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骨质疏松症（OP）是一种由骨吸收和骨形成之间的关系失衡造成，以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢疾病。其中，成骨细胞是骨形成的功能细胞，在维持骨稳态中起到关键作用[1]。目前，高氧化应激相关的骨丢失已成为骨质疏松研究领域的热点。有研究表明，细胞保护酶是机体对抗氧化应激状态下活性氧（ROS）损伤的主要机制，其活性主要由转录因子Nrf2和FoxO调控，而二者所介导的氧化应激通路同样被证实具有调节成骨细胞氧化还原平衡以及促进骨形成分化的功能[2]。与此同时，β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的沉积可使机体ROS生成增多，进而抑制成骨细胞的增殖、成骨基质的产生及矿化[3]。由此可见，Aβ沉积偶联的氧化损伤是破坏成骨细胞骨形成，进而引发骨丢失的一大诱因。
啤酒花（Hops, Humulus lupulus L.）为桑科葎草属多年生草质蔓生藤本植物，其雌性球穗花序不仅作为啤酒酿造的添加原料，也是全球广泛应用的植物药，在欧洲广泛用于缓解更年期潮热及绝经后骨质疏松症[4]。我们前期研究发现啤酒花能够促进成骨细胞骨矿化结节的形成，降低活性氧水平，并显著改善APP/PS1转基因小鼠的骨丢失[5-6]，但其对外源性Aβ损伤成骨细胞的氧化应激水平及骨形成的影响尚不明确。此外，我们首次确认了氧化应激和Aβ沉积之间的双向关联，及其在老年性骨质疏松症发病中的重要作用[7-8]。故本文拟以Aβ损伤的成骨细胞为模型，以Nrf2和FoxO1两条经典氧化应激相关通路为核心，对啤酒花的抗氧化能力及对骨形成干预作用进行探究。
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啤酒花药材购于昌吉市山水啤酒花有限公司（产地：新疆昌吉；批号：PJH-01），经海军军医大学药学系生药学教研室辛海量副教授鉴定为啤酒花 Humulus lupulus L.的雌性球穗花序。称取啤酒花药材粉末70 g，加入料液比为1∶15的75%乙醇，回流提取3次，减压浓缩干燥成浸膏，HPLC测定得浸膏中主要成分黄腐酚含量为0.55%[9]，使用前配制成相应浓度（生药量/ml）的提取液。
其他试剂及厂家：Aβ1-42寡聚体（上海吉尔）；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，上海碧云天）；胎牛血清（Gibco，美国）；α-MEM培养基等细胞培养试剂（天津灏洋）；碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒（南京建成）；I型胶原酶（COL-I）、骨桥蛋白（OPN）、核因子-E2-相关因子（Nrf2）、血红素加氧酶-1（HO-1）、NAD(P)H：醌氧化还原酶（NQO1）、细胞叉头框蛋白O1（FoxO1）、超氧化物歧化酶（SOD-2）抗体（Abcam，英国）。
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新生24 h Wistar大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司[合格证号：2013001831722；许可证号：SYXK（沪）2017-0004]。所有动物实验均符合实验动物伦理学要求。采用二次消化法从新生大鼠颅盖骨分离得到原代成骨细胞，用含10%胎牛血清的α-MEM培养液进行培养，取3～4代成骨细胞进行后续实验分析。
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取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为1×104个/ml细胞悬液接种于96孔板，根据前期实验结果[9]设置分组：空白对照组，模型组（40 μmol/L Aβ），阳性对照组（NAC, 2.5 mmol/L），啤酒花提取物低剂量组（HLE, 4 μg/ml）、中剂量组（HLE, 20 μg/ml）、高剂量组（HLE, 100 μg/ml），每组设置4个复孔。24 h后按照上述分组更换为含药培养液。给药48 h后采用MTT法检测成骨细胞的增殖情况。
取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为5×104个/ml细胞悬液接种于24孔板。24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。培养过程中每3 d更换1次含药培养液。第8天裂解细胞，收集细胞裂解液，于4 ℃、13 800×g 离心5 min。用对硝基苯磷酸二钠法测定细胞ALP活性[10]。参照ALP染色试剂盒说明书对成骨细胞进行染色。
