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马齿苋（Portulaca oleracea L.）是一种药食两用植物，味酸、性寒，具有清热解毒、凉血消肿之功效。现代药理研究证实其有抗衰老、降血糖、降血脂、抗动脉粥样硬化，以及保肝护肝等方面的药理活性[1-2]。目前对马齿苋保肝护肝的有效成分还不甚了解。本研究进一步明确马齿苋提取物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤具有保护作用，并通过超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术分析马齿苋提取物的主要成分，采用电喷雾电离源正离子模式和负离子模式对色谱流出物进行检测，通过高分辨质谱分析结合相关文献鉴定出苹果酸、柠檬酸、亮氨酸、异亮氨酸、腺苷、琥珀酸、染料木素、酪氨酸、苯丙氨酸等15种主要成分。
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80只ICR雄性小鼠，体重18～20 g。来源：海军军医大学实验动物中心购买于上海斯莱克实验动物有限公司[生产许可SCXK（沪）2017-005，使用许可SYXK（沪）2017-0004]。
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马齿苋干药材（上海雷允上中药饮片厂，产品批号：2012110235）；CCl4溶液、乙醇、NaOH（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；橄榄油（益海嘉里食品营销有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国默克公司）；甲酸（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）；实验用水（屈臣氏蒸馏水）；Agilent 1290 Infinity型超高效液相色谱仪、Agilent 6538 UHD、Accurate-Mass Q-TOF/MS（美国安捷伦公司）。
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马齿苋药材加15倍80%乙醇，煎煮1 h。提取液滤过，滤液减压浓缩至无醇味，加水调节浓度为2 g/ml。以10% NaOH溶液调节pH至中性，记为A液。5000 r/min，离心10 min，上清液记为B液，沉淀记为C液。A、B液分别减压浓缩至半干状态，与C液分别转移至60 ℃真空干燥，粉碎过120目筛，即得马齿苋全草、上清、沉淀提取物。用去离子水分别配制不同浓度的马齿苋提取物混悬液，超声过夜，4 ℃储存，备用。
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ICR雄性小鼠80只，根据体重随机分为8组，分别为对照组、CCl4急性化学性肝损伤模型组（模型组）、全草提取物低剂量(12.5 mg)组（全草低剂量组）、全草提取物高剂量(50 mg)组（全草高剂量组）、上清提取物低剂量(12.5 mg)组（上清低剂量组）、上清提取物高剂量(50 mg)组（上清高剂量组）、沉淀提取物低剂量(12.5 mg)组（沉淀低剂量组）和沉淀提取物高剂量(50 mg)组（沉淀高剂量组）。适应性喂养一周后，对照组和模型组小鼠分别经口灌胃0.5 ml去离子水，3种提取物的低剂量组和高剂量组小鼠分别以0.5 ml对应浓度的马齿苋提取物混悬液连续灌胃7 d，并监测体重。7 d后，模型组、马齿苋提取物干预组小鼠按照3 ml/(kg·BW)分别腹腔注射10% CCl4橄榄油溶液，对照组小鼠注射等量橄榄油。实验期禁食不禁水，16 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，摘眼球取血，将血液2 000 r/min离心15 min得血清，于长海医院检验科检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST），ELISA试剂盒检测血清IL-6。
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首先，检索马齿苋及其相关种属药材化学成分相关的文献，根据文献报道，收集马齿苋中可能的化学成分信息；其次，通过Agilent提供的“Formula-Database-Generator”软件建立马齿苋中已知化学成分的数据库。
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取马齿苋适量，加入5 ml 80%甲醇超声15 min，13000 r/min离心10 min，取上清液供超高效液相色谱仪检测用。
