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骨质疏松症（OP）是一种由骨吸收和骨形成之间的关系失衡造成，以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢疾病。其中，成骨细胞是骨形成的功能细胞，在维持骨稳态中起到关键作用[1]。目前，高氧化应激相关的骨丢失已成为骨质疏松研究领域的热点。有研究表明，细胞保护酶是机体对抗氧化应激状态下活性氧（ROS）损伤的主要机制，其活性主要由转录因子Nrf2和FoxO调控，而二者所介导的氧化应激通路同样被证实具有调节成骨细胞氧化还原平衡以及促进骨形成分化的功能[2]。与此同时，β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的沉积可使机体ROS生成增多，进而抑制成骨细胞的增殖、成骨基质的产生及矿化[3]。由此可见，Aβ沉积偶联的氧化损伤是破坏成骨细胞骨形成，进而引发骨丢失的一大诱因。
啤酒花（Hops, Humulus lupulus L.）为桑科葎草属多年生草质蔓生藤本植物，其雌性球穗花序不仅作为啤酒酿造的添加原料，也是全球广泛应用的植物药，在欧洲广泛用于缓解更年期潮热及绝经后骨质疏松症[4]。我们前期研究发现啤酒花能够促进成骨细胞骨矿化结节的形成，降低活性氧水平，并显著改善APP/PS1转基因小鼠的骨丢失[5-6]，但其对外源性Aβ损伤成骨细胞的氧化应激水平及骨形成的影响尚不明确。此外，我们首次确认了氧化应激和Aβ沉积之间的双向关联，及其在老年性骨质疏松症发病中的重要作用[7-8]。故本文拟以Aβ损伤的成骨细胞为模型，以Nrf2和FoxO1两条经典氧化应激相关通路为核心，对啤酒花的抗氧化能力及对骨形成干预作用进行探究。
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啤酒花药材购于昌吉市山水啤酒花有限公司（产地：新疆昌吉；批号：PJH-01），经海军军医大学药学系生药学教研室辛海量副教授鉴定为啤酒花 Humulus lupulus L.的雌性球穗花序。称取啤酒花药材粉末70 g，加入料液比为1∶15的75%乙醇，回流提取3次，减压浓缩干燥成浸膏，HPLC测定得浸膏中主要成分黄腐酚含量为0.55%[9]，使用前配制成相应浓度（生药量/ml）的提取液。
其他试剂及厂家：Aβ1-42寡聚体（上海吉尔）；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，上海碧云天）；胎牛血清（Gibco，美国）；α-MEM培养基等细胞培养试剂（天津灏洋）；碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒（南京建成）；I型胶原酶（COL-I）、骨桥蛋白（OPN）、核因子-E2-相关因子（Nrf2）、血红素加氧酶-1（HO-1）、NAD(P)H：醌氧化还原酶（NQO1）、细胞叉头框蛋白O1（FoxO1）、超氧化物歧化酶（SOD-2）抗体（Abcam，英国）。
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新生24 h Wistar大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司[合格证号：2013001831722；许可证号：SYXK（沪）2017-0004]。所有动物实验均符合实验动物伦理学要求。采用二次消化法从新生大鼠颅盖骨分离得到原代成骨细胞，用含10%胎牛血清的α-MEM培养液进行培养，取3～4代成骨细胞进行后续实验分析。
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取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为1×104个/ml细胞悬液接种于96孔板，根据前期实验结果[9]设置分组：空白对照组，模型组（40 μmol/L Aβ），阳性对照组（NAC, 2.5 mmol/L），啤酒花提取物低剂量组（HLE, 4 μg/ml）、中剂量组（HLE, 20 μg/ml）、高剂量组（HLE, 100 μg/ml），每组设置4个复孔。24 h后按照上述分组更换为含药培养液。给药48 h后采用MTT法检测成骨细胞的增殖情况。
取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为5×104个/ml细胞悬液接种于24孔板。24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。培养过程中每3 d更换1次含药培养液。第8天裂解细胞，收集细胞裂解液，于4 ℃、13 800×g 离心5 min。用对硝基苯磷酸二钠法测定细胞ALP活性[10]。参照ALP染色试剂盒说明书对成骨细胞进行染色。