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取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为2×105个/ml细胞悬液接种于6孔板。24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。给药48 h后收集各孔中培养基上清液，加入200 μl 0.25%胰蛋白酶消化30 s，离心并重悬，参照凋亡检测试剂盒装载探针，室温避光孵育5 min后，用流式细胞仪进行凋亡率检测。
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取3～4代成骨细胞接种于6孔板，24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。给药48 h后进行细胞裂解，提取细胞总蛋白，根据BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜、封闭后，分别加入COL-I、OPN、Nrf2、HO-1、NQO1、FoxO1及SOD-2抗体，4 ℃孵育过夜。用洗膜缓冲液（Tris-buffered saline/Tween-20，TBST）洗膜3×10 min，加入二抗，室温孵育30 min。用TBST再次洗膜3×10 min，采用ECL试剂进行检测。采用Tanon Image软件对蛋白印迹进行半定量分析。
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取3～4代成骨细胞配制成浓度为2×104个/ml细胞悬液接种于无菌激光共聚焦皿中。24 h后分别更换为含药培养液（Aβ, 40 μmol/L HLE, 100 μg/ml）。给药48 h后用4%的多聚甲醛固定细胞30 min，PBS浸洗后用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透20 min，并用5% BSA封闭液室温封闭1 h。先后加入FoxO1抗体及荧光二抗（TRITC标记山羊抗兔抗体）进行孵育，加入DAPI染液避光孵育10 min进行染核。最后洗去多余的DAPI染液，加入少量PBS使细胞保持湿润，并置于荧光显微镜下观察采集图像。
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实验结果以均值±标准差（
$ \bar x$ ±s）表示。采用SPSS 22.0软件进行数据分析，选用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间变量的比较分析。 -
如图1A所示，与空白组相比，Aβ损伤成骨细胞后，其增殖能力显著降低。药物治疗后，低、中、高剂量的啤酒花提取物均可显著促进Aβ损伤成骨细胞的增殖。另一方面，与空白组比，Aβ显著降低了成骨细胞的ALP活性，而啤酒花提取物显著逆转了Aβ损伤成骨细胞的ALP活性，促进成骨细胞的分化（图1B-C）。
图 1 啤酒花提取物对Aβ损伤成骨细胞增殖（A）及ALP活性（B-C）的影响（n=4）
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如图2所示，与空白组相比，Aβ损伤提高了成骨细胞的凋亡率，而啤酒花提取物（20，100 μg/ml）可显著抑制Aβ损伤成骨细胞的凋亡。提示啤酒花提取物对Aβ诱导的成骨细胞具有较强的抗凋亡作用。
图 2 啤酒花提取物对Aβ损伤成骨细胞凋亡的影响（n=3）
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如图3所示，Aβ损伤成骨细胞后，细胞中骨形成相关蛋白COL-I和OPN的表达显著降低。给予啤酒花提取物（20，100 μg/ml）干预后，COL-I及OPN的表达显著增加，提示啤酒花可显著促进Aβ损伤成骨细胞的骨形成。
图 3 啤酒花提取物对Aβ损伤成骨细胞中COL-I及OPN表达的影响（n=3）
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采用Western blot分析Aβ和啤酒花提取物对成骨细胞中Nrf2及其下游抗氧化酶HO-1和NQO1的影响。结果显示，Aβ显著抑制了成骨细胞中Nrf2及其下游蛋白HO-1和NQO1的表达；而低、中、高剂量的啤酒花提取物均可显著促进Aβ损伤成骨细胞中Nrf2、HO-1及NQO1的表达（图4），提示其能够通过介导Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。
图 4 啤酒花提取物对Aβ损伤成骨细胞中Nrf2、HO-1及NQO1表达的影响（n=3）
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采用免疫荧光及Western blot分析Aβ和啤酒花提取物对成骨细胞中FoxO1信号通路的影响。结果显示，与空白组相比，Aβ显著降低了成骨细胞中的FoxO1含量，而啤酒花提取物（100 μg/ml）可显著下调FoxO1的表达，且使其更多聚集在细胞核内（图5A）。此外，啤酒花提取物（4、20、100 μg/ml）还可显著促进Aβ损伤成骨细胞中FoxO1及其下游蛋白SOD-2的表达，提示啤酒花能够通过介导FoxO1信号通路发挥抗氧化作用。