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色谱柱：Waters XSELECTTM HSS T3（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）；流动相：0.1%甲酸（A）和0.1%甲酸乙腈（B）流动相体系。梯度洗脱程序如下：0～2 min，5%B；2～13 min，5%→95%B；13～15 min，95%B；分析时间15 min；流速为0.4 ml/min，进样量为3 μl。
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离子源：电喷雾离子化（ESI）正、负离子模式；雾化气压力：50 psi；干燥气流速：11 L/min；干燥气温度：350 ºC；毛细管电压：4000V（+）/3500V（−）；去簇电压：120 V；Mass扫描范围：m/z 50～1000。
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采用SPSS 20.0统计分析软件处理，结果以均值 ± 标准差（
$ \bar x \pm s $ ）表示，多组间比较采用单向方差分析检验，组间两两比较，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett's T3法，P<0.05为差异有统计学意义。 -
各组小鼠体重均呈上升趋势，各组体重差异无统计学意义（见图1），初步说明马齿苋提取物对小鼠生长没有明显的毒副作用。
图 1 CCl4急性肝损伤模型小鼠7天的体重变化
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由图2可见，与对照组相比，CCl4急性化学性肝损伤模型组血清ALT、AST水平显著升高（P<0.001），说明造模成功。与模型组相比，全草高剂量组小鼠血清AST、ALT水平显著降低（P<0.05，P<0.01）；沉淀高剂量组小鼠血清ALT显著降低（P<0.05），AST水平有降低趋势但不具有统计学意义。
图 2 CCl4急性肝损伤模型各组小鼠7天的肝功情况
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由图3可见，与对照组相比，CCl4急性化学性肝损伤模型组血清IL-6水平显著升高（P<0.01）。与模型组相比，全草高剂量组小鼠血清IL-6水平显著降低（P<0.05），沉淀高剂量组小鼠血清IL-6水平有降低趋势但不具有统计学意义。
图 3 CCl4急性肝损伤模型各组小鼠7天血清中IL-6水平
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取马齿苋样品溶液，按照“1.4.3”项下进样分析，全扫描总离子流图如图4所示。
图 4 马齿苋化学成分的UPLC-Q-TOF/MS总离子流图
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将“Formula-Database-Generator”软件建立的马齿苋已知化学成分的数据库导入“Masshunter Qualitative Analysis”软件系统，依据数据库对马齿苋提取物总离子流质谱图进行鉴定和确证，将检索到的化学成分信息按照保留时间、质荷比、加合离子情况等进行分类整理。并将化合物按其质荷比在原质谱数据中进行反向提取，对提取到的质谱信息进行质量准确度的验证并根据同位素峰比例等信息进行元素组成分析。推测出15种化合物为马齿苋80%乙醇提取物的主要成分，按照保留时间顺序依次为：苹果酸、柠檬酸、亮氨酸、异亮氨酸、腺苷、琥珀酸、染料木素、酪氨酸、苯丙氨酸、佛手苷内酯、金莲花碱、6,7-二羟基香豆素、芳樟醇、金色酰胺醇/橙黄胡椒酰胺、金色酰胺醇酯/咸南藤酰胺乙酸酯（见表1），另外还有多糖、黄酮等化学成分。
表 1 马齿苋提取物UPLC-Q-TOF/MS分析结果
时间
(tR/min)分子式 离子峰归属 质荷比 偏差 化合物 理论值 实测值 0.847 C4H6O5 [M-H]- 133.0142 133.0147 −0.49 苹果酸[3-4] 1.019 C6H8O7 [M-H]- 191.0197 191.0198 −0.62 柠檬酸[3] 1.097 C6H13NO2 [M+H]+ 132.1019 132.1014 3.91 亮氨酸[5] 1.203 C6H13NO2 [M+H]+ 132.1019 132.1015 2.72 异亮氨酸[4] 1.293 C10H13N5O4 [M+H]+ 268.104 268.1047 −2.55 腺苷[6] 1.305 C4H6O4 [M-H]- 117.0193 117.0197 −3.23 琥珀酸[3] 1.555 C15H10O5 [M+NH4]+ 288.0866 288.0867 −0.21 染料木素[7] 2.053 C9H11NO3 [M+NH4]+ 199.1077 199.1074 1.69 酪氨酸[5] 2.168 C9H11NO2 [M+H]+ 166.0863 166.0859 2.03 苯丙氨酸[5] 3.567 C12H8O4 [M+NH4]+ 234.0761 234.0765 −1.81 佛手苷内酯[8] 4.638 C12H13NO3 [M+H]+ 220.0968 220.0967 0.61 金莲花碱[9] 4.929 C9H6O4 [M-H]- 177.0193 177.0192 0.98 6,7-二羟基香豆素[5] 7.301 C10H18O [M+COOH]- 199.034 199.1342 −1.21 芳樟醇[10] 8.646 C25H26N2O3 [M+H]+ 403.2016 403.2029 −3.12 金色酰胺醇/橙黄胡椒酰胺[9] 9.685 C27H28N2O4 [M+H]+ 445.2122 445.2128 −1.34 金色酰胺醇酯/咸南藤酰胺乙酸酯[9] -
马齿苋是一年生肉质草本植物，是常用的药食两用植物，已被列入“中国卫生部药食两用名单”，具有清热解毒、凉血消肿等功效，特别是在保肝抗炎方面具有较好的功效[2]。
CCl4是经典的化学性肝损伤动物模型的肝毒物，可破坏肝细胞膜，从而使胞浆内可溶性酶如ALT、AST等渗入血液中，并最终导致各种类型的肝细胞病变，甚至坏死[11]。正常肝内转氨酶的含量约为血中的100倍，1％的肝特异性细胞坏死即可使血清酶活性增加1倍。因此，转氨酶是肝细胞受损的敏感标志[12]。因而，血清中的ALT、AST水平的高低可以敏感地反映肝脏细胞膜的受损程度。
本研究以CCl4诱导的急性肝损伤小鼠模型为研究对象，考察了马齿苋乙醇提取物的保肝抗炎作用，结果显示，高剂量马齿苋全草提取物可以显著降低CCl4导致的肝损伤和炎症。马齿苋沉淀提取物能够显著降低CCl4诱导的急性肝损伤小鼠血清ALT水平，对血清AST和IL-6水平有降低趋势但不具有统计学意义。马齿苋沉淀提取物对降低CCl4导致的肝损伤和炎症有一定效果，但效果不及全草提取物，说明马齿苋上清提取物可能也含有效成分，与沉淀提取物共同发挥保肝作用。因此，从本研究可以看出，马齿苋沉淀及上清中均存在保肝抗炎的有效成分，且沉淀提取物可能起主要作用，但马齿苋发挥保肝抗炎作用是沉淀与上清提取物中有效成分共同发挥的。中药是世界四大传统医药体系中理论最完整、医疗实践最丰富、疗效最确切的传统医药体系[13]。因为中药的复杂性，中药的药效机制研究一直是个难点。有学者归因于中药功效相关的多成分、多靶点、多环节之间组成的一个相互协同与制约的复杂网络[14]。笔者认为，与马齿苋全草提取物相比，沉淀提取物的抗炎保肝作用较差的原因可能是马齿苋的抗炎保肝作用是通过多成分、多靶点、多环节的相互协同作用实现的，且需维持一定的药物浓度才能显著性的发挥抗炎保肝作用。
为了进一步分析马齿苋抗炎保肝作用的有效成分，本研究通过UPLC-Q-TOF/MS技术对该全草提取物进行分析和鉴定，初步发现约有15种主要化学成分。已研究发现，苹果酸、柠檬酸、琥珀酸为小分子有机酸，具有抗肿瘤、抑菌、抗血栓、抗病毒等作用[15]；亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸为营养增补剂；6,7-二羟基香豆素等化合物是自然界重要的天然有机化合物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种功效[16]。因而，马齿苋提取物能够发挥抗炎护肝作用可能是由以上主要化学成分共同作用的结果，具体的作用机制有待深入研究。
Protective effect of Portulaca oleracea L. extract on acute liver injury induced by carbon tetrachloride in mice and its chemical composition analysis
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摘要:
目的 探究马齿苋乙醇提取物对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用，并对其有效成分进行分析。 方法 将80%乙醇马齿苋提取物经离心、减压蒸馏、真空干燥为全草提取物、上清提取物和沉淀提取物。将80只ICR雄性小鼠随机分为8组：对照组、肝损伤模型组、马齿苋全草提取物低剂量组、高剂量组、马齿苋上清提取物低剂量组、高剂量组、马齿苋沉淀提取物低剂量组、高剂量组。经口灌胃去离子水或3种马齿苋提取物不同剂量混悬液1周后，分别皮下注射橄榄油或CCl4橄榄油溶液，16 h后收集血清，检测小鼠血清ALT、AST、IL-6水平，以评价马齿笕对肝损伤的保护作用。采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术分析马齿苋的有效成分。 结果 与模型组相比，马齿苋全草提取物高剂量组小鼠血清AST、ALT、IL-6水平显著降低；沉淀高剂量组小鼠血清ALT显著降低（P<0.05），IL-6水平有所降低，但不具统计学意义；其他各干预组小鼠血清AST、ALT、IL-6水平没有显著性变化。应用UPLC-Q-TOF/MS法共鉴别出苹果酸、柠檬酸、亮氨酸、异亮氨酸、腺苷、琥珀酸、染料木素、酪氨酸、苯丙氨酸等15种主要成分。 结论 马齿苋乙醇全草提取物对CCl4急性肝损伤小鼠具有保肝抗炎作用，可能是15种有效成分发挥的联合作用。 -
关键词:
- 马齿苋 /
- 提取物 /
- CCl4急性化学性肝损伤 /
- 保护作用
Abstract:Objective To investigate the protective effect of the ethanol extract of Portulaca oleracea L. on acute liver injury induced by carbon tetrachloride in mice, and to analyze its effective components. Methods 80% ethanol purslane extract was centrifuged, vacuum distillated and vacuum dried into whole plant extract, supernatant extract and precipitated extract. Eighty ICR male mice were randomly divided into 8 groups: control group, liver injury model group, whole plant extract low-dose group, high-dose group, supernatant extract low-dose group, high-dose group, precipitation extract low-dose group, and high-dose group. After oral administration of distilled water or three kinds of purslane extract suspensions at different doses for 1 week, olive oil or CCl4 olive oil solution were injected subcutaneously respectively. After 16 hours, serum was collected to detect the levels of ALT, AST and IL-6 to evaluate the protective effect of purslane on acute liver injury. Ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS) was used to analyze the effective components of purslane extract. Results Compared with the model group, the levels of serum AST, ALT and IL-6 in high-dose whole plant extract group were significantly reduced. The serum ALT level of mice in the high-dose precipitation extract group was significantly reduced (P<0.05). The serum IL-6 level was decreased, but there was no significant difference. There were no significant changes in the levels of serum AST, ALT and IL-6 in the other intervention groups. 15 main components such as malic acid, citric acid, leucine, isoleucine, adenosine, succinic acid, genistein, tyrosine and phenylalanine were identified by UPLC-Q-TOF/MS. Conclusion Purslane whole plant ethanol extract has hepatoprotective and anti-inflammatory effects on CCl4 acute liver injury mice, which may be a combined effect of 15 active components. -