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取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为2×105个/ml细胞悬液接种于6孔板。24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。给药48 h后收集各孔中培养基上清液，加入200 μl 0.25%胰蛋白酶消化30 s，离心并重悬，参照凋亡检测试剂盒装载探针，室温避光孵育5 min后，用流式细胞仪进行凋亡率检测。
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取3～4代成骨细胞接种于6孔板，24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。给药48 h后进行细胞裂解，提取细胞总蛋白，根据BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜、封闭后，分别加入COL-I、OPN、Nrf2、HO-1、NQO1、FoxO1及SOD-2抗体，4 ℃孵育过夜。用洗膜缓冲液（Tris-buffered saline/Tween-20，TBST）洗膜3×10 min，加入二抗，室温孵育30 min。用TBST再次洗膜3×10 min，采用ECL试剂进行检测。采用Tanon Image软件对蛋白印迹进行半定量分析。
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取3～4代成骨细胞配制成浓度为2×104个/ml细胞悬液接种于无菌激光共聚焦皿中。24 h后分别更换为含药培养液（Aβ, 40 μmol/L HLE, 100 μg/ml）。给药48 h后用4%的多聚甲醛固定细胞30 min，PBS浸洗后用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透20 min，并用5% BSA封闭液室温封闭1 h。先后加入FoxO1抗体及荧光二抗（TRITC标记山羊抗兔抗体）进行孵育，加入DAPI染液避光孵育10 min进行染核。最后洗去多余的DAPI染液，加入少量PBS使细胞保持湿润，并置于荧光显微镜下观察采集图像。
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实验结果以均值±标准差（
$ \bar x$ ±s）表示。采用SPSS 22.0软件进行数据分析，选用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间变量的比较分析。 -
如图1A所示，与空白组相比，Aβ损伤成骨细胞后，其增殖能力显著降低。药物治疗后，低、中、高剂量的啤酒花提取物均可显著促进Aβ损伤成骨细胞的增殖。另一方面，与空白组比，Aβ显著降低了成骨细胞的ALP活性，而啤酒花提取物显著逆转了Aβ损伤成骨细胞的ALP活性，促进成骨细胞的分化（图1B-C）。
图 1 啤酒花提取物对Aβ损伤成骨细胞增殖（A）及ALP活性（B-C）的影响（n=4）
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如图2所示，与空白组相比，Aβ损伤提高了成骨细胞的凋亡率，而啤酒花提取物（20，100 μg/ml）可显著抑制Aβ损伤成骨细胞的凋亡。提示啤酒花提取物对Aβ诱导的成骨细胞具有较强的抗凋亡作用。
图 2 啤酒花提取物对Aβ损伤成骨细胞凋亡的影响（n=3）
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如图3所示，Aβ损伤成骨细胞后，细胞中骨形成相关蛋白COL-I和OPN的表达显著降低。给予啤酒花提取物（20，100 μg/ml）干预后，COL-I及OPN的表达显著增加，提示啤酒花可显著促进Aβ损伤成骨细胞的骨形成。
图 3 啤酒花提取物对Aβ损伤成骨细胞中COL-I及OPN表达的影响（n=3）
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采用Western blot分析Aβ和啤酒花提取物对成骨细胞中Nrf2及其下游抗氧化酶HO-1和NQO1的影响。结果显示，Aβ显著抑制了成骨细胞中Nrf2及其下游蛋白HO-1和NQO1的表达；而低、中、高剂量的啤酒花提取物均可显著促进Aβ损伤成骨细胞中Nrf2、HO-1及NQO1的表达（图4），提示其能够通过介导Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。
图 4 啤酒花提取物对Aβ损伤成骨细胞中Nrf2、HO-1及NQO1表达的影响（n=3）
