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氟马西尼（flumazenil，FMZ）作为中枢苯二氮䓬受体（CBZR）拮抗剂，具有高度特异性和选择性，通过拮抗苯二氮䓬类药物与其受体的结合，用于逆转其所致的中枢镇静作用[1]。11C-氟马西尼（11C-flumazenil，11C-FMZ）可通过PET/CT显像定量分析CBZR与γ氨基丁酸（GABA）受体、氯离子通道偶联形成的复合受体GABA/CBZR，用于癫痫病灶及遗传性舞蹈病的检查[2]。但是11C的半衰期只有20.38 min，制备结束后如不及时注射入受检者体内，每摩尔(mol)药液的放射性活度，即比活度会很快降低。11C-FMZ在体内经肝酶水解，部分转变为无CBZR拮抗活性的羧酸代谢物[3]，见图1。不同比活度的11C-FMZ在体内代谢有无差异，未见文献报告。本研究通过测定不同比活度的11C-FMZ在体内的代谢变化，拟为11C-FMZ的临床合理应用提供一定依据。
图 1 11C-FMZ及其水解产物
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Minitrace回旋加速器、TRACELab FXc放射性药物合成系统（美国GE公司）；HPLC半制备分析系统、紫外检测器、Sep-Pak C18层析柱（美国Waters公司）；LB508型放射性检测器（德国Berthold公司）；CRC-15R型活度检测器（美国Capintec公司）；Millex-GS无菌滤膜（美国Capintec公司）；Wallac 1470 WIZARD γ计数器（芬兰PE公司），WD-9405B型水平摇床（北京沃德生物医学仪器公司），高速低温离心机（美国Therma公司）。
去甲基氟马西尼、标准品氟马西尼(江苏华益科技有限公司)；碘（美国Sigma-Aldrich公司）；氢气、氦气、氮气、1%氧-氮混合气、盐酸、磷酸、无水乙醇、无水乙腈、二甲基甲酰胺（DMF）、氢化钠（NaH）、0.9%氯化钠（中国医药集团上海化学试剂公司）；三氟磺酸银粉（Ag-Triflate，自制）。商品化溶剂皆为市售分析纯或化学纯。
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选择2019年5月至10月北部战区总医院核医学科10名健康受试者，其中，男性5名，女性5名，平均年龄（41.7±4.7）岁，平均体重（69.3±6.8）kg。所有受试者均进行系统的体格检查，确认无基础疾病且试验前1个月内无药物服用史，并签署了知情同意书。
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首先使用回旋加速器以1% O2/N2为原料，通过14N（p,α）11C核反应生产11C-CO2，传输至药物合成系统，并以图2所示，合成路线转化为11C-三氟甲基磺酰基甲烷（11C-Triflate-CH3）[4]。将0.5 mg去甲基氟马西尼和1 mg NaH溶于0.4 ml DMF于反应池中与11C-Triflate-CH3在0 ℃反应5 min，升至室温并加入0.5 mol/L HCl中和。混合物进入HPLC进行分离纯化，分离柱：Nucleosil 100-5 C18，250 mm×10 mm，流动相：含0.01 mol/L磷酸的22%乙腈溶液，检测波长254 nm，流速4 ml/min。收集放射性峰组分，用Sep-Pak C18柱再次分离纯化，最后通过0.22 μm的无菌滤膜过滤得到产物11C-FMZ[5]，如图3所示。产品依据《中国药典》（2015年版）进行无菌检测和内毒素含量检测。
图 2 11C-Triflate-CH3合成路线
图 3 11C-FMZ合成路线
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首先，在静息状态下通过肘静脉为10名受试者注射11C-FMZ 3 ml，经活度检测器测量，平均放射性活度为（10.5±2.9）mCi（1 Ci=3.7×1010 Bq），放射性比活度以单位物质的量所含放射性活度作为定量依据，平均比活度为（268.3±57.2）×103Ci/mol；2 h后，再次注射11C-FMZ 3 ml，平均活度为（10.6±2.8）mCi，此时药液已放置5～6个半衰期，平均比活度降为（57.8±11.4）×103Ci/mol。两次注射药物后均需静卧60 min，分别在1、2、3、5、10、15、20、30、40、60 min时于对侧肘静脉抽取血样。