图 5 啤酒花提取物对Aβ损伤成骨细胞中FoxO1及SOD-2表达的影响（n=3）
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成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，在骨形成过程中经历增殖、分化、矿化和凋亡四个阶段。其中，成骨细胞的增殖水平反映骨形成的强弱，其分泌的ALP是成骨细胞分化阶段的关键酶[11]，可介导骨组织矿化。在骨形成相关蛋白中，COL-I是骨细胞外基质的主要成分之一，约占骨总蛋白的80%[12]，而OPN是一种骨基质糖蛋白，能够促进成骨细胞的黏附和分化[13]，二者均为成骨细胞分化成熟的标志。此外，Aβ沉积会引起机体的氧化损伤，在骨代谢中可降低骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化，破坏成骨细胞的活性和功能，抑制骨形成[14]。我们前期研究同样发现过量的Aβ在聚集过程中会产生大量的活性氧，使机体处于高氧化应激状态，反过来又刺激Aβ产生和聚集，形成Aβ与氧化损伤相偶联[15]。该机制在老年性骨质疏松症发病中处于特别重要的位置，并受到学界关注[16]。本研究中，啤酒花提取物可显著逆转Aβ损伤所致的成骨细胞增殖水平下降、ALP活性降低，以及COL-I和OPN的低表达，表明其可显著促进成骨细胞的成熟分化；并抑制Aβ损伤成骨细胞的凋亡，表明其可显著改善Aβ沉积所致成骨细胞的活性损伤，促进骨形成，在维持骨稳态中发挥重要作用。
Nrf-2信号通路是典型的抗氧化通路，能够拮抗各种原因引起的氧化应激。激活Nrf2信号通路不仅能够抑制氧化损伤成骨细胞的凋亡，促进骨形成[17]，而且能够拮抗Aβ诱导的细胞损伤[18-19]。应激状态下，Nrf-2转移入核内，与基因中的抗氧化反应元件结合，启动下游Ⅱ相代谢酶基因的表达和转录，以增加细胞对氧化应激的抵抗作用，使细胞免于凋亡[20]。FoxO1为调节成骨细胞氧化还原平衡和成骨功能的主要转录因子，其入核可激活下游SOD-2抗氧化酶，调控细胞内的氧化还原平衡，并促进成骨细胞的增殖与分化，在骨代谢中同样发挥着重要作用[20]。本研究结果表明，啤酒花可激活Aβ损伤成骨细胞的Nrf-2和FoxO1信号通路，促进该氧化应激信号通路中相关蛋白的表达，增加成骨细胞对氧化应激的抵抗作用，使其免于凋亡，进而促进成骨细胞增殖与分化。提示啤酒花具有通过抗氧化而调控骨代谢、维持骨稳态之应用潜力。
Hops extract alleviates Aβ-injury to osteoblasts through antioxidant pathway
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摘要:
目的 探讨啤酒花改善β-淀粉样蛋白（Aβ）损伤成骨细胞的骨形成作用及其机制。 方法 以新生24 h Wistar大鼠所分离的成骨细胞为研究对象，用Aβ1-42寡聚体对成骨细胞进行损伤，并用啤酒花提取物进行药物干预。分别采用MTT法、碱性磷酸酶（ALP）活性检测以及茜素红染色法评价成骨细胞的增殖、分化及骨矿化水平，流式细胞仪检测成骨细胞凋亡。采用蛋白质印迹法检测骨形成相关蛋白及氧化应激Nrf2、FoxO1通路蛋白的表达水平，并用免疫荧光检测FoxO1蛋白的入核表达。 结果 啤酒花提取物可显著促进Aβ损伤成骨细胞的增殖，提高ALP活性及骨矿化结节水平，抑制细胞凋亡率，并促进骨形成相关蛋白I型胶原酶（COL-I）及骨桥蛋白（OPN）的表达。此外，啤酒花提取物可显著激活Aβ损伤成骨细胞的Nrf2和FoxO1信号通路，促进该氧化应激信号通路相关蛋白的表达，通过抗氧化维持骨代谢平衡。 结论 本研究表明啤酒花具有减轻Aβ损伤成骨细胞的作用，初步阐明其作用机制与抗氧化有关，为抗骨质疏松作用机制及药物研发提供了新思路。 Abstract:Objective To explore the effects of Humulus lupulus L. extract (HLE) and its mechanism on improving bone formation of Aβ-injured osteoblasts. Methods Osteoblasts isolated from 24 h-old Wistar rats were injured by Aβ1-42 oligomer and intervened with HLE. The proliferation, differentiation and bone mineralization of osteoblasts were determined by MTT assay, alkaline phosphatase (ALP) activity assay and alizarin red staining, respectively. The apoptosis of osteoblasts was detected by flow cytometer. The expression levels of bone formation related proteins, and