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采用免疫荧光及Western blot分析Aβ和啤酒花提取物对成骨细胞中FoxO1信号通路的影响。结果显示，与空白组相比，Aβ显著降低了成骨细胞中的FoxO1含量，而啤酒花提取物（100 μg/ml）可显著下调FoxO1的表达，且使其更多聚集在细胞核内（图5A）。此外，啤酒花提取物（4、20、100 μg/ml）还可显著促进Aβ损伤成骨细胞中FoxO1及其下游蛋白SOD-2的表达，提示啤酒花能够通过介导FoxO1信号通路发挥抗氧化作用。
图 5 啤酒花提取物对Aβ损伤成骨细胞中FoxO1及SOD-2表达的影响（n=3）
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成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，在骨形成过程中经历增殖、分化、矿化和凋亡四个阶段。其中，成骨细胞的增殖水平反映骨形成的强弱，其分泌的ALP是成骨细胞分化阶段的关键酶[11]，可介导骨组织矿化。在骨形成相关蛋白中，COL-I是骨细胞外基质的主要成分之一，约占骨总蛋白的80%[12]，而OPN是一种骨基质糖蛋白，能够促进成骨细胞的黏附和分化[13]，二者均为成骨细胞分化成熟的标志。此外，Aβ沉积会引起机体的氧化损伤，在骨代谢中可降低骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化，破坏成骨细胞的活性和功能，抑制骨形成[14]。我们前期研究同样发现过量的Aβ在聚集过程中会产生大量的活性氧，使机体处于高氧化应激状态，反过来又刺激Aβ产生和聚集，形成Aβ与氧化损伤相偶联[15]。该机制在老年性骨质疏松症发病中处于特别重要的位置，并受到学界关注[16]。本研究中，啤酒花提取物可显著逆转Aβ损伤所致的成骨细胞增殖水平下降、ALP活性降低，以及COL-I和OPN的低表达，表明其可显著促进成骨细胞的成熟分化；并抑制Aβ损伤成骨细胞的凋亡，表明其可显著改善Aβ沉积所致成骨细胞的活性损伤，促进骨形成，在维持骨稳态中发挥重要作用。
Nrf-2信号通路是典型的抗氧化通路，能够拮抗各种原因引起的氧化应激。激活Nrf2信号通路不仅能够抑制氧化损伤成骨细胞的凋亡，促进骨形成[17]，而且能够拮抗Aβ诱导的细胞损伤[18-19]。应激状态下，Nrf-2转移入核内，与基因中的抗氧化反应元件结合，启动下游Ⅱ相代谢酶基因的表达和转录，以增加细胞对氧化应激的抵抗作用，使细胞免于凋亡[20]。FoxO1为调节成骨细胞氧化还原平衡和成骨功能的主要转录因子，其入核可激活下游SOD-2抗氧化酶，调控细胞内的氧化还原平衡，并促进成骨细胞的增殖与分化，在骨代谢中同样发挥着重要作用[20]。本研究结果表明，啤酒花可激活Aβ损伤成骨细胞的Nrf-2和FoxO1信号通路，促进该氧化应激信号通路中相关蛋白的表达，增加成骨细胞对氧化应激的抵抗作用，使其免于凋亡，进而促进成骨细胞增殖与分化。提示啤酒花具有通过抗氧化而调控骨代谢、维持骨稳态之应用潜力。
Hops extract alleviates Aβ-injury to osteoblasts through antioxidant pathway
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摘要:
目的 探讨啤酒花改善β-淀粉样蛋白（Aβ）损伤成骨细胞的骨形成作用及其机制。 方法 以新生24 h Wistar大鼠所分离的成骨细胞为研究对象，用Aβ1-42寡聚体对成骨细胞进行损伤，并用啤酒花提取物进行药物干预。分别采用MTT法、碱性磷酸酶（ALP）活性检测以及茜素红染色法评价成骨细胞的增殖、分化及骨矿化水平，流式细胞仪检测成骨细胞凋亡。采用蛋白质印迹法检测骨形成相关蛋白及氧化应激Nrf2、FoxO1通路蛋白的表达水平，并用免疫荧光检测FoxO1蛋白的入核表达。 结果 啤酒花提取物可显著促进Aβ损伤成骨细胞的增殖，提高ALP活性及骨矿化结节水平，抑制细胞凋亡率，并促进骨形成相关蛋白I型胶原酶（COL-I）及骨桥蛋白（OPN）的表达。此外，啤酒花提取物可显著激活Aβ损伤成骨细胞的Nrf2和FoxO1信号通路，促进该氧化应激信号通路相关蛋白的表达，通过抗氧化维持骨代谢平衡。 结论 本研究表明啤酒花具有减轻Aβ损伤成骨细胞的作用，初步阐明其作用机制与抗氧化有关，为抗骨质疏松作用机制及药物研发提供了新思路。 