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取500 μl血样于试管中，加入500 μl缓冲溶液（0.1 mol/L硼酸，0.05 mol/L氯化钾，0.1 mol/L氢氧化钠）调节pH至11，再加入1 ml氯仿，于水平摇床混匀5 min，再以4 000 r/min离心5 min。取氯仿相和水相各200 μl，使用γ计数器分别测定两相1 min的放射性计数（counts per minute，cpm）。
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放射性计数首先需经衰变公式（公式1）校正以抵消血浆预处理的耗时所致的放射性衰减，再计算各血样的百分注射剂量率(%ID/L,公式2）及不同比活度下各时间点11C-FMZ羧酸代谢物的占比（公式3）。使用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以（
$ \stackrel{-}{x}\pm s $ ）表示，采用配对样本均数t检验，P<0.05为差异有统计学意义。$$ {I}_{0}=\frac{I}{{e}^{-\lambda t}} $$ (公式1) I0：抽血时的cpm，I：测量时的cpm，t：抽血与测量的时间差 (min)，T：11C半衰期20.38 min。
首先计算t/T值，从“衰变计算表”[6]中查出比值对应的e-λt值。
$$ {\text{百分注射剂量率}}\left( {{\rm{\% ID}}/{\rm{L}}} \right) = \frac{{{\text{血浆的放射性计数}}\left( {{\rm{cpm}}} \right)}}{{{\text{血浆体积}}\left( {\rm{L}} \right)}} $$ (公式2) $$\begin{split} &{\rm{{\text{羧酸代谢物的占比}}}}\left( {\rm{\% }} \right) =\\ & \frac{{{\text{羧酸代谢物的}}{\rm{\% ID}}/{\rm{L}}}}{{{}^{11}{\rm{C}} - {\rm{FMZ}}{\text{的}}\% {\rm{ID}}/{\rm{L}} + {\text{羧酸代谢物的}}{\rm{\% ID}}/{\rm{L}}}} \end{split}$$ (公式3) -
11C-FMZ的百分注射剂量率随时间呈指数下降，羧酸代谢物则先升后降并在10 min后开始超过11C-FMZ，如表1所示。羧酸代谢物的百分占比随时间延长而逐步增加，于15 min后基本趋于稳定，且低比活度组的百分占比明显高于高比活度组，从统计学结果可以看到，两组数据在15～60 min的区间存在显著统计学差异（P<0.05），如表2所示。
表 1 不同比活度11C-FMZ注射后在不同时间的百分注射剂量率（%ID/L）
测定成分 时间(t/min) 1 2 3 4 5 10 15 20 30 40 60 11C-FMZ① 9.76±4.80 6.00±1.42 3.30±0.60 2.77±0.39 2.25±0.33 1.95±0.24 1.55±0.15 1.28±0.18 1.09±0.14 0.98±0.15 0.78±0.10 羧酸代谢物① 0.04±0.04 0.19±0.10 0.44±0.13 0.51±0.14 0.67±0.13 1.88±0.24 2.00±0.33 1.73±0.28 1.50±0.28 1.59±0.20 1.22±0.22 11C-FMZ② 13.84±4.67 6.10±1.31 3.27±0.49 3.10±0.36 2.66±0.37 1.97±0.33 1.42±0.13 1.23±0.15 1.11±0.06 0.67±0.13 0.45±0.07 羧酸代谢物② 0.15±0.11 0.28±0.08 0.50±0.17 0.55±0.29 0.98±0.27 2.22±0.42 2.36±0.44 2.39±0.34 1.90±0.41 1.39±0.25 0.98±0.14 注：①表示高比活度（268.3±57.2）×103 Ci/mol注射后的剂量率；②表示低比活度（57.8±11.4）×103Ci/mol注射后的剂量率。 表 2 不同比活度11C-FMZ的羧酸代谢物在不同时间百分注射剂量率的占比（%）
11C-FMZ羧酸代谢物 时间(t/min) 1 2 3 4 5 10 15 20 30 40 60 高比活度 0.54±0.54 3.32±1.89 12.04±3.61 15.58±4.25 23.11±4.92 48.98±4.89 56.11±4.68 57.36±5.63 57.60±3.45 61.92±4.51 60.85±5.39 低比活度 1.12±0.70 4.53±1.69 13.48±4.94 14.64±6.01 27.04±7.81 52.90±5.81 62.04±4.69* 65.85±5.35* 62.54±5.75* 67.26±4.88* 68.26±4.47* *P<0.05,与高比活度组比较。 -