proteins of Nrf2 and FoxO1 pathways were measured by Western blotting analysis. The intranuclear expression of FoxO1 protein was detected by immunofluorescence. Results HLE significantly improved the cell proliferation, ALP activity and bone mineralization, and inhibited the apoptosis of Aβ-injured osteoblasts. HLE also significantly promoted the expressions of collagen type Ι (COL-I) and osteopontin (OPN) in Aβ-injured osteoblasts. HLE notably activated the Nrf2 and FoxO1 signaling pathways in Aβ-injured osteoblasts by promoting the expressions of related proteins and maintained bone metabolism through relieving oxidative stress. Conclusion This study confirms that HLE can alleviate Aβ-injury to osteoblasts, and preliminarily clarifies the mechanism being related to antioxidation, which provides a new reference for the mechanism research and drugs development for anti-osteoporosis. -
Key words:
- Hops (Humulus lupulus L.) /
- Aβ /
- osteoblast /
- antioxidation /
- osteoporosis
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隐丹参酮（CTS）是中药丹参的有效成分之一，国内外研究证明CTS具有抗肿瘤、抗炎、神经保护、心血管保护、抗纤维化和调节代谢紊乱等药理特性，具有广阔的临床应用前景。抗肿瘤作用是近年来隐丹参酮药理活性研究的热点问题之一[1]。隐丹参酮对肺癌、肝胆癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、骨肉瘤癌、黑色素瘤、横纹肌瘤、食管鳞状癌等多种恶性肿瘤表现出一定的抑制活性，其抗肿瘤机理包括抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，调节免疫以及抑制包括STAT3在内的多种信号通路[2-4]。由于CTS中等强度的药理活性和选择性，近年来研究人员对CTS进行了大量结构修饰，期望获得靶点明确且药理活性更强的CTS衍生物，从而开发并应用于临床治疗。本文就隐丹参酮及其衍生物在抗肿瘤方面的作用及其机制进行综述。
1. 隐丹参酮抗肿瘤作用
1.1 抑制肿瘤细胞增殖
癌细胞的主要特点是具有无限的增殖能力。研究表明，CTS可以抑制多种肿瘤细胞增殖，包括胰腺癌细胞BxPC-3、慢性髓性白血病细胞K562/ADR、胶质瘤细胞U87、人卵巢癌细胞Hey、前列腺癌细胞DU145、乳腺癌细胞MCF7、食管鳞状细胞癌ESCC等[5]。
1.2 诱导肿瘤细胞凋亡
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，对于维持组织稳态和消除不需要或受损细胞起重要作用。研究发现，CTS可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，包括骨髓瘤细胞U266、人结肠癌细胞系SW620 Ad300和HCT116、人胃癌细胞MKN-45、肝癌细胞Hepa1-6、非小细胞肺癌细胞A549 和H460 、黑色素瘤细胞A375、横纹肌肉瘤细胞Rh30等[6]。
1.3 抑制细胞迁移和侵袭
高侵袭性和转移是癌细胞恶性特征，转移是癌症死亡的主要原因。因此，抑制癌细胞转移能有效降低癌症死亡率。研究发现，CTS能够抑制卵巢癌细胞A2780的迁移和侵袭[7]。此外，CTS还可以抑制食管癌细胞EC109、膀胱癌细胞T24、人舌鳞癌细胞CAL27、小鼠结肠癌细胞CT26等多种肿瘤细胞的迁移和侵袭[5]。
1.4 调节机体免疫功能
