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麻黄碱是中药麻黄的主要有效成分，但它也可以引起中枢神经系统毒副作用。麻黄碱属于小分子生物碱，能够通过血脑屏障对神经细胞产生直接毒性作用 [1-4]。然而，有关麻黄碱神经毒性的作用机制并不完全清楚。脑源性神经营养因子(BDNF)已被证实参与学习、记忆等多种中枢神经系统的活动[5]。突触后致密蛋白是突触后膜胞质面聚集的一层均匀而致密的蛋白，其中PSD95是主要成分之一[6]。而synapsin1是维持突触前膜功能的重要成分之一[7]。BNDF、PSD95和synapsin1与神经元结构完整性和功能的完备性密切相关。本研究以PC12细胞为研究对象，考察麻黄碱的细胞毒性，同时检测BDNF、PSD95和synapsin1表达水平的变化，初步探讨麻黄碱引起细胞毒性的可能机制。
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盐酸麻黄碱（批号：D03150702，赤峰艾克制药科技有限公司）；BDNF抗体（批号：ab108319）、PSD95抗体（批号：ab18258）、synapsin1抗体（批号：ab64581）均购自英国Abcam公司。
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PC12细胞购自中科院细胞库。
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电子天平（德国Sartorious公司）；孵育箱（Thermo公司）；酶标仪（BioTek公司）；Western blot设备（美国Bio-Rad公司）。
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将培养瓶里的PC12细胞接种到96孔板上，每孔接种6000个细胞，用含1%FBS（胎牛血清）的RPMI 1640培养12 h后，吸弃原培养基，加入RPMI 1640基础培养基，1 h后分别加入不同浓度的麻黄碱，使其终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4、8、16、20 mmol，继续培养24 h后，加入终浓度为0.5 mg/ml的MTT，继续孵育4 h，吸弃培养液，每孔加入150 μl的DMSO（二甲基亚砜），轻微震荡10 min，在酶标仪检测570 nm处的光密度(OD)值。
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将培养瓶的PC12细胞接种到12孔板中，用含1%FBS的RPMI 1640培养12 h后，吸弃原培养基，加入RPMI 1640基础培养基1 h后分别加入不同浓度的麻黄碱，使其终浓度分别为10、500、1000 μmol，继续培养24 h后，在倒置显微镜下明场视野观察细胞形态变化。
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将6孔板每孔接种105个PC12细胞，用含1%FBS的RPMI1640培养12 h，换上基础培养基RPMI1640，1h后分别加入不同浓度的麻黄碱，其终浓度分别为1、10、100、500、1000 μmol，继续培养24 h后，迅速将培养基吸弃，置于−30℃冷冻数小时，然后在冰上每孔加相应量的RIPA（含1%磷酸酶抑制剂和1%蛋白酶抑制剂）裂解液，4℃震荡30 min，将细胞裂解液收集到相应离心管里，4℃低温高速(12000 r/min)离心10 min。取出上清，蛋白浓度检测(BCA)试剂盒测定蛋白浓度后，加入相应量的5×的上样缓冲液和适量的RIPA裂解液，95℃加热10 min制样。制胶上样，样品80 V电泳结束后，400 mA电流90 min转移至PVDF（聚偏氟乙烯膜）后，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，按分子量切出相应条带，分别孵育相应一抗过夜，洗涤后室温孵育相应二抗2 h，漂洗后，增强化学发光(ECL)法显影。
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实验数据以
