留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

《药学实践与服务》杂志目前不收取审稿费、版面费、加急费等费用,如收到邮件声称是编辑部X编辑,要求加作者微信的,请谨防财产损失!编辑部用于作者校对时绑定微信的邮件通过yxsjzzs@163.com发送,标题是《药学实践与服务》XML数字出版服务微信绑定,请区分开。

金线莲多糖的提取优化与纯化

张松柏 张勋 许文 徐伟 黄泽豪 林羽 陈抒云

毛智毅, 王筱燕, 陈晓颖, 汤逸斐. 度拉糖肽联合二甲双胍对肥胖型2型糖尿病患者机体代谢、体脂成分及血清脂肪因子的影响[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(7): 305-309. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202305032
引用本文: 张松柏, 张勋, 许文, 徐伟, 黄泽豪, 林羽, 陈抒云. 金线莲多糖的提取优化与纯化[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(4): 354-358, 382. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001025
MAO Zhiyi, WANG Xiaoyan, CHEN Xiaoying, TANG Yifei. Effects of dulaglutide combined with metformin on body metabolism, body fat composition and serum adipokines in obese patients with type 2 diabetes mellitus[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(7): 305-309. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202305032
Citation: ZHANG Songbai, ZHANG Xun, XU Wen, XU Wei, HUANG Zehao, LIN Yu, CHEN Shuyun. Optimization and purification of extraction of polysaccharides from Anoecto-chilus roxburghii[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(4): 354-358, 382. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001025

金线莲多糖的提取优化与纯化

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001025
基金项目: 福建省科技厅高校产学合作项目(2019Y41010064);福建省科技厅引导性项目(2017Y0049);福建省食品药品监督管理局([3500]FJJF[DY]2018008);福建省自然基金(2017J01538)
详细信息
    作者简介:

    张松柏,硕士研究生,研究方向:药物分析与质量评价研究,Email:1228263595@qq.com

    通讯作者: 陈抒云,讲师,研究方向:药物分析,Email:gomupooh@126.com
  • 中图分类号: R284

Optimization and purification of extraction of polysaccharides from Anoecto-chilus roxburghii

  • 摘要:   目的  以响应面法优化超声提取金线莲多糖的工艺,同时,对多糖纯化中除蛋白方法进行考察。  方法  以多糖提取率为检测指标,在单因素考察的基础上采用Box-Behnken实验设计及响应面法对料液比、超声时间、超声提取温度3个因素进行优化;以多糖保留率和蛋白脱除率对Sevage试剂法、TCA法、盐法(NaOH-CaCl2法和NaOH-NaCl法)、盐酸法5种脱蛋白方法进行考察。  结果  金线莲多糖最佳提取工艺为: 料液比1∶10,超声提取温度48 ℃,超声提取时间36 min,超声提取次数2次,超声功率为300 W,该条件下金线莲多糖提取率达到了13.13%;同时以NaOH-CaCl2法脱蛋白,多糖损失率为18.74%,蛋白脱除率为95.62%。  结论  超声提取操作简单,优化后提取方法能够取得较高提取率,NaOH-CaCl2法脱蛋白能够获得较高蛋白脱除率及多糖保留率,该方法适用于金线莲多糖活性成分的开发研究。
  • 新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19),是指2019年始发、由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syn-drome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的肺炎。截至2020年4月5日,全球共确诊COVID-19患者1 093 349例,死亡58 620例[1]。目前尚无针对COVID-19的特异性治疗药物,一些化学药物包括氯喹/羟氯喹、洛匹那韦/利托那韦、瑞德西韦等正在临床开展随机对照研究。临床实践表明,清肺排毒汤和连花清瘟胶囊等多种中药方剂和制剂对COVID-19有良好的治疗效果。据国家卫生健康委员会报道,在我国确诊的COVID-19病例中,有74 187人使用了中医药,占91.5%;中医药能够缓解症状,减少轻型、普通型疾病向重型发展,提高治愈率、降低病死率,总有效率达90%以上[2]