隐丹参酮不仅能够直接抑制多种肿瘤细胞的生长，还可以诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，从而间接发挥抗肿瘤效应。研究发现，隐丹参酮能够通过增加CD4+T细胞的细胞毒作用，抑制人非小细胞肺癌H446细胞和乳腺癌MCF7细胞的生长[8]。此外，隐丹参酮还可以通过诱导小鼠树突状细胞成熟，促进抗原提呈功能，进而诱导T细胞活化增殖，抑制Lewis肺癌细胞的增殖[9]。肿瘤相关巨噬细胞 （TAM) 是肿瘤组织中浸润的巨噬细胞，具有异质性，可分为M1和M2表型。M2表型的TAM能够促进肿瘤生长和转移，相反，M1表型则具有肿瘤抑制和促炎特性。研究发现，隐丹参酮和PD-L1联合治疗能够诱导巨噬细胞向M1极化，从而抑制小鼠肝癌Hepa1-6移植瘤的生长[10]。
1.5 逆转多重耐药
耐药是导致肿瘤复发和治疗失败的主要原因。研究表明，CTS能够逆转慢性骨髓性白血病细胞K562对伊马替尼的耐药性[11]，改善A549细胞对顺铂的耐药性[12]。此外，CTS还可以逆转P-糖蛋白（p-gp）过表达的结肠癌细胞SW620 Ad300对多柔比星和伊立替康的多重耐药[13]。
1.6 合并用药可增强不同抗癌药物的作用
除了具有以上活性之外，CTS还可以与其他不同抗癌药物或细胞因子协同发挥抗肿瘤作用。例如，CTS和紫杉醇的联合用药比单独用药更能有效诱导舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-9细胞的凋亡[14]。新近研究发现，CTS与小剂量的抗PD-L1抗体合用对小鼠Lewis 肺癌的生长抑制作用明显优于CTS单独应用[9]。
1.7 自噬
自噬，即Ⅱ型程序性细胞死亡，作为凋亡之外的另一种可以杀死细胞的途径，是一种抑制癌细胞生长的新方法。研究显示，CTS可通过诱导结肠癌SW620 Ad300细胞和A549细胞自噬促进细胞死亡[15-16]。
2. 抗肿瘤作用机制
CTS抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，以及调节免疫等作用的机制十分广泛，涉及靶点STAT3、酪氨酸蛋白磷酸酶SHP2、DNA拓扑异构酶和信号通路磷酸酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸激酶Akt等。
2.1 调控STAT3信号通路
STAT3由Janus激酶（JAKs)激活，参与肿瘤增殖、凋亡、血管生成及免疫逃逸等。STAT3在大多数恶性肿瘤中被组成性激活，异常的STAT3信号传导是肿瘤恶性进展的重要过程。当705位酪氨酸残基磷酸化后，STAT3被激活，单体STAT3通过其SH2结构域形成二聚体，并从细胞质转移到细胞核中，调节其靶基因的表达，例如，上调cyclin D1、survivin、Mcl-1、MYC、BCL-XL表达，下调 p53表达，促进肿瘤细胞增殖和存活；上调MMP2/9、Twist1、Vimentin表达，促进肿瘤转移；上调TGF-β、IL-6/10、PD-1、PD-L1、VEGF表达，下调CD80/86、MHCII、TNF、IL-12、CCL5、CXCL10等表达，抑制肿瘤微环境免疫功能[17]。研究发现，CTS能够直接与STAT3的SH2结构域结合，特异性抑制STAT3 Tyr705的磷酸化，抑制STAT3二聚化[18-19]，相比之下，姜黄素还能抑制Jak2的表达[20]。在人胰腺癌BxPC-3细胞中，CTS能够抑制BxPC-3细胞的STAT3信号通路进而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，达到抗肿瘤的作用[21]。另外，CTS作为p-STAT3抑制剂，能够有效阻断IL-6介导的STAT3活化，抑制肿瘤增殖，逆转BCR-ABL激酶非依赖性耐药途径[11]。此外，CTS和紫杉醇联合治疗能够有效地抑制舌鳞状癌TSCC细胞增殖和迁移，其作用机制同样与抑制STAT3信号通路相关[14]。沉默信息转录调控因子3（SIRT3）是一种蛋白质去乙酰化酶，参与癌症、心血管、神经系统等疾病的发展过程。研究发现CTS能够通过抑制STAT3/SIRT3 信号通路抑制人卵巢癌A2780 细胞增殖[22]。 上述研究表明，抑制STAT3信号通路对于CTS抗肿瘤至关重要，且CTS是一种特异性的STAT3抑制剂。
2.2 抑制蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2
含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP2）由基因PTPN11编码，PTPN11突变引起SHP2催化活性异常增加。研究发现，肺癌、结肠癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肝癌和急性髓性白血病等病人均发现有PTPN11突变[23]。SHP2是一种非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，参与Ras-Erk、PI3K-Akt、Jak-Stat和NF-κB多条信号通路传导，调控细胞的增殖、迁移和凋亡等过程[24]。研究证明，CTS能与SHP2直接结合，是一个混合型蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂，抑制SHP2 的IC50为22.50μmol/L，抑制SHP1的IC50为39.50μmol/L。用SHP2 siRNA敲减Hela细胞中SHP2后，CTS抑制Hela细胞生长的敏感性降低，提示SHP2是CTS的一个靶点，但是，CTS仍然可以进一步抑制SHP2敲减细胞生长，说明CTS还有其它作用靶点[25]。此外，有研究发现，CTS能够上调胶质瘤细胞 U87 SHP2蛋白酪氨酸磷酸酶活性，抑制STAT3 Tyr705的磷酸化，从而在体内外表现出抑制恶性胶质瘤活性[26]。