本研究使用氯仿作为11C-FMZ及其羧酸代谢物的分离试剂，对11C-FMZ的提取效率可达100%，而代谢物可完全保持在水相中。相关研究中，TLC没有检测到除羧酸代谢产物以外的其他放射性代谢物[7]，保证了该方法对放射性比活度测定的准确性。
Debruyne等[8]研究了进食对11C-FMZ体内代谢的影响，并观察到进食后的代谢率更高，并认为是进食导致肝脏血流增加，从而导致肝脏提取量高的药物代谢增加。由于11C-FMZ主要通过肝脏代谢从体内清除，仅0.2%的给药剂量在尿中以原形排出[9]，因此在PET研究中，应控制饮食条件。
每升血浆中所含的标记药物的百分比与之前的某些定量研究结果基本一致。Samson等[10]和Shinotoh等[11]对高放射性比活度研究的结果分别为10 min时（2.4±0.9）和（3.7±1.6）%ID/L，20 min时（2.1±0.4）和（3.5±1.4）% ID/L。但二者均缺少低放射性比活度及羧酸代谢物的进一步研究。本研究中血浆的百分注射剂量率在注射后10 min左右出现上升，与之前相关研究结果相似[11-13]，这可能与标记的羧酸代谢物的产生有关。Klumpers等认为原因是药物在分布阶段暴露于酯酶的某种首过效应，这种酯酶在肝脏、肾脏和大脑中大量存在且具有非常广泛的底物特异性[14]。在狒狒身上进行的相关研究没有观察到该现象[8]，这种差异是由于在该物种中羧酸代谢物的标记分数较低。本研究中的高、低比活度对应代谢物的占比分别为61%和68%，而狒狒仅为45%。
综上所述，放射性比活度不同的11C-FMZ注射后的代谢率存在明显差异，在PET相关研究中应尽量避免对比活度差异过大的同一批受试者进行试验，临床应用时同一患者在复查时所采用的比活度也需尽量与初诊时一致，以获得最佳的图像对比价值。
The metabolic analysis of 11C-flumazenil in different specific radioactivity
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摘要:
目的 通过测定11C-氟马西尼（11C-flumazenil，11C-FMZ）在体内主要代谢物的百分占比，分析不同比活度11C-FMZ的代谢差异。 方法 选取2019年5月至10月10名受试者，其中，男性5名，女性5名，平均年龄（41.7±4.7）岁，平均体重（69.3±6.8）kg。先后注射高低两种比活度（268.3±57.2）×103和(57.8±11.4)×103Ci/mol的11C-FMZ，并分别测定注射后1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、60 min时血浆中11C-FMZ及其代谢物的百分注射剂量率，使用配对样本均数t检验计算并对比两组代谢物的百分占比。 结果 代谢物的百分占比随时间逐步增加，于15 min后基本趋于稳定，且低比活度组的百分占比明显高于高比活度组，在15～60 min的区间存在显著统计学差异（P<0.05）。 结论 不同比活度的11C-FMZ注射后的代谢率存在明显差异，临床应用时应尽量避免比活度差异过大。 Abstract:Objective To analyze the metabolic differences of 11C-flumazenil (11C-FMZ) with different specific radioactivity by detecting the percentage proportion of the main metabolites in vivo. Methods 5 male and 5 female volunteers with average age of (41.7±4.7) years and weight of (69.3±6.8) kg were selected from May to October 2019. 11C-FMZ with high and low specific radioactivity (268.3±57.2)×103 and (57.8±11.4)×103 Ci/mol was injected successively. The percentage of injected dose/liter of 11C-FMZ and its metabolites in the plasma at 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 and 60 min after the injection was measured. Paired sample mean