$ \bar x \pm s $ 表示。应用SPSS 20.0统计软件，采用单向方差分析法处理试验结果。首先进行Levene方差齐性检验，方差齐性且整体比较组间有显著性差异时，采用LSD法进行多重比较，方差分析不显著时不进行多重比较；若方差不齐，则作Welch检验，方差分析有显著性差异时，采用Dunnett’s T3法进行多重比较，方差分析不显著时不进行多重比较。 -
MTT结果如图1所示，麻黄碱在一定范围内对PC12细胞有一定的毒性，经拟合计算在PC12细胞中麻黄碱的IC25值为0.536 mmol，IC50值为2.8 mmol。
图 1 麻黄碱细胞活性试验（MTT法）
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PC12细胞形态学变化如图2所示，在20倍镜下观察，随着麻黄碱浓度的升高细胞数量与空白对照组相比逐渐减少，细胞突触数量也随之减少。1000 μmol浓度处理条件下，轴突长度显著减短，细胞体边缘模糊，细胞体积显著变小。
图 2 麻黄碱对PC12细胞形态变化的影响
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图3结果显示，随着麻黄碱剂量的增加，PC12细胞中BDNF的蛋白表达量增加。当麻黄碱浓度为500 μmol时，BDNF的表达量约为空白对照组的1.58倍，有统计学差异(P<0.05)；而当麻黄碱浓度高达 1000 μmol时，BNDF为对照组的1.91倍(P<0.001)。说明该浓度范围内麻黄碱可以浓度依赖性的引起PC12细胞中BDNF表达升高。
图 3 麻黄碱对BDNF表达水平变化的影响
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图4结果显示，随着麻黄碱剂量的增加，PC12细胞中PSD95的表达增加。麻黄碱浓度为500 μmol时，PSD95的蛋白表达水平约为空白对照组的1.38倍，有统计学差异(P<0.05)；而当麻黄碱浓度达到1000 μmol时，PSD95表达量约上升为对照组的1.52倍(P<0.001)。说明该浓度范围内麻黄碱可以浓度依赖性的引起PC12细胞中PSD95表达升高。
图 4 麻黄碱对PSD95表达水平变化的影响
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图5结果显示，随着麻黄碱剂量的增加，PC12细胞中synapsin1的表达量有下降的趋势。其中，麻黄碱浓度为500 μmol时，synapsin1的蛋白表达水平约为空白对照组的0.65，具有统计学差异(P<0.05)；而当麻黄碱浓度达到1000 μmol时，synapsin1表达量下降至对照组的0.53(P<0.001)。说明麻黄碱在该浓度范围内可以引起PC12细胞中synapsin1表达降低。
图 5 麻黄碱对synapsin1表达水平变化的影响
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麻黄历来被中医冠以“解表第一要药”，是治疗外感风寒表实证的重要中药，主要用于风寒感冒，胸闷喘咳，风水浮肿等，麻黄汤就是以麻黄为君药的治疗表寒实证的代表名方。然而前期研究发现，给予大鼠连续灌胃麻黄，可以造成大鼠不同脑区损伤，其中对额叶皮层影响较大，HE染色结果甚至观察到神经元凋亡早期的形态学改变 [8-9]。已经证实麻黄中对中枢神经系统有兴奋毒性作用的主要成分是麻黄碱。麻黄碱的神经毒性可能与升高兴奋性谷氨酸水平有关，过量的兴奋性谷氨酸能引起多巴胺神经末梢的破坏和额叶皮层、丘脑、边缘系统的神经变性。为了明确麻黄引起中枢神经系统毒性的机制，本研究中将麻黄碱单体作为研究对象，考察其在体外细胞模型中的毒性作用。
PC12细胞源于鼠嗜铬细胞瘤，在结构上和功能上与神经元有高度相似的地方，因其可重复性好，被广泛应用于中枢神经系统的研究。本研究首先考察了不同浓度麻黄碱对PC12细胞存活率的影响，确定了麻黄碱引起细胞毒性的浓度范围。在此基础上，分别考察不影响细胞存活率情况下（IC25值以下浓度）及显著影响细胞存活率情况下（IC25值以上浓度），麻黄碱对中枢神经系统中相关功能蛋白的影响。