    柴胡达胸合剂,曾用名为“强力肺炎1号”,是国医大师梅国强教授为痰热壅肺证COVID-19患者制定的中药处方[3]。柴胡达胸合剂由小柴胡汤、小陷胸汤、达原饮、止嗽散共同组方,包含柴胡、黄芩、法半夏、全瓜蒌、黄连、枳实、甘草、浙贝母、桔梗、百部、前胡、紫苑、款冬花、槟榔、草果、藿香、佩兰、虎杖共十八味中药。由于临床使用疗效显著,2020年2月23日,湖北省药品监督管理局下发制剂备案批件,包括柴胡达胸合剂在内的2个由湖北省中医院研制的医院制剂获批用于防治COVID-19[4]

    网络药理学是基于系统生物学和多向药理学技术和方法,通过构建“药物-基因-疾病”网络,分析药物在网络中与特定节点相互作用的关系,从整体角度探索药物与机体相互作用的一门学科[5]。2007年,Hopkins首次在Nature Biotechnology杂志上发表述评,提出网络药理学这一概念,并认为其为发现新药的新范式[6]。中药通过多成分、多靶点、多通路对疾病产生治疗作用,利用网络药理学方法,可系统阐明中药治疗疾病的药理作用机制[7]

    因此,本研究运用网络药理学方法,筛选柴胡达胸合剂治疗COVID-19的活性成分和作用靶点,构建“药材-活性成分-靶点”网络图,然后对靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interac-tion, PPI)、GO基因注释和KEGG信号通路分析,为进一步阐明柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制提供理论依据。

    通过《中华人民共和国药典》(2015年版)手工检索柴胡达胸合剂的十八味中药材的性味归经,利用Cytoscape 3.7.2软件制作“药材-性味归经”网络图。在中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)以柴胡达胸合剂中的十八味中药材名为关键词检索得到所有中药的化学成分。生物利用度(oral bioavailability,OB)和半衰期(half life,HL)是影响药动学的重要参数,而类药性(drug-likeness,DL)可以反映化合物的理化性质与已上市的药物是否类似。根据TCMSP数据库推荐的筛选标准,本研究以OB≥30%,DL≥0.18及HL≥4 h为条件,筛选得到每味中药材的活性成分。同时,通过 TCMSP 数据库查找各活性成分的作用靶点,归纳整理后利用Uniprot 数据库(https://www.uniprot.org/)标准化靶点名称。

    以coronavirus为关键词,检索GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/)数据库获得COVID-19潜在相关基因;利用Venn图在线绘制工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),将柴胡达胸合剂活性成分的作用靶点和COVID-19相关基因取交集,得到柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点;最后,将得到的药材-活性成分-靶点关联性文本导入Cytoscape 3.7.2软件,构建并分析“药材-活性成分-靶点”网络。

    将柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点导入STRING 蛋白相互作用数据库(https://string-db.org/),物种选定为Homo sapiens,获得PPI信息并导入Cytoscape 3.7.2软件,利用NetworkAnalyzer功能,分析网络中每个靶点的度值(dgree value),使用R软件Graphics包,绘制条形图展示度值排名前20位的靶点。

    利用R软件的org.Hs.eg.db和clusterProfiler包,对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点进行GO基因注释和KEGG通路分析,以P<0.05进行筛选,得到柴胡达胸合剂对COVID-19发挥治疗作用参与的生物学过程和信号通路,并绘制气泡图展示结果。

    柴胡达胸合剂“药材-性味归经”网络如图1所示,图中节点的大小代表该节点在网络中的度值。由图可知,度值最大的性味归经分别为寒(度值=8)、苦(度值=13)和肺经(度值=14)。