Abstract:Objective To explore the effects of Humulus lupulus L. extract (HLE) and its mechanism on improving bone formation of Aβ-injured osteoblasts. Methods Osteoblasts isolated from 24 h-old Wistar rats were injured by Aβ1-42 oligomer and intervened with HLE. The proliferation, differentiation and bone mineralization of osteoblasts were determined by MTT assay, alkaline phosphatase (ALP) activity assay and alizarin red staining, respectively. The apoptosis of osteoblasts was detected by flow cytometer. The expression levels of bone formation related proteins, and proteins of Nrf2 and FoxO1 pathways were measured by Western blotting analysis. The intranuclear expression of FoxO1 protein was detected by immunofluorescence. Results HLE significantly improved the cell proliferation, ALP activity and bone mineralization, and inhibited the apoptosis of Aβ-injured osteoblasts. HLE also significantly promoted the expressions of collagen type Ι (COL-I) and osteopontin (OPN) in Aβ-injured osteoblasts. HLE notably activated the Nrf2 and FoxO1 signaling pathways in Aβ-injured osteoblasts by promoting the expressions of related proteins and maintained bone metabolism through relieving oxidative stress. Conclusion This study confirms that HLE can alleviate Aβ-injury to osteoblasts, and preliminarily clarifies the mechanism being related to antioxidation, which provides a new reference for the mechanism research and drugs development for anti-osteoporosis. -
Key words:
- Hops (Humulus lupulus L.) /
- Aβ /
- osteoblast /
- antioxidation /
- osteoporosis
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随着社会经济发展和饮食结构改变，功能性便秘（FC）发生率逐年攀升，并具有顽固性、复发性的特点，无根治特效药[1]，目前临床上对于便秘的干预措施主要包括药物、按摩、膳食调理等，但都存在依从性低、副作用明显、疗效不可靠等弊端[2]，新型抗便秘产品的研发具有迫切需求。黑蒜是一种发酵大蒜，在高温高湿条件下发酵一定时间制得[3]。黑蒜主要化学成分包括多糖、类黑精、蛋白质、多酚、含硫化合物等[4]，研究表明其具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖[5-9]等作用，近年，黑蒜在通便相关的药食同源产品研发领域应用较多，但关于黑蒜抗便秘作用的研究较少，抗便秘功效成分更不明确，相关产品进一步研发与推广缺乏足够的科学依据。且黑蒜用于抗便秘每日需服用20 g以上[10]，易导致依从性差，难以长期坚持等问题。有研究发现大蒜多糖具有一定抗便秘作用[11]，而大蒜在加工成黑蒜的过程中糖类物质含量可增加数倍[12-13]，可合理推测黑蒜多糖可能具有更显著的抗便秘作用，是黑蒜抗便秘作用的物质基础之一，但目前还没有相关的研究。因此，本文建立复方地芬诺酯（CO.D）诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用，为新型抗便秘产品的研发提供科学依据。
1. 材料与仪器
1.1 实验材料