BDNF是神经营养因子家族的肽生长因子的一员。在体实验发现，BDNF在大脑海马的CA1区可通过促进兴奋性突触的发育来增强突触强度。同时，BDNF可以在皮层神经元中增加介导中枢神经中快速兴奋性突触传递的AMPA受体的表达，提高动物兴奋性[10-13]。而外源性的BDNF则可以通过增强突触间的传递，增强海马神经元的兴奋性 [14]。以上研究表明，BDNF与神经细胞的兴奋性密切相关。PSD95定位于突触后膜，是高电子密度的半圆形区域形成的突触后致密区的主要组成部分之一。研究发现在海马神经元中过表达PSD95可以促进成熟谷氨酸能突触以及谷氨酸受体的活性 [6,15]。PSD95链接了兴奋性受体NMDAR（N-甲基-D-天冬氨酸受体）和下游信号分子，并且在神经元成熟以及突触的形成中发挥着重要作用[16]。尽管在多数神经退行性病变中，提高BDNF和PSD95的表达水平可以显著改善行为学，但是也有研究表明在生理状态下，神经元的过度激活会引起神经元的功能的减退甚至导致神经损伤。由于BDNF和PSD95与神经元兴奋性关系密切，在前期的行为学实验中，表明麻黄碱灌胃给药会引起大鼠自主活动的增加，并激活神经元，故我们在考察麻黄碱产生细胞毒性的机制时，检测了BDNF和PSD95的蛋白表达水平。结果显示，随着麻黄碱浓度的增加，BDNF和PSD95的表达水平浓度依赖性地升高，当浓度达到500 μmol时差异具统计学意义（P<0.05），说明麻黄碱可以引起体外神经细胞模型的兴奋状态。
与此同时，通过观察细胞形态变化，发现一定剂量的麻黄碱会引起PC12细胞突触数量下降和长度减短，说明麻黄碱会引起突触丢失。文献研究表明，synapsin1是突触的重要标志物，可以反应突触形态上的完整性和功能[7]。由此，我们在考察麻黄碱对PC12细胞形态影响的同时，采用Western blot检测了synapsin1的表达水平。梯度浓度麻黄碱处理PC12细胞后synapsin1的表达变化结果表明随着麻黄碱处理浓度的增加，synapsin1的表达水平降低，当浓度达到500 μmol时差异具统计学意义（P<0.05），说明麻黄碱有一定的细胞毒性的同时，也可以引起神经细胞的突触毒性，突触蛋白的丢失可能也是引起神经细胞毒性的原因之一。
综上所述，本实验结果表明麻黄碱可以对PC12细胞产生毒性。与正常细胞相比，麻黄碱处理组的细胞在形态学上发生了明显的变化，BDNF和PSD95等与兴奋性相关的蛋白表达出现了明显升高，而与突触功能有关的蛋白synapsin1表达出现了明显下降，说明麻黄碱产生中枢神经系统毒副作用的机制与BDNF、PSD95及synapsin1的表达变化有关。
Effects of ephedrine on the expression levels of BDNF, PSD95 and synapsin1 in PC12 cells
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摘要:
目的 考察麻黄碱对PC12细胞内的脑源性神经营养因子(BDNF)、突触后致密蛋白95(PSD95)和神经突触素1(synapsin1)表达水平的影响，探讨麻黄碱对PC12细胞毒性的作用机制。 方法 通过不同浓度的麻黄碱处理PC12细胞后，采用噻唑蓝试剂(MTT)法测定细胞存活率；采用倒置显微镜观察细胞的形态学变化；采用蛋白印迹(Western blot)法检测BDNF、PSD95和synapsin1的蛋白表达水平。 结果 麻黄碱呈浓度依赖性降低PC12细胞活力，其引起PC12细胞死亡的IC25和IC50分别为0.536 mmol和2.8 mmol。随着麻黄碱浓度的升高，PC12细胞体积变小，边界模糊，突触数减少，轴突长度减短；BDNF和PSD95的表达水平明显升高；synapsin1的表达水平有所降低。 结论 麻黄碱对PC12细胞的毒性作用机制可能与影响BDNF、PSD95和synapsin1的表达水平有关。 