2.3 调控 topo 2a水平
DNA拓扑异构酶 （topos），包括DNA拓扑异构酶1（topo1）和DNA拓扑异构酶2（topo2），其中topo2因其在有丝分裂中的关键作用被认为是抗癌治疗的重要靶点[27]。研究表明，CTS能够显著降低前列腺癌PC3细胞中topo 2a的mRNA、蛋白和酶活性水平，并且在裸鼠异种移植模型中表现出良好的抗肿瘤作用[28]。
2.4 调控活性氧水平
活性氧与肿瘤的发展密切相关，其过度产生可诱导多种生物学效应，包括抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬等[29]。研究发现，CTS能够促进胃癌MKN-28 细胞ROS的累积，通过调控MAPK和AKT信号通路诱导G2/M周期阻滞[30]；通过ROS-线粒体途径，上调cleaved caspases-3、促凋亡蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白Bcl-2，从而诱导黑色素瘤细胞凋亡[31]；诱导横纹肌肉瘤Rh30细胞ROS产生，激活JNK/p-38，抑制Erk1/2，导致细胞凋亡[32]；刺激SW620 Ad300细胞中的ROS产生，诱导p38 MAPK激活，导致NF-κB从细胞质转移到细胞核中，最终导致自噬发生[15]；刺激HepG2和MCF-7细胞产生ROS，激活内质网（ER）应激，增强不同抗癌药物或细胞因子（Fas/Apo-1、TNF-α、顺铂、依托泊苷或5-FU）诱导的细胞凋亡[33]。
2.5 调控雌、雄激素受体信号
雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）分别是治疗前列腺癌PCa和乳腺癌的主要靶点。研究发现CTS可以通过抑制AR二聚化有效抑制AR活性，从而抑制AR+ PCa细胞的生长[34]；在异种移植动物模型中，CTS可以有效抑制人前列腺癌CWR22Rv1细胞的生长和AR靶基因的表达[35]。此外，CTS还能够抑制乳腺癌细胞的生长，通过竞争性地结合ERα抑制E2诱导的ER转录活性和ER靶基因的表达[36]；同时，CTS可以有效地抑制体内异种移植瘤模型中ER信号，发挥抗肿瘤作用[37]。
2.6 PI3K/AKT信号通路
磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（Akt）信号通路参与肿瘤的发生、生长、存活和转移。有研究发现CTS可抑制PI3K/AKT信号通路，增加caspase-3、caspase-9、PARP和Bax的表达，降低Bcl-2、survivin、细胞凋亡抑制蛋白的表达，诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡[38-39]。酪氨酸激酶胰岛素生长因子1受体（IGF-1R）在肿瘤细胞的生长、分化和进展中起关键的作用。研究表明，CTS能够通过下调IGF-1R/PI3K/Akt信号通路抑制人肺癌细胞的增殖[40]。此外，有文献报导CTS可以通过调节PI3K/Akt/mTOR信号，抑制结肠癌CT26细胞的侵袭[41]。在裸鼠异种移植实验中，CTS能够显著抑制小鼠体内异种移植物的生长，其作用机制与抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路有关[42]。以上研究表明PI3K/AKT信号通路可能是CTS抗肿瘤的有效信号通路之一。
3. 隐丹参酮衍生物抗肿瘤活性
CTS虽然具有广谱的抗肿瘤活性，但是其药理作用中等，疏水性强且难吸收，口服生物利用度只有2.1%，这些缺点严重阻碍了其开发和应用[43]。近年来，针对CTS存在的问题，人们尝试对CTS进行结构改造，期望获得生物活性高、水溶性好的化合物。刘航[44]等基于CTS是一种STAT3抑制剂，通过对CTS及其骨架类似物进行修饰，设计合成了CTS衍生物62个，其中新化合物46个，通过报告基因法检测发现有27个新化合物对STAT3转录抑制效果优于CTS，IC50最低0.5976 μmol/L。Wang等基于STAT3的药物设计策略，设计合成了一种亲和力和抑制活性更强的新型CTS衍生物LYW-6，该化合物与STAT3结合解离常数Kd约为6.6μmol/L，能够显著抑制STAT3磷酸化、二聚化、核转位以及转录活性。在细胞水平上，LYW-6能选择性抑制高STAT3活性的结肠癌细胞增殖、迁移，促进凋亡，体内可抑制结肠癌的生长和转移，是一个具有开发前景的抗肿瘤活性化合物[45]。为了改善CTS的水溶性，Xu等合成了几种CTS的钠盐衍生物，结果发现这些衍生物比CTS更易溶解，同时保留了CTS的生物活性，其中钠盐衍生物PTS33可以有效地抑制二氢睾酮DHT诱导AR反式激活和PCa细胞生长[46]。
4. 结论