黑蒜（批号：20231030，上海明可名生物科技有限公司）；乳果糖口服液（规格：667 mg/ml，批号：22110047，北京韩美药品有限公司）；复方地芬诺酯片（2.5 mg/片，批号：210804，仁和堂医药连锁股份有限公司）。
1.2 实验试剂
D-无水葡萄糖（批号：S22J12H137237，源叶生物）；无水乙醇（批号：P2708277，泰坦科技）；生理盐水（批号：230327042，雷根生物）；4%多聚甲醛（批号：HP184401，博光生物）；浓硫酸（批号：
20230420）、 丙酮（批号：20230807 ）、石油醚（批号：20220507 ）均购自国药集团；三氯乙酸（批号：C14990699）、活性炭粉（批号：C14853603）、阿拉伯树胶粉（批号：C15109301）、苯酚（批号：C15031044）均购自麦克林生化；所有水均为超纯水机所制一级水。1.3 实验仪器
鼓风干燥箱DAG-924（满贤经贸）；循环水式多用真空泵SHB-III（明杰仪器）；万分之一天平JA1003（恒平仪器）；电热恒温水浴锅HWS-12（一恒仪器）；高速离心机M18G（创宜生物）；旋转蒸发器RE-52AA（亚荣仪器）；超纯水机Smart-S（和泰仪器）。
1.4 实验动物
SPF级C57雄性小鼠，体重18 ~22 g，许可证号： SCXK（浙）2019-00004，杭州子源实验动物科技有限公司。
2. 方法
2.1 黑蒜多糖的提取
取10 g黑蒜，按下列步骤处理： ①脱脂：剥去外壳，研磨成泥，85%乙醇水溶液（V/V）浸渍，常温静置8 h，抽滤，滤渣用85%乙醇水溶液洗涤2次，置于烘箱60℃挥干至无醇味，充分研磨获得脱脂黑蒜粉。②水提：所得脱脂黑蒜粉用80℃热水浸提1 h，料液比为1∶50，抽滤，滤液减压浓缩至原体积1/2。③脱蛋白：在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸水溶液，充分混匀，4℃静置10 h，离心取上清液。④醇沉：上清液加入无水乙醇，调节乙醇水溶液浓度为80%，充分混匀，4℃静置12 h，离心取沉淀。⑤干燥：挥干有机溶剂，烘箱60℃干燥，去除残留溶剂，得黑蒜多糖干燥粉末。
2.2 多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[14]测定多糖含量。
2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制
精密称取D-无水葡萄糖适量，配置为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别吸取250 μl于离心管中，依次加入6%苯酚溶液150 μl、浓硫酸625 μl，迅速振摇，静置反应30 min，吸取200 μl于96孔板，设置3个复孔，测量490 nm处吸光度。绘制葡萄糖标准曲线，求得回归方程。
2.2.2 样品测定
精密称取适量黑蒜多糖干燥粉末，加入蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，根据酶标仪检测范围进行稀释。吸取250 μl多糖溶液于96孔板中，按照2.2.1项下方法进行测定，计算样品中多糖的含量，进一步计算黑蒜多糖的得率和纯度。
计算公式：黑蒜多糖得率（%）=
$ \dfrac{W2}{W1}\times 100\text{%} $ 黑蒜多糖纯度（%）=
$ \dfrac{C\times V\times D}{W2}\times 100\text{%} $ 式中：
$ W $ 1为黑蒜质量（g）；$ W $ 2为黑蒜多糖粉末质量；$ C $ 为样品中多糖的质量浓度（mg/ml）；$ V $ 为提取溶剂体积（ml）；$ D $ 为样品稀释倍数。2.3 动物实验给药剂量及配置
乳果糖口服液：乳果糖含量为667 mg/ml，正常成人用药量15 ml/d[15]，换算可得小鼠的用药剂量为4 g/（kg·d）。量取乳果糖口服液6 ml，加蒸馏水14 ml，配置成200 mg/ml的乳果糖口服液。
CO.D混悬液：参考贾红慧等[16]研究结果，选用5 mg/kg剂量CO.D造模，模型稳定、灵敏。取CO.D 4片，研磨成细粉，加蒸馏水20 ml，配置成0.5 mg/ml的 CO.D混悬液，使用前需充分混匀。
黑蒜多糖低、中、高剂量溶液：参考胡淼等[17]研究结果，黑蒜多糖低、中、高剂量组剂量分别选用0.25、0.5、1 g/kg。称取0.5、1、2 g黑蒜多糖干燥粉末，分别加蒸馏水20 ml，配置成25、50、100 mg/ml的黑蒜多糖溶液。
墨汁[18]：阿拉伯树胶于蒸馏水中加热至完全溶解，料液比为1∶8。加入5 g活性炭粉末，混合均匀，重复煮沸3次，冷却后定容至100 ml，使用前需充分混匀。
含药墨汁：取适量受试药，加入墨汁，配制成与上述受试药剂量相同的含药墨汁。
2.4 实验动物分组及给药方法