Abstract:Objective To investigate the effects of ephedrine on the expression levels of brain-derived neurotropic factor (BDNF) and postsynaptic density protein 95 (PSD95) and synapsin1 in PC12 cells, and to explore the mechanism of ephedrine cytotoxicity on PC12. Methods After PC12 cells were treated with different concentration of ephedrine, the cell survival rate was measured by the methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay. The morphology changes of PC12 cells were observed by an inverted microscope. Western blot was used to detect the protein expression levels of BDNF, PSD95 and synapsin1 in PC12 cells. Results Ephedrine decreased the viability of PC12 cell in a concentration-dependent manner,with an IC25 and IC50 of 0.536 mmol and 2.8 mmol, respectively, for PC12 cell death. As ephedrine concentration increased, PC12 cells became smaller in size, with blurred boundary blurred, reduced synapses and shorter axon lengths. The expression levels of BDNF and PSD95 increased significantly. Meanwhile the expression level of synapsin1 decreased. Conclusion The mechanism of ephedrine cytotoxicity on PC12 may be related to the expression levels of BDNF, PSD95 and synapsin1. -
隐丹参酮（CTS）是中药丹参的有效成分之一，国内外研究证明CTS具有抗肿瘤、抗炎、神经保护、心血管保护、抗纤维化和调节代谢紊乱等药理特性，具有广阔的临床应用前景。抗肿瘤作用是近年来隐丹参酮药理活性研究的热点问题之一[1]。隐丹参酮对肺癌、肝胆癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、骨肉瘤癌、黑色素瘤、横纹肌瘤、食管鳞状癌等多种恶性肿瘤表现出一定的抑制活性，其抗肿瘤机理包括抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，调节免疫以及抑制包括STAT3在内的多种信号通路[2-4]。由于CTS中等强度的药理活性和选择性，近年来研究人员对CTS进行了大量结构修饰，期望获得靶点明确且药理活性更强的CTS衍生物，从而开发并应用于临床治疗。本文就隐丹参酮及其衍生物在抗肿瘤方面的作用及其机制进行综述。
1. 隐丹参酮抗肿瘤作用
1.1 抑制肿瘤细胞增殖
癌细胞的主要特点是具有无限的增殖能力。研究表明，CTS可以抑制多种肿瘤细胞增殖，包括胰腺癌细胞BxPC-3、慢性髓性白血病细胞K562/ADR、胶质瘤细胞U87、人卵巢癌细胞Hey、前列腺癌细胞DU145、乳腺癌细胞MCF7、食管鳞状细胞癌ESCC等[5]。
1.2 诱导肿瘤细胞凋亡
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，对于维持组织稳态和消除不需要或受损细胞起重要作用。研究发现，CTS可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，包括骨髓瘤细胞U266、人结肠癌细胞系SW620 Ad300和HCT116、人胃癌细胞MKN-45、肝癌细胞Hepa1-6、非小细胞肺癌细胞A549 和H460 、黑色素瘤细胞A375、横纹肌肉瘤细胞Rh30等[6]。