CTS具有广谱的抗肿瘤活性，该活性与抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，逆转耐药性，诱导自噬等作用相关。除直接作用于肿瘤细胞外，CTS还可以通过增强CD4+T细胞的细胞毒作用、诱导DC细胞成熟和促使巨噬细胞M1型极化，间接杀伤肿瘤细胞。分子机制研究表明，CTS可直接结合STAT3和SHP2，有效调节JAK/STAT3、NF-κB、PI3K/AKT和IGF-1R等信号通路发挥抗肿瘤作用。隐丹参酮特异性抑制STAT3信号通路，而不抑制STAT家族中的其他蛋白，是其一大特点。因为尽管其他天然产物也有抗肿瘤作用，但不是特异性STAT3抑制剂，例如姜黄素，是一种STAT抑制剂，但在治疗24 h后降低了STAT3的表达。虽然CTS表现出良好的药理活性，但水溶性差和生物利用度低等问题限制了其广泛应用。因此，基于靶点STAT3，以CTS作为先导化合物，设计并合成一系列CTS衍生物，有望开发出新型STAT3抑制剂用于癌症治疗。
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[1] LEE W C, GUNTUR A R, LONG F X, et al. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis[J]. Endocr Rev,2017,38(3):255-266. doi: 10.1210/er.2017-00064 [2] TAO H, GE G, LIANG X, et al. ROS signaling cascades: dual regulations for osteoclast and osteoblast[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2020,52(10):1055-1062. doi: 10.1093/abbs/gmaa098 [3] CORNELIUS C, KOVERECH G, CRUPI R, et al. Osteoporosis and alzheimer pathology: Role of cellular stress response and hormetic redox signaling in aging and bone remodeling[J]. Front Pharmacol,2014,5:120. [4] AGHAMIRI V, MIRGHAFOURVAND M, MOHAMMAD-ALIZADEH-CHARANDABI S, et al. The effect of Hop (Humulus lupulus L.) on early menopausal symptoms and hot flashes: a randomized placebo-controlled trial[J]. Complement Ther Clin Pract,2016,23:130-135. doi: 10.1016/j.ctcp.2015.05.001 [5] 夏天爽, 林柳悦, 蒋益萍, 等. 苦味酸类成分蛇麻酮和葎草酮对大鼠成骨细胞和破骨细胞的干预作用[J]. 第二军医大学学报, 2019, 353(01):33-38. [6] SUN X L, ZHANG J B, GUO Y X, et al. Xanthohumol ameliorates memory impairment and reduces the deposition of β-amyloid in APP/PS1 mice via regulating the mTOR/LC3II and Bax/Bcl-2 signalling pathways[J]. J Pharm Pharmacol, 2021, rgab052, Epub ahead of print. [7] 辛海量, 张巧艳. 肾浊新说[J]. 时珍国医国药, 2017, 28(8):1946-1947. [8] 辛海量, 张巧艳. 肾浊本质要素探析[J]. 时珍国医国药, 2017, 28(12):2960-2962. [9] XIA T S, LIN L Y, ZHANG Q Y, et al. Humulus lupulus L. extract prevents ovariectomy-induced osteoporosis in mice and regulates activities of osteoblasts and osteoclasts[J]. Chin J Integr Med,2021,27(1):31-38. doi: 10.1007/s11655-019-2700-z [10] 张乃丹. 基于分子对接策略的熟地黄防治糖尿病性骨质疏松症有效成分及其作用机制研究[D]. 