Key words:
- purslane /
- extract /
- acute chemical liver injury of CCl4 /
- protection
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随着社会经济发展和饮食结构改变，功能性便秘（FC）发生率逐年攀升，并具有顽固性、复发性的特点，无根治特效药[1]，目前临床上对于便秘的干预措施主要包括药物、按摩、膳食调理等，但都存在依从性低、副作用明显、疗效不可靠等弊端[2]，新型抗便秘产品的研发具有迫切需求。黑蒜是一种发酵大蒜，在高温高湿条件下发酵一定时间制得[3]。黑蒜主要化学成分包括多糖、类黑精、蛋白质、多酚、含硫化合物等[4]，研究表明其具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖[5-9]等作用，近年，黑蒜在通便相关的药食同源产品研发领域应用较多，但关于黑蒜抗便秘作用的研究较少，抗便秘功效成分更不明确，相关产品进一步研发与推广缺乏足够的科学依据。且黑蒜用于抗便秘每日需服用20 g以上[10]，易导致依从性差，难以长期坚持等问题。有研究发现大蒜多糖具有一定抗便秘作用[11]，而大蒜在加工成黑蒜的过程中糖类物质含量可增加数倍[12-13]，可合理推测黑蒜多糖可能具有更显著的抗便秘作用，是黑蒜抗便秘作用的物质基础之一，但目前还没有相关的研究。因此，本文建立复方地芬诺酯（CO.D）诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用，为新型抗便秘产品的研发提供科学依据。
1. 材料与仪器
1.1 实验材料
黑蒜（批号：20231030，上海明可名生物科技有限公司）；乳果糖口服液（规格：667 mg/ml，批号：22110047，北京韩美药品有限公司）；复方地芬诺酯片（2.5 mg/片，批号：210804，仁和堂医药连锁股份有限公司）。
1.2 实验试剂
D-无水葡萄糖（批号：S22J12H137237，源叶生物）；无水乙醇（批号：P2708277，泰坦科技）；生理盐水（批号：230327042，雷根生物）；4%多聚甲醛（批号：HP184401，博光生物）；浓硫酸（批号：
20230420）、 丙酮（批号：20230807 ）、石油醚（批号：20220507 ）均购自国药集团；三氯乙酸（批号：C14990699）、活性炭粉（批号：C14853603）、阿拉伯树胶粉（批号：C15109301）、苯酚（批号：C15031044）均购自麦克林生化；所有水均为超纯水机所制一级水。1.3 实验仪器
鼓风干燥箱DAG-924（满贤经贸）；循环水式多用真空泵SHB-III（明杰仪器）；万分之一天平JA1003（恒平仪器）；电热恒温水浴锅HWS-12（一恒仪器）；高速离心机M18G（创宜生物）；旋转蒸发器RE-52AA（亚荣仪器）；超纯水机Smart-S（和泰仪器）。
1.4 实验动物
SPF级C57雄性小鼠，体重18 ~22 g，许可证号： SCXK（浙）2019-00004，杭州子源实验动物科技有限公司。
2. 方法
2.1 黑蒜多糖的提取
取10 g黑蒜，按下列步骤处理： ①脱脂：剥去外壳，研磨成泥，85%乙醇水溶液（V/V）浸渍，常温静置8 h，抽滤，滤渣用85%乙醇水溶液洗涤2次，置于烘箱60℃挥干至无醇味，充分研磨获得脱脂黑蒜粉。②水提：所得脱脂黑蒜粉用80℃热水浸提1 h，料液比为1∶50，抽滤，滤液减压浓缩至原体积1/2。③脱蛋白：在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸水溶液，充分混匀，4℃静置10 h，离心取上清液。④醇沉：上清液加入无水乙醇，调节乙醇水溶液浓度为80%，充分混匀，4℃静置12 h，离心取沉淀。⑤干燥：挥干有机溶剂，烘箱60℃干燥，去除残留溶剂，得黑蒜多糖干燥粉末。
2.2 多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[14]测定多糖含量。
2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制