    图  1  柴胡达胸合剂的“药材-性味归经”网络图

    通过TCMSP平台检索到柴胡达胸合剂中的十八味药材共包含1 977个化合物。以OB≥30%,DL≥0.18及HL≥4 h为条件筛选并去重后,共得到221个活性成分。在TCMSP检索活性成分的作用靶点,并到Uniprot数据库中查找其标准名称,最后共得到259个作用靶点。柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息,结果见表1

    表  1  柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息表
    中药名称化合物(个)活性成分(个)靶点(个)
    柴胡34914165
    黄芩1433295
    法半夏1161170
    全瓜蒌8078
    黄连4810153
    枳实651498
    甘草28076198
    浙贝母17429
    桔梗102763
    百部1101882
    前胡10111157
    紫菀9113175
    款冬花14819155
    槟榔52310
    草果595136
    藿香949147
    佩兰60673
    虎杖628159
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    通过检索GeneCards和OMIM数据库,共收集得到COVID-19相关基因352个。将柴胡达胸合剂的作用靶点和COVID-19相关基因取交集制作Venn图,共得到51个交集基因,即柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点(图2)。

    图  2  柴胡达胸合剂作用靶点和COVID-19相关基因Venn图

    柴胡达胸合剂治疗COVID-19“药材-活性成分-靶点”网络共包含234个节点(药材节点18个,有效成分节点165个,靶点节点51个)。网络中棱形代表药材节点,倒三角代表有效成分节点,圆形代表靶点节点(图3)。节点的颜色越深或节点图形越大,表明该节点在网络中的度值越高。每一圈的最低点为该圈度值最大的节点,度值沿逆时针方向逐渐减小,且3个有效成分节点圈由外往里节点度值依次减小。网络中化合物节点中位数为4,高于2倍中位数的化合物节点共有12个(表2),这些化合物可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要活性成分。

    表  2  高于2倍度值中位数的化合物信息表
    TCMSP数据库ID化合物名称对应药材度值
    MOL000098槲皮素(quercetin)草果、柴胡、甘草、虎杖、黄连、藿香、款冬花、前胡、紫菀46
    MOL000006木犀草素(luteolin)虎杖、桔梗、佩兰、枳实、紫菀23
    MOL000422山奈酚(kaempferol)柴胡、甘草、款冬花、紫菀16
    MOL000358β-谷甾醇(beta-sitosterol)百部、半夏、浙贝母、虎杖、黄芩、款冬花、前胡、紫菀15
    MOL000173汉黄芩素(wogonin)黄芩14
    MOL004328柚皮素(naringenin)甘草、枳实13
    MOL002714黄芩素(baicalein)半夏、黄芩10
    MOL000497甘草查尔酮A(licochalcone A)甘草10
    MOL001689刺槐素(acacetin)黄芩、桔梗10
    MOL005828川陈皮素(nobiletin)枳实10
    MOL000354异鼠李素(isorhamnetin)柴胡、甘草、紫菀9
    MOL005916葛花苷元(irisolidone)藿香9
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格
    图  3  柴胡达胸合剂治疗COVID-19“药材-活性成分-靶点”网络图

    在“药材-活性成分-靶点”网络中的靶点节点不包含PPI信息,因此,对柴胡达胸合剂治疗COVID-19靶点进行PPI分析,结果如图4A所示。图中节点形状越大,表明其度值越高,越可能为柴胡达胸合剂治疗COVID-19的核心作用靶点。对网络中度值前30的节点作条形图,节点度值排名前10的蛋白为CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2 和CCL2(图4B)。

    图  4  靶点PPI网络图(A)和度值条形图(B)

    GO基因注释将基因的功能分为3个部分:参与的生物学过程(biological process,BP),所处的细胞组分(cellular component,CC),执行的分子功能(molecular function,MF)。对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行GO基因注释,以P<0.05为条件进行筛选,结果得到GO条目共1 722个,其中BP条目1 612个,CC条目30个,MF条目80个。选取每个部分的前5个条目作气泡图,富集最多基因且P值最小的BP、CC和MF条目分别为脂多糖反应、膜筏和细胞因子受体结合(图5)。