1.3 抑制细胞迁移和侵袭
高侵袭性和转移是癌细胞恶性特征，转移是癌症死亡的主要原因。因此，抑制癌细胞转移能有效降低癌症死亡率。研究发现，CTS能够抑制卵巢癌细胞A2780的迁移和侵袭[7]。此外，CTS还可以抑制食管癌细胞EC109、膀胱癌细胞T24、人舌鳞癌细胞CAL27、小鼠结肠癌细胞CT26等多种肿瘤细胞的迁移和侵袭[5]。
1.4 调节机体免疫功能
隐丹参酮不仅能够直接抑制多种肿瘤细胞的生长，还可以诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，从而间接发挥抗肿瘤效应。研究发现，隐丹参酮能够通过增加CD4+T细胞的细胞毒作用，抑制人非小细胞肺癌H446细胞和乳腺癌MCF7细胞的生长[8]。此外，隐丹参酮还可以通过诱导小鼠树突状细胞成熟，促进抗原提呈功能，进而诱导T细胞活化增殖，抑制Lewis肺癌细胞的增殖[9]。肿瘤相关巨噬细胞 （TAM) 是肿瘤组织中浸润的巨噬细胞，具有异质性，可分为M1和M2表型。M2表型的TAM能够促进肿瘤生长和转移，相反，M1表型则具有肿瘤抑制和促炎特性。研究发现，隐丹参酮和PD-L1联合治疗能够诱导巨噬细胞向M1极化，从而抑制小鼠肝癌Hepa1-6移植瘤的生长[10]。
1.5 逆转多重耐药
耐药是导致肿瘤复发和治疗失败的主要原因。研究表明，CTS能够逆转慢性骨髓性白血病细胞K562对伊马替尼的耐药性[11]，改善A549细胞对顺铂的耐药性[12]。此外，CTS还可以逆转P-糖蛋白（p-gp）过表达的结肠癌细胞SW620 Ad300对多柔比星和伊立替康的多重耐药[13]。
1.6 合并用药可增强不同抗癌药物的作用
除了具有以上活性之外，CTS还可以与其他不同抗癌药物或细胞因子协同发挥抗肿瘤作用。例如，CTS和紫杉醇的联合用药比单独用药更能有效诱导舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-9细胞的凋亡[14]。新近研究发现，CTS与小剂量的抗PD-L1抗体合用对小鼠Lewis 肺癌的生长抑制作用明显优于CTS单独应用[9]。
1.7 自噬
自噬，即Ⅱ型程序性细胞死亡，作为凋亡之外的另一种可以杀死细胞的途径，是一种抑制癌细胞生长的新方法。研究显示，CTS可通过诱导结肠癌SW620 Ad300细胞和A549细胞自噬促进细胞死亡[15-16]。
2. 抗肿瘤作用机制
CTS抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，以及调节免疫等作用的机制十分广泛，涉及靶点STAT3、酪氨酸蛋白磷酸酶SHP2、DNA拓扑异构酶和信号通路磷酸酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸激酶Akt等。
2.1 调控STAT3信号通路
STAT3由Janus激酶（JAKs)激活，参与肿瘤增殖、凋亡、血管生成及免疫逃逸等。STAT3在大多数恶性肿瘤中被组成性激活，异常的STAT3信号传导是肿瘤恶性进展的重要过程。当705位酪氨酸残基磷酸化后，STAT3被激活，单体STAT3通过其SH2结构域形成二聚体，并从细胞质转移到细胞核中，调节其靶基因的表达，例如，上调cyclin D1、survivin、Mcl-1、MYC、BCL-XL表达，下调 p53表达，促进肿瘤细胞增殖和存活；上调MMP2/9、Twist1、Vimentin表达，促进肿瘤转移；上调TGF-β、IL-6/10、PD-1、PD-L1、VEGF表达，下调CD80/86、MHCII、TNF、IL-12、CCL5、CXCL10等表达，抑制肿瘤微环境免疫功能[17]。研究发现，CTS能够直接与STAT3的SH2结构域结合，特异性抑制STAT3 Tyr705的磷酸化，抑制STAT3二聚化[18-19]，相比之下，姜黄素还能抑制Jak2的表达[20]。在人胰腺癌BxPC-3细胞中，CTS能够抑制BxPC-3细胞的STAT3信号通路进而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，达到抗肿瘤的作用[21]。另外，CTS作为p-STAT3抑制剂，能够有效阻断IL-6介导的STAT3活化，抑制肿瘤增殖，逆转BCR-ABL激酶非依赖性耐药途径[11]。此外，CTS和紫杉醇联合治疗能够有效地抑制舌鳞状癌TSCC细胞增殖和迁移，其作用机制同样与抑制STAT3信号通路相关[14]。沉默信息转录调控因子3（SIRT3）是一种蛋白质去乙酰化酶，参与癌症、心血管、神经系统等疾病的发展过程。研究发现CTS能够通过抑制STAT3/SIRT3 信号通路抑制人卵巢癌A2780 细胞增殖[22]。 上述研究表明，抑制STAT3信号通路对于CTS抗肿瘤至关重要，且CTS是一种特异性的STAT3抑制剂。