t test was used to calculate and compare the percentage of metabolites in the two groups. Results The percentage proportion of metabolites increased gradually with time, and reached the stable level after 15 min. The percentage proportion of low specific radioactivity group was higher than that of high specific radioactivity group with a significant statistical difference between 15 min and 60 min (P<0.05). Conclusion The metabolic rate of 11C-FMZ with different specific radioactivity was significantly different after injection and the specific radioactivity difference should be avoided if possible in clinical application. -
Key words:
- 11C-flumazenil /
- carboxylic acid metabolites /
- specific radioactivity
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0. 前言
肥胖是一种慢性代谢性疾病，是指由于能量摄入超过消耗，导致体内脂肪积聚过多或分布异常而造成体重增加的一种疾病。肥胖会提高 2 型糖尿病、高血压、血脂异常、心血管疾病和某些癌症的发病率[1-3]，降低生活质量并增加死亡风险。减肥手术是最有效的减肥方法[4]，但手术有潜在的风险和限制，且无法满足全球范围内患者的医疗需求。改善饮食结构、生活方式以及增加身体活动等短期行为干预也不足以达成长期减肥的目的[5]。因此，药物治疗是中、重度肥胖患者以及有并发症的轻度肥胖患者的首要治疗选择[6]。
多年来，减肥药物有着坎坷曲折的研发历程，获批数量有限且许多已经上市的药物最终因心血管问题等不良反应而撤市，如盐酸氯卡色林（5-羟色胺2C受体激动剂）、西布曲明（抑制去甲肾上腺素和5-羟色胺再摄取）等。因此，全球各大药物监管机构对减肥药物的批准一直非常严格。目前，全球共有8种上市的减肥药物，包括赛利司他（脂肪酶抑制剂）、奥利司他（脂肪酶抑制剂）、复方芬特明-托吡酯（肾上腺素受体激动剂与α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体拮抗剂）、复方纳曲酮-安非他酮（肾上腺素吸收抑制剂与多巴胺摄取抑制剂）、二甲双胍（单磷酸腺苷活化蛋白激酶激动剂）、苄非他明（肾上腺素受体激动剂）以及最新批准的利拉鲁肽和司美格鲁肽（GLP-1受体激动剂）。然而，这些上市减肥药物的耐受性和安全性也受到挑战，如奥利司他会导致严重的脂肪泻；利拉鲁肽价格昂贵，存在恶心等胃肠道反应，不易推广。匮乏的减肥药物市场亟需基于新靶点的全新减肥药物以应对肥胖日益严峻的发病形势。
ORM（Orosomucoid），也称为α1酸性糖蛋白（AGP），是肝脏急性期反应蛋白[7]。ORM在人体中有2种亚型（ORM1和ORM2），小鼠中有3个亚型（ORM1、ORM2和ORM3），大鼠中仅有1种型。在人和小鼠体内，ORM1的组成水平远高于ORM2（5倍），并且只有ORM1可以被急性期刺激诱导。ORM具有转运药物、调节免疫、维持毛细血管屏障等功能[8]。团队前期研究发现，ORM具有能量代谢的调节作用，循环中的ORM可以作用于下丘脑的瘦素受体，激活JAK2-STAT3通路，抑制摄食、降低体重、改善胰岛素抵抗[9]。本团队进一步以ORM为靶点，筛选到了一个靶向上调内源性ORM的全新小分子化合物HMS-01，在瘦素缺陷的ob/ob肥胖小鼠和高脂喂食的肥胖小鼠上，均展示了良好的减肥效果，在国家重大新药创制资助下，已经进入到临床前研究阶段。这些研究均提示，ORM是一个治疗肥胖的全新潜在靶点[9], 靶向上调内源性ORM的小分子有可能发展为新型减肥药物。