2.4.1 小鼠小肠墨汁推进实验
小鼠60只，适应性饲养1周，正常饮食饮水。给药前按照体重随机分为空白组、模型组、阳性组、黑蒜多糖低、中、高剂量组，每组10只。
按照0.1 ml/10 g灌胃给药。①给药：空白组和模型组小鼠给予蒸馏水，阳性组和黑蒜多糖组小鼠分别给予乳果糖口服液和黑蒜多糖溶液。1次/d，连续给药1周，观察并记录小鼠体重变化及一般状态。②造模：末次给药后禁食12 h，自由饮水，空白组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组小鼠灌胃CO.D溶液。③给药：30 min后空白组、模型组灌胃墨汁，其它组小鼠灌胃相应含药墨汁。25 min后处死，剖取小鼠小肠（幽门至盲肠上端），平铺成直线，测量小肠总长度和墨汁推进距离，避免拉伸小肠，影响实验结果。
计算公式：小肠墨汁推进率（%）=墨汁推进距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%
2.4.2 小鼠排便实验
分组、给药剂量及方法同“2.4.1”项下实验方法，给药后，记录每只小鼠首次排出黑便的时间、6 h内排出黑便的数量及重量，并进行粪便含水量测定，同时观察粪便性状。含水量测定方法为：将小鼠新鲜粪便置于提前干燥、称重的容器中，称重，于烘箱中干燥至重量不再变化，计算粪便含水量。
计算公式：粪便含水量（%）=
$ \dfrac{M1-M2}{M1}\times 100\text{%} $ 式中：M1为干燥前粪便质量（g），M2为干燥后粪便质量（g）。
2.5 统计学方法
采用SPSS 24统计软件进行数据分析，以均数±标准差（
$ \bar{X} $ ±S）表示计量资料。两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。3. 结果与分析
3.1 黑蒜多糖的得率和纯度
精密称量所得黑蒜多糖干燥粉末质量为0.832 g，代入公式计算可得黑蒜多糖的得率为8.32%。以葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，可得回归方程为Y=
2.2829 X+0.0764 ，相关系数r=0.9982 ，线性关系较好，代入回归方程计算可得黑蒜多糖的纯度为58.23%。3.2 黑蒜多糖对小鼠体重的影响
从表1可以看出，与空白组相比，各组小鼠体重均正常增长，无显著性差异，表明黑蒜多糖不会对正常小鼠体重产生影响。实验过程中，各组小鼠饮食正常，状态良好，无腹泻等不良反应，为后续实验提供前提保证。
表 1 黑蒜多糖对小鼠体重的影响组别 小鼠小肠墨汁推进实验 排便实验 初始体重
（m/g）最终体重
（m/g）初始体重
（m/g）最终体重
(m/g)空白组 21.28±1.15 22.23±1.19 21.80±1.02 22.90±0.61 模型组 21.20±1.36 22.24±1.22 21.58±1.00 22.64±0.84 阳性组 21.17±1.18 22.31±1.28 21.42±1.01 22.81±0.91 黑蒜多糖
低剂量组21.44±1.32 22.38±1.54 21.98±1.20 23.02±1.20 黑蒜多糖
中剂量组21.06±1.13 22.16±0.77 21.59±1.10 22.38±1.08 黑蒜多糖
高剂量组21.42±1.15 22.54±1.26 21.79±1.29 22.85±0.98 3.3 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响
从表2可以看出，与空白组相比，模型组墨汁推进率极显著减小，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠墨汁推进率均显著增大，分别增大了24.75%、56.95%、95.25%，表明黑蒜多糖对FC模型小鼠小肠运动具有促进作用，且成剂量依赖性。
表 2 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响组别 碳末推进距离
（l/cm）小肠总长度
（l/cm）墨汁推进率
（%）空白组 28.86±3.25 34.87±1.60 82.90±9.97 模型组 9.60±0.73*** 34.09±2.31 29.50±1.35*** 阳性组 26.94±3.55### 34.15±1.60 79.00±9.92### 黑蒜多糖
低剂量组12.58±1.15### 34.35±1.67 36.80±4.42# 黑蒜多糖
中剂量组16.01±2.06### 34.48±3.18 46.30±4.19### 黑蒜多糖
高剂量组19.95±1.60### 34.66±1.96 57.60±4.06### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01， ###P<0.001，与模型组比较。 3.4 黑蒜多糖对小鼠排便的影响