2.2 抑制蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2
含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP2）由基因PTPN11编码，PTPN11突变引起SHP2催化活性异常增加。研究发现，肺癌、结肠癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肝癌和急性髓性白血病等病人均发现有PTPN11突变[23]。SHP2是一种非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，参与Ras-Erk、PI3K-Akt、Jak-Stat和NF-κB多条信号通路传导，调控细胞的增殖、迁移和凋亡等过程[24]。研究证明，CTS能与SHP2直接结合，是一个混合型蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂，抑制SHP2 的IC50为22.50μmol/L，抑制SHP1的IC50为39.50μmol/L。用SHP2 siRNA敲减Hela细胞中SHP2后，CTS抑制Hela细胞生长的敏感性降低，提示SHP2是CTS的一个靶点，但是，CTS仍然可以进一步抑制SHP2敲减细胞生长，说明CTS还有其它作用靶点[25]。此外，有研究发现，CTS能够上调胶质瘤细胞 U87 SHP2蛋白酪氨酸磷酸酶活性，抑制STAT3 Tyr705的磷酸化，从而在体内外表现出抑制恶性胶质瘤活性[26]。
2.3 调控 topo 2a水平
DNA拓扑异构酶 （topos），包括DNA拓扑异构酶1（topo1）和DNA拓扑异构酶2（topo2），其中topo2因其在有丝分裂中的关键作用被认为是抗癌治疗的重要靶点[27]。研究表明，CTS能够显著降低前列腺癌PC3细胞中topo 2a的mRNA、蛋白和酶活性水平，并且在裸鼠异种移植模型中表现出良好的抗肿瘤作用[28]。
2.4 调控活性氧水平
活性氧与肿瘤的发展密切相关，其过度产生可诱导多种生物学效应，包括抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬等[29]。研究发现，CTS能够促进胃癌MKN-28 细胞ROS的累积，通过调控MAPK和AKT信号通路诱导G2/M周期阻滞[30]；通过ROS-线粒体途径，上调cleaved caspases-3、促凋亡蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白Bcl-2，从而诱导黑色素瘤细胞凋亡[31]；诱导横纹肌肉瘤Rh30细胞ROS产生，激活JNK/p-38，抑制Erk1/2，导致细胞凋亡[32]；刺激SW620 Ad300细胞中的ROS产生，诱导p38 MAPK激活，导致NF-κB从细胞质转移到细胞核中，最终导致自噬发生[15]；刺激HepG2和MCF-7细胞产生ROS，激活内质网（ER）应激，增强不同抗癌药物或细胞因子（Fas/Apo-1、TNF-α、顺铂、依托泊苷或5-FU）诱导的细胞凋亡[33]。
2.5 调控雌、雄激素受体信号
雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）分别是治疗前列腺癌PCa和乳腺癌的主要靶点。研究发现CTS可以通过抑制AR二聚化有效抑制AR活性，从而抑制AR+ PCa细胞的生长[34]；在异种移植动物模型中，CTS可以有效抑制人前列腺癌CWR22Rv1细胞的生长和AR靶基因的表达[35]。此外，CTS还能够抑制乳腺癌细胞的生长，通过竞争性地结合ERα抑制E2诱导的ER转录活性和ER靶基因的表达[36]；同时，CTS可以有效地抑制体内异种移植瘤模型中ER信号，发挥抗肿瘤作用[37]。