然而，新的减肥药物研发面临高投入、低回报的困境，传统新药研发需要消耗10~15年的时间，以及约25亿美元的投入，而达到Ⅲ期临床试验最后阶段的药物中有 50% 最终无法被批准上市[10]，每一次失败都会消耗大量的时间与资源。药物重定位是一种药物发现和开发的策略，旨在重新评估已经开发或研究的药物，以寻找其在新的疾病领域或治疗应用中的潜在价值。该策略的目的是最大化已有药物的利用，降低新药开发的时间和成本。本研究利用基因重组技术构建了含有ORM1启动子上游2 000个碱基对序列的荧光素酶报告基因，由于ORM主要由肝脏合成，通过血液分泌至全身发挥作用，于是选用AML12小鼠正常肝细胞构建了稳定表达LV-ORM1 启动子-LUC-PURO的细胞株，从而建立了一个以ORM为靶点的药物筛选平台和评价体系，用于高通量筛选上市药物库中靶向ORM的药物，为药物重定位发现潜在减肥药物奠定基础。
1. 材料和方法
1.1 细胞及载体
AML12小鼠正常肝细胞、HEK-293T上皮细胞、载体pGL4.20[luc2/Puro] 与pHBLV-CMV-MCS-EF1-puro、慢病毒包装辅助质粒pMD2.G和psPAX2均为实验室保存；DH5α感受态细胞（天根生化科技有限公司）；ORM1 启动子基因序列来自NCBI数据库（NC_000070.7）。
1.2 主要仪器
Veriti™ 96 孔快速热循环仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；移液器、低温高速台式离心机（EPPENDORF公司，德国）；电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；琼脂糖凝胶电泳仪、多功能水平电泳槽（上海天能科技有限公司）；电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；倒置生物显微镜（重庆光电仪器总公司）；全波长多功能酶标仪（BMG，德国）。
1.3 主要试剂
PCR引物和基因合成（生工生物工程股份有限公司）；RNA提取试剂盒RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；限制性内切酶KpnI、限制性内切酶Hind Ⅲ、限制性内切酶AgeI、限制性内切酶ApaI、限制性内切酶ClaI、限制性内切酶BamHI、转染试剂Lipofectamine 3000试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；高保真聚合酶phanta Max-Super-Fidlity DNA polymerase（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；PCR试剂盒2X Pro Taq 预混液、反转录试剂盒Evo M-MLV 反转录试剂预混液、SYBR Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；琼脂糖凝胶 DNA 纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司）；HB-infusionTM 无缝克隆试剂盒（汉恒生物科技有限公司）；转染试剂polybrene（Sigma，美国）；Firefly-Glo萤光素酶报告基因检测试剂盒（大连美仑生物技术有限公司）；FDA 上市药物库（陶术生物科技有限公司）；测序由赛业生物科技有限公司完成。
1.4 基因组RNA提取
提取小鼠新鲜的肝组织，使用RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，用作PCR模板，保存于−20 ℃冰箱。
1.5 ORM1 启动子目的基因的获得和扩增
根据同源重组引物设计原则和参考小鼠ORM1（NC_000070.7）基因组序列设计引物（选取起始位点上游2 000个碱基对），采用同源重组法设计引物，上游引物加入KpnI酶切位点，下游引物加入Hind Ⅲ酶切位点，引物序列见表1。产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因。
表 1 ORM1 启动子基因引物序列引物名称 引物序列（5′—3′） ORM1-F GGGGTACCGTTCTCAGCATGTTGCATAAAT ORM1-R CCAAGCTTGCTGAGGGCACTCAGAGC 注：F: 正向引物; R: 反向引物。 1.6 报告基因质粒pGL4.20-ORM1 启动子的构建及扩增
将PCR产物与载体质粒pGL4.20 [luc2 Puro]（插入位点选择AgeI与ApaI）于37 ℃双酶切5 h，用同源重组酶将目的片段与载体质粒连接。使用DH5α感受态细胞将重组质粒进行转化后，接种于含有嘌呤霉素抗性的固体平板，用涂布器将重组质粒涂抹均匀，倒置37 ℃恒温箱培养12～16 h。将筛选出来的阳性克隆进行测序，随后进行菌液扩增和质粒抽提纯化。对提取的质粒进行浓度检测和A260/280检测，把质粒保存于−20 ℃冰箱。构建成功的重组载体命名为 pGL4.20-ORM1 启动子。根据Lipofectamine 3000试剂盒说明书，分别将pGL4.20-ORM1 启动子和pGL4.20转染至AML12小鼠正常肝细胞中，使用地塞米松（DXMS）来验证报告基因的有效性和可行性。