精密称取D-无水葡萄糖适量，配置为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别吸取250 μl于离心管中，依次加入6%苯酚溶液150 μl、浓硫酸625 μl，迅速振摇，静置反应30 min，吸取200 μl于96孔板，设置3个复孔，测量490 nm处吸光度。绘制葡萄糖标准曲线，求得回归方程。
2.2.2 样品测定
精密称取适量黑蒜多糖干燥粉末，加入蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，根据酶标仪检测范围进行稀释。吸取250 μl多糖溶液于96孔板中，按照2.2.1项下方法进行测定，计算样品中多糖的含量，进一步计算黑蒜多糖的得率和纯度。
计算公式：黑蒜多糖得率（%）=
$ \dfrac{W2}{W1}\times 100\text{%} $ 黑蒜多糖纯度（%）=
$ \dfrac{C\times V\times D}{W2}\times 100\text{%} $ 式中：
$ W $ 1为黑蒜质量（g）；$ W $ 2为黑蒜多糖粉末质量；$ C $ 为样品中多糖的质量浓度（mg/ml）；$ V $ 为提取溶剂体积（ml）；$ D $ 为样品稀释倍数。2.3 动物实验给药剂量及配置
乳果糖口服液：乳果糖含量为667 mg/ml，正常成人用药量15 ml/d[15]，换算可得小鼠的用药剂量为4 g/（kg·d）。量取乳果糖口服液6 ml，加蒸馏水14 ml，配置成200 mg/ml的乳果糖口服液。
CO.D混悬液：参考贾红慧等[16]研究结果，选用5 mg/kg剂量CO.D造模，模型稳定、灵敏。取CO.D 4片，研磨成细粉，加蒸馏水20 ml，配置成0.5 mg/ml的 CO.D混悬液，使用前需充分混匀。
黑蒜多糖低、中、高剂量溶液：参考胡淼等[17]研究结果，黑蒜多糖低、中、高剂量组剂量分别选用0.25、0.5、1 g/kg。称取0.5、1、2 g黑蒜多糖干燥粉末，分别加蒸馏水20 ml，配置成25、50、100 mg/ml的黑蒜多糖溶液。
墨汁[18]：阿拉伯树胶于蒸馏水中加热至完全溶解，料液比为1∶8。加入5 g活性炭粉末，混合均匀，重复煮沸3次，冷却后定容至100 ml，使用前需充分混匀。
含药墨汁：取适量受试药，加入墨汁，配制成与上述受试药剂量相同的含药墨汁。
2.4 实验动物分组及给药方法
2.4.1 小鼠小肠墨汁推进实验
小鼠60只，适应性饲养1周，正常饮食饮水。给药前按照体重随机分为空白组、模型组、阳性组、黑蒜多糖低、中、高剂量组，每组10只。
按照0.1 ml/10 g灌胃给药。①给药：空白组和模型组小鼠给予蒸馏水，阳性组和黑蒜多糖组小鼠分别给予乳果糖口服液和黑蒜多糖溶液。1次/d，连续给药1周，观察并记录小鼠体重变化及一般状态。②造模：末次给药后禁食12 h，自由饮水，空白组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组小鼠灌胃CO.D溶液。③给药：30 min后空白组、模型组灌胃墨汁，其它组小鼠灌胃相应含药墨汁。25 min后处死，剖取小鼠小肠（幽门至盲肠上端），平铺成直线，测量小肠总长度和墨汁推进距离，避免拉伸小肠，影响实验结果。
计算公式：小肠墨汁推进率（%）=墨汁推进距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%
2.4.2 小鼠排便实验
分组、给药剂量及方法同“2.4.1”项下实验方法，给药后，记录每只小鼠首次排出黑便的时间、6 h内排出黑便的数量及重量，并进行粪便含水量测定，同时观察粪便性状。含水量测定方法为：将小鼠新鲜粪便置于提前干燥、称重的容器中，称重，于烘箱中干燥至重量不再变化，计算粪便含水量。
计算公式：粪便含水量（%）=
$ \dfrac{M1-M2}{M1}\times 100\text{%} $ 式中：M1为干燥前粪便质量（g），M2为干燥后粪便质量（g）。
2.5 统计学方法
采用SPSS 24统计软件进行数据分析，以均数±标准差（
$ \bar{X} $ ±S）表示计量资料。两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。3. 结果与分析
3.1 黑蒜多糖的得率和纯度
精密称量所得黑蒜多糖干燥粉末质量为0.832 g，代入公式计算可得黑蒜多糖的得率为8.32%。以葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，可得回归方程为Y=
2.2829 X+0.0764 ，相关系数r=0.9982 ，线性关系较好，代入回归方程计算可得黑蒜多糖的纯度为58.23%。3.2 黑蒜多糖对小鼠体重的影响
从表1可以看出，与空白组相比，各组小鼠体重均正常增长，无显著性差异，表明黑蒜多糖不会对正常小鼠体重产生影响。实验过程中，各组小鼠饮食正常，状态良好，无腹泻等不良反应，为后续实验提供前提保证。
