歧杆菌增殖10~100倍，分解生成的有机酸，可有效调节肠道pH，刺激肠道蠕动，促进排便[24]。双歧杆菌还可抑制有害肠道病菌生长、抵抗病原菌感染、产生维生素并促进矿物质吸收以维持肠道健康，有研究表明人体双歧杆菌含量随年龄增长逐渐减少，是老年人易发生便秘的主要原因[25]。因此，需要进一步明确黑蒜多糖的单糖组成、相对分子质量以及结构，为后续抗便秘机制研究提供依据。此外，便秘成因复杂，可结合具体的证型如脾虚、血虚、阳虚、津亏等便秘模型进一步探究黑蒜多糖抗便秘作用的有效性。
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表 1 患儿一般资料分布情况
年龄 性别 例数（％） 男（%） 女（%） 新生儿 4（11） 2（7） 6（9） 29天~2岁 4（11） 4（13） 8（12） 2~12岁 24（63） 22（73） 46（67） 12~15岁 6（15） 2（7） 8（12） 合计 38（56） 30（44） 68（100） 
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表 2 伏立康唑用药剂量和疗效的相关性
组别(μg/ml) 例数 有效（%） 无效（%） <4.0 6 5(83.3) 1(16.7) 4.0~7.0 44 37(84.1) 7(15.9) >7.0 18 16(88.9) 2(11.1) 合计 68 58(85.3) 10(14.7)
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表 3 血清谷浓度值与疗效的相关性
组别(μg/ml) 例数 有效（%） 无效（%） χ２ P <1.0 14 10(71.4) 4(28.6) 5.360 0.039 1.0～5.5 48 44(91.7) 4(8.3) >5.5 6 4(66.7) 2(33.3) 合计 68 58(85.3) 10(14.7)
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表 4 伏立康唑给药剂量与谷浓度的关系
组别(mg/kg) 例数 谷浓度（μg/ml）
中位数
（四分位间距）r P F P <4.0 6 1.59(0.40~2.76) 0.613 0.195 7.270 0.026 4.0～7.0 53 1.91(0.93~3.63) 0.325 0.018 >7.0 9 3.31(2.04~5.49) 0.738 0.023
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