1.7 慢病毒表达载体LV-ORM1 启动子-LUC-PURO的构建及扩增
以pGL4.20-ORM1 启动子重组质粒为模板，设计引物，引物序列见表2。产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因。
表 2 LV-ORM1 启动子-LUC-PURO基因引物序列引物名称 引物序列（5′—3′） LV-ORM1
启动子-LUC-PURO-FGGACAGCAGAGATCCAGTTTATCGATGTTCTCAGCATGTTGCATAAATT LV-ORM1
启动子-LUC-PURO-RGAGCGATCGCAGATCCTTAGGATCCTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTT 注：F: 正向引物; R: 反向引物。 将PCR产物与载体质粒pHBLV-CMV-MCS-EF1-PURO（插入位点选择ClaI与BamHI）于37 ℃双酶切5 h，用同源重组酶将目的片段与载体质粒连接。使用DH5α感受态细胞将重组质粒进行转化后，接种于含有嘌呤霉素抗性的固体平板，用涂布器将重组质粒涂抹均匀，倒置37 ℃恒温箱培养12～16 h。将筛选出来的阳性克隆，送赛业生物科技有限公司进行测序。测序成功之后，进行菌液扩增和质粒抽提纯化。对提取的质粒进行浓度检测和A260/280检测，把质粒保存于−20 ℃冰箱。构建成功的重组载体命名为LV-ORM1 启动子-LUC-PURO。同样方法构建LV-LUC-PURO作为对照载体。
1.8 慢病毒包装及浓缩纯化及滴度检测
1.8.1 包装
提前传代HEK-293T细胞用于转染，将慢病毒包装辅助质粒pMD2.G 10 μg、psPAX2 5 μg和LV-ORM1 启动子-LUC-PURO 10 μg以及转染试剂75 µl混匀后静置，在室温下温育15 min后缓慢滴加至293T细胞中，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。转染后16 h更换含10 % 胎牛血清 FBS的新鲜完全培养基。转染后 48 h和72 h，分别收集两次病毒上清液（48 h收集后置换新鲜完全培养基），将两次收集的上清液混合，进行离心浓缩和病毒管分装，−80°C冰箱保存。
1.8.2 病毒滴度检测
将生长状态良好的HEK-293T细胞消化计数后稀释至 1×105个/ml, 加入96孔板，100 µl/孔，为每个病毒准备6个孔。放入37°C 、5% CO2 培养箱中培养。将病毒进行3倍梯度稀释，共6个稀释度，接种于293T细胞，继续培养48 h后，在荧光显微镜下观察结果。在观察结果前6 h需更换新鲜10% FBS完全培养基，从孔中吸出80 µl培养基，然后加入80 µl新鲜10 % FBS完全培养基，放入37°C、5% CO2 培养箱中培养。6 h后荧光显微镜下观察结果，荧光或活细胞百分比在10%~50% 的孔计算病毒滴度。目的病毒命名为LV-ORM1 启动子-LUC-PURO。同样方法，阴性对照病毒命名为LV-LUC-PURO。
1.9 LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO稳转细胞株的筛选及建立
将AML12小鼠正常肝细胞在含有10% FBS、1% ITS（10 µg/ml胰岛素+5.5 µg/µl转铁蛋白+5 ng/ml硒）、1% 双抗以及40 ng/ml DXMS的DMEM 培养基，于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。AML12细胞在10 cm培养皿中细胞长满以后，用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集细胞后稀释成密度为1.5×105个/ml的细胞悬液，接种于6孔板，每孔2 ml，使得第2天细胞的融合率在60% 左右，利于感染。设置实验组LV-ORM1 启动子-LUC-PURO和阴性对照组LV-LUC-PURO，为促进病毒的感染效率，首先，感染时弃原有培养基，添加含5% FBS的新鲜培养液2 ml，其次，添加助感染试剂polybrene，使其最终浓度为7 μg/ml。设置2个（10/20）感染复数（MOI）组，感染24 h后换新鲜完全培养基。在感染48 h后，观察慢病毒颗粒感染效率，倒置荧光显微镜下观察荧光比例以确定最佳感染效率，最终选定MOI=20的分组进行后续实验。