表 1 黑蒜多糖对小鼠体重的影响组别 小鼠小肠墨汁推进实验 排便实验 初始体重
（m/g）最终体重
（m/g）初始体重
（m/g）最终体重
(m/g)空白组 21.28±1.15 22.23±1.19 21.80±1.02 22.90±0.61 模型组 21.20±1.36 22.24±1.22 21.58±1.00 22.64±0.84 阳性组 21.17±1.18 22.31±1.28 21.42±1.01 22.81±0.91 黑蒜多糖
低剂量组21.44±1.32 22.38±1.54 21.98±1.20 23.02±1.20 黑蒜多糖
中剂量组21.06±1.13 22.16±0.77 21.59±1.10 22.38±1.08 黑蒜多糖
高剂量组21.42±1.15 22.54±1.26 21.79±1.29 22.85±0.98 3.3 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响
从表2可以看出，与空白组相比，模型组墨汁推进率极显著减小，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠墨汁推进率均显著增大，分别增大了24.75%、56.95%、95.25%，表明黑蒜多糖对FC模型小鼠小肠运动具有促进作用，且成剂量依赖性。
表 2 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响组别 碳末推进距离
（l/cm）小肠总长度
（l/cm）墨汁推进率
（%）空白组 28.86±3.25 34.87±1.60 82.90±9.97 模型组 9.60±0.73*** 34.09±2.31 29.50±1.35*** 阳性组 26.94±3.55### 34.15±1.60 79.00±9.92### 黑蒜多糖
低剂量组12.58±1.15### 34.35±1.67 36.80±4.42# 黑蒜多糖
中剂量组16.01±2.06### 34.48±3.18 46.30±4.19### 黑蒜多糖
高剂量组19.95±1.60### 34.66±1.96 57.60±4.06### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01， ###P<0.001，与模型组比较。 3.4 黑蒜多糖对小鼠排便的影响
从表3可看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排出黑便时间极显著延长，6 h排便粒数显著减少，6 h排便重量极显著减少，粪便含水量极显著降低，粪便呈球形或短椭圆形，部分串联，质地干硬，颜色普遍偏黑，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠首次排出黑便时间均极显著缩短，分别缩短了42.55%、44.99%、45.81%；6 h排便重量显著增加，分别增加了68.42%、78.95%、78.95%；粪便含水量极显著增大，分别增大了29.96%、32.78%和35.82%，粪便呈长椭圆形，质地较软，颜色为深棕色，无腹泻现象；除黑蒜多糖低剂量组外，中、高剂量组小鼠6 h排便粒数有统计学差异，分别增加了31.45%和32.52%。表明黑蒜多糖可能通过增大FC模型小鼠粪便含水量发挥促排便作用，各剂量组间效果差异不明显。
表 3 黑蒜多糖对小鼠排便及粪便含水量的影响组别 首黑便时间
（t/min）6 h排便数
（粒）6 h排便湿重
（m/g）6 h排便干重
（m/g）含水量
（%）空白组 111.50±8.98 16.50±3.51 0.46±0.10 0.22±0.04 52.16±2.53 模型组 241.50±19.54*** 11.13±2.75** 0.19±0.02*** 0.13±0.01*** 32.58±2.35*** 阳性组 121.50±110.81### 15.13±4.09# 0.41±0.12### 0.20±0.06## 50.06±1.83### 黑蒜多糖低剂量组 138.75±10.79### 13.75±2.71 0.32±0.08## 0.19±0.42# 42.34±2.27### 黑蒜多糖中剂量组 132.88±8.34### 14.63±3.66# 0.34±0.10## 0.19±0.05## 43.26±2.68### 黑蒜多糖高剂量组 130.88±9.09### 14.75±3.73# 0.34±0.12## 0.19±0.05## 44.25±6.72### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较。 4. 讨论