上海: 第二军医大学, 2016. [11] CHATZIRAVDELI V, KATSARAS G N, LAMBROU G I. Gene expression in osteoblasts and osteoclasts under microgravity conditions: a systematic review[J]. Curr Genomics,2019,20(3):184-198. doi: 10.2174/1389202920666190422142053 [12] RUSSO C, LAZZARO V, GAZZARUSO C, et al. Proinsulin C-peptide modulates the expression of ERK1/2, type I collagen and RANKL in human osteoblast-like cells (Saos-2)[J]. Mol Cell Endocrinol,2017,442:134-141. doi: 10.1016/j.mce.2016.12.012 [13] DAMSONGSANG P, CHAIKIAWKEAW D, PHOOLCHAROEN W, et al. Surface-immobilized plant-derived osteopontin as an effective platform to promote osteoblast adhesion and differentiation[J]. Colloids Surfaces B: Biointerfaces,2019,173:816-824. doi: 10.1016/j.colsurfb.2018.10.032 [14] YANG B, LI S F, CHEN Z, et al. Amyloid β peptide promotes bone formation by regulating Wnt/β-catenin signaling and the OPG/RANKL/RANK system[J]. FASEB J,2020,34(3):3583-3593. doi: 10.1096/fj.201901550R [15] ZHAO L, LIU S, WANG Y, et al. Effects of Curculigoside on Memory Impairment and Bone Loss via Anti-Oxidative Character in APP/PS1 Mutated Transgenic Mice[J]. PLoS One,2015,10(7):e0133289. doi: 10.1371/journal.pone.0133289 [16] MANOLAGAS S C. From estrogen-centric to aging and oxidative stress: a revised perspective of the pathogenesis of osteoporosis[J]. Endocr Rev,2010,31(3):266-300. doi: 10.1210/er.2009-0024 [17] JIN W, ZHU X, YAO F, et al. Cytoprotective effect of Fufang Lurong Jiangu capsule against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in bone marrow stromal cell-derived osteoblasts through the Nrf2/HO-1 signaling pathway[J]. Biomed Pharmacother,2020,121:109676. doi: 10.1016/j.biopha.2019.109676 [18] JIAO C L, GAO F, OU L, et al. Tetrahydroxy stilbene glycoside (TSG) antagonizes Aβ-induced hippocampal neuron injury by suppressing mitochondrial dysfunction via Nrf2-dependent HO-1 pathway[J]. Biomedecine Pharmacother,2017,96:222-228. doi: 10.1016/j.biopha.2017.09.134 [19] SOTOLONGO K, GHISO J, ROSTAGNO A. Nrf2 activation through the PI3K/GSK-3 axis protects neuronal cells from Aβ-mediated oxidative and metabolic damage[J]. Alzheimer's Res Ther,2020,12(1):13. doi: 10.1186/s13195-019-0578-9 [20] SIQUEIRA M F, FLOWERS S, BHATTACHARYA R, et al. FOXO1 modulates osteoblast differentiation[J]. Bone,2011,48(5):1043-1051. doi: 10.1016/j.bone.2011.01.019 -
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