2.6 PI3K/AKT信号通路
磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（Akt）信号通路参与肿瘤的发生、生长、存活和转移。有研究发现CTS可抑制PI3K/AKT信号通路，增加caspase-3、caspase-9、PARP和Bax的表达，降低Bcl-2、survivin、细胞凋亡抑制蛋白的表达，诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡[38-39]。酪氨酸激酶胰岛素生长因子1受体（IGF-1R）在肿瘤细胞的生长、分化和进展中起关键的作用。研究表明，CTS能够通过下调IGF-1R/PI3K/Akt信号通路抑制人肺癌细胞的增殖[40]。此外，有文献报导CTS可以通过调节PI3K/Akt/mTOR信号，抑制结肠癌CT26细胞的侵袭[41]。在裸鼠异种移植实验中，CTS能够显著抑制小鼠体内异种移植物的生长，其作用机制与抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路有关[42]。以上研究表明PI3K/AKT信号通路可能是CTS抗肿瘤的有效信号通路之一。
3. 隐丹参酮衍生物抗肿瘤活性
CTS虽然具有广谱的抗肿瘤活性，但是其药理作用中等，疏水性强且难吸收，口服生物利用度只有2.1%，这些缺点严重阻碍了其开发和应用[43]。近年来，针对CTS存在的问题，人们尝试对CTS进行结构改造，期望获得生物活性高、水溶性好的化合物。刘航[44]等基于CTS是一种STAT3抑制剂，通过对CTS及其骨架类似物进行修饰，设计合成了CTS衍生物62个，其中新化合物46个，通过报告基因法检测发现有27个新化合物对STAT3转录抑制效果优于CTS，IC50最低0.5976 μmol/L。Wang等基于STAT3的药物设计策略，设计合成了一种亲和力和抑制活性更强的新型CTS衍生物LYW-6，该化合物与STAT3结合解离常数Kd约为6.6μmol/L，能够显著抑制STAT3磷酸化、二聚化、核转位以及转录活性。在细胞水平上，LYW-6能选择性抑制高STAT3活性的结肠癌细胞增殖、迁移，促进凋亡，体内可抑制结肠癌的生长和转移，是一个具有开发前景的抗肿瘤活性化合物[45]。为了改善CTS的水溶性，Xu等合成了几种CTS的钠盐衍生物，结果发现这些衍生物比CTS更易溶解，同时保留了CTS的生物活性，其中钠盐衍生物PTS33可以有效地抑制二氢睾酮DHT诱导AR反式激活和PCa细胞生长[46]。
4. 结论
CTS具有广谱的抗肿瘤活性，该活性与抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，逆转耐药性，诱导自噬等作用相关。除直接作用于肿瘤细胞外，CTS还可以通过增强CD4+T细胞的细胞毒作用、诱导DC细胞成熟和促使巨噬细胞M1型极化，间接杀伤肿瘤细胞。分子机制研究表明，CTS可直接结合STAT3和SHP2，有效调节JAK/STAT3、NF-κB、PI3K/AKT和IGF-1R等信号通路发挥抗肿瘤作用。隐丹参酮特异性抑制STAT3信号通路，而不抑制STAT家族中的其他蛋白，是其一大特点。因为尽管其他天然产物也有抗肿瘤作用，但不是特异性STAT3抑制剂，例如姜黄素，是一种STAT抑制剂，但在治疗24 h后降低了STAT3的表达。虽然CTS表现出良好的药理活性，但水溶性差和生物利用度低等问题限制了其广泛应用。因此，基于靶点STAT3，以CTS作为先导化合物，设计并合成一系列CTS衍生物，有望开发出新型STAT3抑制剂用于癌症治疗。
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图 2 麻黄碱对PC12细胞形态变化的影响
A. 空白对照；B. 10 μmol麻黄碱；C. 500 μmol麻黄碱浓度；D. 1000 μmol麻黄碱浓度；标尺：500 μm
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