CO.D是一种止泻药，可通过抑制肠道平滑肌上的肠黏膜感受器抑制肠道运动，减慢排便进程，减少排便次数，同时肠内容物与肠粘膜接触时间延长，可促进肠内容物水分的重吸收，降低粪便含水量，是常用的FC小鼠模型造模药[19]。因此，本研究建立CO.D诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用。实验结果表明，黑蒜多糖可显著促进CO.D诱导的FC模型小鼠小肠蠕动，缩短排便时间，增加粪便含水量，从而发挥抗便秘作用。有研究显示成人每日服用约2 g黑蒜多糖便可达到较好疗效，用量仅为黑蒜的1/10[10]。给药期间小鼠状态良好、体重正常，未产生腹泻等副作用。因此，黑蒜多糖用于FC治疗可有效规避依从性差、副作用明显、疗效不可靠等弊端，前景广阔。此外，有相关研究发现，采用CO.D 10 mg/kg和15 mg/kg灌胃造模（大鼠）都存在停药后恢复的情况[20]，提示我们使用CO.D进行慢性便秘造模，在造模成功后的治疗给药阶段也需要持续用药，以维持药效。目前该便秘模型的建立没有统一标准，后续可对造模时间、造模剂量进行优化，为更深入的黑蒜多糖抗便秘机制研究提供基础。
FC是典型的胃肠动力障碍性疾病，现代研究普遍认为，其发病机制主要与卡哈尔间质细胞（ICCs）数量、功能以及分布异常、肠神经递质水平异常、水通道蛋白表达异常、氧化应激指标失衡、肠道菌群紊乱等有关[21-22]。大蒜多糖主要为果聚糖，占干重的65%，在发酵生成黑蒜的过程中，果聚糖因高温作用大量降解为低聚果糖（FOS）、果糖等小分子糖[23]。FOS在国际营养学界被称作“具有优良难消化性的水溶性膳食纤维”，还是典型的“超强双歧因子”。因其无法被肠道吸收，可被双歧杆菌等益生菌分解利用，短时间内促进双歧杆菌增殖10~100倍，分解生成的有机酸，可有效调节肠道pH，刺激肠道蠕动，促进排便[24]。双歧杆菌还可抑制有害肠道病菌生长、抵抗病原菌感染、产生维生素并促进矿物质吸收以维持肠道健康，有研究表明人体双歧杆菌含量随年龄增长逐渐减少，是老年人易发生便秘的主要原因[25]。因此，需要进一步明确黑蒜多糖的单糖组成、相对分子质量以及结构，为后续抗便秘机制研究提供依据。此外，便秘成因复杂，可结合具体的证型如脾虚、血虚、阳虚、津亏等便秘模型进一步探究黑蒜多糖抗便秘作用的有效性。
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图 2 CCl4急性肝损伤模型各组小鼠7天的肝功情况
A.AST的变化情况；B.ALT的变化情况***P<0.001，与对照组比较；#P<0.05、##P<0.01，与模型组比较
表 1 马齿苋提取物UPLC-Q-TOF/MS分析结果
时间
(tR/min)分子式 离子峰归属 质荷比 偏差 化合物 理论值 实测值 0.847 C4H6O5 [M-H]- 133.0142 133.0147 −0.49 苹果酸[3-4] 1.019 C6H8O7 [M-H]- 191.0197 191.0198 −0.62 柠檬酸[3] 1.097 C6H13NO2 [M+H]+ 132.1019 132.1014 3.91 亮氨酸[5] 1.203 C6H13NO2 [M+H]+ 132.1019 132.1015 2.72 异亮氨酸[4] 1.293 C10H13N5O4 [M+H]+ 268.104 268.1047 −2.55 腺苷[6] 1.305 C4H6O4 [M-H]- 117.0193 117.0197 −3.23 琥珀酸[3] 1.555 C15H10O5 [M+NH4]+ 288.0866 288.0867 −0.21 染料木素[7] 2.053 C9H11NO3 [M+NH4]+ 199.1077 199.1074 1.69 酪氨酸[5] 2.168 C9H11NO2 [M+H]+ 166.0863 166.0859 2.03 苯丙氨酸[5] 3.567 C12H8O4 [M+NH4]+ 234.0761 234.0765 −1.81 佛手苷内酯[8] 4.638 C12H13NO3 [M+H]+ 220.0968 220.0967 0.61 金莲花碱[9] 4.929 C9H6O4 [M-H]- 177.0193 177.0192 0.98 6,7-二羟基香豆素[5] 7.301 C10H18O [M+COOH]- 199.034 199.1342 −1.21 芳樟醇[10] 8.646 C25H26N2O3 [M+H]+ 403.2016 403.2029 −3.12 金色酰胺醇/橙黄胡椒酰胺[9] 9.685 C27H28N2O4 [M+H]+ 445.2122 445.2128 −1.34 金色酰胺醇酯/咸南藤酰胺乙酸酯[9] 
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