待细胞融合率达60% 时，用嘌呤毒素（0.8 μg/ml）浓度处理48 h，然后换新鲜的嘌呤毒素培养基继续处理，细胞密度超过80%时则进行传代处理，后续每隔2～3 d更换含嘌呤毒素培养基扩大培养，经过反复挑取抗药性细胞后获得的稳定转染细胞，命名为LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO。同样方法，阴性对照细胞株命名为LV-AML12-LUC-PURO。
1.10 qPCR检测稳转细胞株中荧光素基因的表达水平
使用TRIzol试剂提取组织总RNA，使用反转录试剂盒将其逆转录成cDNA，然后进行PCR扩增，采用2–ΔΔCT分析目的基因的相对表达量，引物序列见表3。
表 3 qPCR引物设计序列引物名称 引物序列（5′—3′） Luciferase-F CGCACATATCGAGGTGGACA Luciferase-R GCAAGCTATTCTCGCTGCAC mGapdh-F GTCAAGGCCGAGAATGGGAA mGapdh-R CTCGTGGTTCACACCCATCA 注：qPCR： 实时荧光定量聚合酶链式反应； mGapdh：小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶； F： 正向引物； R： 反向引物。 1.11 荧光素酶报告分析
使用二甲基亚砜（DMSO）和DXMS来验证LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO作为药物筛选工具的有效性和可行性。将LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO稳转细胞株培养于96孔黑色侧壁透明底板，用10 μmol/L DXMS处理12 h，同时用0.1% DMSO作为溶剂对照组。参照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，加入80 µl检测溶液，细胞充分裂解后在酶标仪中检测荧光素发光值。
为了评估本高通量细胞筛选平台的精确性和稳定性，使用Z′因子作为度量标准，Z′因子是高通量筛选中常用来评估和验证的主要统计参数之一：
$$Z^{\prime}=1-\frac{3 \sigma_{\mathrm{DMSO}}+3 \sigma_{\mathrm{DXMS}}}{\left|\mu_{\mathrm{DMSO}}-\mu_{\mathrm{DXMS}}\right|}$$ 式中σDMSO和σDXMS分别为阴性对照组和阳性对照组的标准差，μDMSO和μDXMS分别为阴性对照组和阳性对照组的平均值。若0.5<Z′≤1，则认为此筛选模型具有良好的精确性与稳定性。
1.12 药物筛选
基于对美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物库的筛选，选用陶术生物的FDA上市药物库，筛选可靶向升高ORM的药物。
1.13 统计学方法
实验数据使用软件 GraphPad Prism 9 进行作图和分析。两组间比较用t检验，以 P<0.05 为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 报告基因载体pGL4.20-ORM1 启动子的鉴定及验证
测序结果表明ORM1的启动子基因插入正确，如图1所示，序列信息无误。根据Lipofectamine 3000试剂盒说明书转染AML12细胞，使用荧光素酶报告基因试剂盒和酶标仪检测发光值，如图2所示，荧光素成功导入报告基因pGL4.20-ORM1 启动子中，并且可以被DXMS激活，证明该启动子的转录活性可用于稳转细胞株的构建。
2.2 qPCR检测稳转细胞株中荧光素基因的表达水平
采用qPCR分别对稳转细胞株LV-AML12-LUC-PURO与LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO进行荧光素 mRNA水平检测，如图3所示，其中，荧光素基因在LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO稳转细胞中的相对表达量是对照组LV-AML12-LUC-PURO的104.06倍。
图 3 稳转细胞株LV-AML12-LUC-PURO与LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO的荧光素 mRNA表达情况***P<0.001，与LV-AML12-LUC-PURO组比较。2.3 荧光素酶活力的测定
使用荧光素酶报告基因试剂盒和酶标仪检测发光值，如图4所示。DXMS的发光值是DMSO对照组的4.95倍。通过计算数据得Z′=0.77，说明此筛选平台可以作为一种高通量筛选的稳定方法。
2.4 药物筛选结果