从表3可看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排出黑便时间极显著延长，6 h排便粒数显著减少，6 h排便重量极显著减少，粪便含水量极显著降低，粪便呈球形或短椭圆形，部分串联，质地干硬，颜色普遍偏黑，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠首次排出黑便时间均极显著缩短，分别缩短了42.55%、44.99%、45.81%；6 h排便重量显著增加，分别增加了68.42%、78.95%、78.95%；粪便含水量极显著增大，分别增大了29.96%、32.78%和35.82%，粪便呈长椭圆形，质地较软，颜色为深棕色，无腹泻现象；除黑蒜多糖低剂量组外，中、高剂量组小鼠6 h排便粒数有统计学差异，分别增加了31.45%和32.52%。表明黑蒜多糖可能通过增大FC模型小鼠粪便含水量发挥促排便作用，各剂量组间效果差异不明显。
表 3 黑蒜多糖对小鼠排便及粪便含水量的影响组别 首黑便时间
（t/min）6 h排便数
（粒）6 h排便湿重
（m/g）6 h排便干重
（m/g）含水量
（%）空白组 111.50±8.98 16.50±3.51 0.46±0.10 0.22±0.04 52.16±2.53 模型组 241.50±19.54*** 11.13±2.75** 0.19±0.02*** 0.13±0.01*** 32.58±2.35*** 阳性组 121.50±110.81### 15.13±4.09# 0.41±0.12### 0.20±0.06## 50.06±1.83### 黑蒜多糖低剂量组 138.75±10.79### 13.75±2.71 0.32±0.08## 0.19±0.42# 42.34±2.27### 黑蒜多糖中剂量组 132.88±8.34### 14.63±3.66# 0.34±0.10## 0.19±0.05## 43.26±2.68### 黑蒜多糖高剂量组 130.88±9.09### 14.75±3.73# 0.34±0.12## 0.19±0.05## 44.25±6.72### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较。 4. 讨论
CO.D是一种止泻药，可通过抑制肠道平滑肌上的肠黏膜感受器抑制肠道运动，减慢排便进程，减少排便次数，同时肠内容物与肠粘膜接触时间延长，可促进肠内容物水分的重吸收，降低粪便含水量，是常用的FC小鼠模型造模药[19]。因此，本研究建立CO.D诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用。实验结果表明，黑蒜多糖可显著促进CO.D诱导的FC模型小鼠小肠蠕动，缩短排便时间，增加粪便含水量，从而发挥抗便秘作用。有研究显示成人每日服用约2 g黑蒜多糖便可达到较好疗效，用量仅为黑蒜的1/10[10]。给药期间小鼠状态良好、体重正常，未产生腹泻等副作用。因此，黑蒜多糖用于FC治疗可有效规避依从性差、副作用明显、疗效不可靠等弊端，前景广阔。此外，有相关研究发现，采用CO.D 10 mg/kg和15 mg/kg灌胃造模（大鼠）都存在停药后恢复的情况[20]，提示我们使用CO.D进行慢性便秘造模，在造模成功后的治疗给药阶段也需要持续用药，以维持药效。目前该便秘模型的建立没有统一标准，后续可对造模时间、造模剂量进行优化，为更深入的黑蒜多糖抗便秘机制研究提供基础。
FC是典型的胃肠动力障碍性疾病，现代研究普遍认为，其发病机制主要与卡哈尔间质细胞（ICCs）数量、功能以及分布异常、肠神经递质水平异常、水通道蛋白表达异常、氧化应激指标失衡、肠道菌群紊乱等有关[21-22]。大蒜多糖主要为果聚糖，占干重的65%，在发酵生成黑蒜的过程中，果聚糖因高温作用大量降解为低聚果糖（FOS）、果糖等小分子糖[23]。FOS在国际营养学界被称作“具有优良难消化性的水溶性膳食纤维”，还是典型的“超强双歧因子”。因其无法被肠道吸收，可被双歧杆菌等益生菌分解利用，短时间内促进双歧杆菌增殖10~100倍，分解生成的有机酸，可有效调节肠道pH，刺激肠道蠕动，促进排便[24]。双歧杆菌还可抑制有害肠道病菌生长、抵抗病原菌感染、产生维生素并促进矿物质吸收以维持肠道健康，有研究表明人体双歧杆菌含量随年龄增长逐渐减少，是老年人易发生便秘的主要原因[25]。因此，需要进一步明确黑蒜多糖的单糖组成、相对分子质量以及结构，为后续抗便秘机制研究提供依据。此外，便秘成因复杂，可结合具体的证型如脾虚、血虚、阳虚、津亏等便秘模型进一步探究黑蒜多糖抗便秘作用的有效性。
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