通过对陶术生物的FDA上市药物库1 470种化合物筛选，以30 μmol/L的较高浓度初筛，将荧光值比率>1.5的135种化合物作为初步命中的化合物，如图5所示。这135种药物中包含40种糖皮质激素类药物，但由于长期服用糖皮质激素易出现向心性肥胖，这与减肥的初衷相悖，所以将这些药物排除。之后将剩余的95种药物进行30、10、1 μmol/L浓度的复筛，避免单一浓度筛选实验出现假阳性。根据复筛结果，42种化合物呈现出量效关系的趋势，如图6所示，这些化合物的类别可分为抗肿瘤药（图6A）、抗生素（图6B）、抗炎药（图6C）、抗病毒药（图6D）以及其他药物（图6E~G）。
图 6 复筛42种化合物作用于LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO稳转细胞的相对荧光值（μmol/L）A.抗肿瘤药；B.抗生素；C.消炎药；D.抗病毒药；E.其他药物14~23；F.其他药物24~33；G.其他药物34~423. 讨论
本课题组基于药物重定位的方法，通过构建带有ORM启动子的稳转细胞株作为高通量筛选平台，Z′因子的值为0.77，证明此细胞筛选平台可作为一种高通量筛选的稳定方法。经过初筛和复筛后，筛选出42种小分子药物，这些药物可能是潜在的以ORM作为靶点并能发挥减肥作用的药物。中国科学院上海生命科学研究院和上海中医药大学通过合作研究这种高通量化合物筛选发现的方式，成功发现舒尼替尼作为一种新的激活褐色脂肪组织（BAT）的小分子，是治疗肥胖等相关代谢性疾病的潜在药物[11]。
本课题组下一步将对这42种小分子药物进行体内验证实验，拟使用各个药物临床实验的安全范围内的剂量，在高脂饮食（HFD）小鼠模型中给药，观察药物能否显著抵抗高脂饮食诱导的肥胖，肝脏组织和血清中ORM的含量是否被上调，以及在ORM敲除的肥胖小鼠上观察药物的效应是否消除，从而确定其ORM靶点效应。
综上所述，本课题组为ORM靶向药物提供了一个快速细胞筛选平台，并从FDA上市药物库中筛选出了靶向上调ORM的潜在治疗肥胖的药物，为下一步减肥作用的观察奠定了基础。对这些药物及其潜在机制的研究可能会为减肥药物的发现和脂肪功能的新调节途径提供新的线索。
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表 1 不同比活度11C-FMZ注射后在不同时间的百分注射剂量率（%ID/L）
测定成分 时间(t/min) 1 2 3 4 5 10 15 20 30 40 60 11C-FMZ① 9.76±4.80 6.00±1.42 3.30±0.60 2.77±0.39 2.25±0.33 1.95±0.24 1.55±0.15 1.28±0.18 1.09±0.14 0.98±0.15 0.78±0.10 羧酸代谢物① 0.04±0.04 0.19±0.10 0.44±0.13 0.51±0.14 0.67±0.13 1.88±0.24 2.00±0.33 1.73±0.28 1.50±0.28 1.59±0.20 1.22±0.22 11C-FMZ② 13.84±4.67 6.10±1.31 3.27±0.49 3.10±0.36 2.66±0.37 1.97±0.33 1.42±0.13 1.23±0.15 1.11±0.06 0.67±0.13 0.45±0.07 羧酸代谢物② 0.15±0.11 0.28±0.08 0.50±0.17 0.55±0.29 0.98±0.27 2.22±0.42 2.36±0.44 2.39±0.34 1.90±0.41 1.39±0.25 0.98±0.14 注：①表示高比活度（268.3±57.2）×103 Ci/mol注射后的剂量率；②表示低比活度（57.8±11.4）×103Ci/mol注射后的剂量率。 
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表 2 不同比活度11C-FMZ的羧酸代谢物在不同时间百分注射剂量率的占比（%）
11C-FMZ羧酸代谢物 时间(t/min) 1 2 3 4 5 10 15 20 30 40 60 高比活度 0.54±0.54 3.32±1.89 12.04±3.61 15.58±4.25 23.11±4.92 48.98±4.89 56.11±4.68 57.36±5.63 57.60±3.45 61.92±4.51 60.85±5.39 低比活度 1.12±0.70 4.53±1.69 13.48±4.94 14.64±6.01 27.04±7.81 52.90±5.81 62.04±4.69* 65.85±5.35* 62.54±5.75* 67.26±4.88* 68.26±4.47* *P<0.05,与高比活度组比较。
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