    图  5  GO基因注释气泡图

    对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行 KEGG 信号通路富集分析,筛选出P<0.05的信号通路156条,选取富集基因最多的10条通路作气泡图。排名前5的信号通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎(图6)。

    图  6  KEGG信号通路分析气泡图

    COVID-19隶属于中医的“温疫”、“疫病”范畴,病因为感受“异气”、“疠气”,疠气夹湿,病位在肺、脾[3]。柴胡达胸合剂用于痰热壅肺证患者,其病因为痰热互结,壅闭于肺,致使肺失宣降而表现的肺经实热证候。本研究首先对柴胡达胸合剂的十八味中药材进行性味归经的网络分析,结果发现柴胡达胸合剂组方的性味以“苦寒”最多且主归肺经。“苦寒”药能清热泻火,消除热症,多用于具有实热特征病证[8]。因此,柴胡达胸合剂与COVID-19的病机、病位相符。

    利用中药、疾病相关数据库,本研究筛选出柴胡达胸合剂治疗COVID-19的165个活性成分和51个作用靶点,表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19具有多成分、多靶点的特点。通过构建和分析“药材-活性成分-靶点”网络图,发现网络中度值较高的12个活性成分:槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素、甘草查尔酮A、刺槐素、川陈皮素、异鼠李素和葛花苷元。除β-谷甾醇外,其余11个成分均属于黄酮类化合物。

    黄酮类化合物广泛存在于自然界的多种植物中,具有包括抗炎、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等多种药理作用[9]。黄酮类化合物还有良好的抗病毒作用,对流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒等都有抑制作用[10]。体外实验研究表明,槲皮素和木犀草素均能够抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性,对SARS-CoV 产生抑制作用[11-12]。β-谷甾醇也能抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性[13]。SARS-CoV-2与SARS-CoV基因序列有约80%同源性,两者3CL蛋白酶结构有相似性[14]。此外,分子对接结果发现山柰酚、槲皮素、 黄芩素、 木犀草素、 汉黄芩素、β-谷甾醇与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶均有较高的结合活性[15]。因此,通过直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性,可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制之一。

    通过分析PPI网络发现,CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2、CCL2等在网络中有较高的度值。CASP3基因编码的caspase-3蛋白是细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶,研究发现caspase-3蛋白在SARS-CoV病毒引起的组织细胞凋亡过程中发挥了重要作用[16]。MAPK基因编码的丝裂原活化蛋白激酶参与细胞的增殖、分化、迁移及凋亡等多个生物学过程。此外,炎症因子风暴被认为是重症COVID-19患者组织损伤的病理机制之一。SARS-CoV-2病毒在体内激活T细胞,产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-6等细胞因子,随后GM-CSF会进一步激活CD14+CD16+炎性单核细胞,进一步升高IL-6等炎性因子,形成炎症因子风暴,导致严重的肺部和其他器官免疫损伤[17]。细胞因子根据其在炎性反应中的作用不同可分为促炎性细胞因子(如 IL-1、IL-6、IFN-α、IFN-γ、TNF-α 等)和抑炎性细胞因子(如 IL-4、IL-10 等)两类。SARS患者的肺部炎症和肺损伤与患者血浆中的IL-1B、IL-6、IL-12等促炎性细胞因子水平升高引起炎症因子风暴有关[18]。同样地,COVID-19患者血浆IL-1B、IFN-γ、CXC趋化因子-10(CXCL-10)等促炎性细胞因子水平也升高[19]。本研究中,IL-6、IL-10和IL-1B均为核心作用靶点。因此,减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平可能也是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制。

    对靶点进行GO基因注释的结果表明,柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要生物学过程为脂多糖反应、对源于细菌的分子的反应和氧化应激反应等。脂多糖是G-菌细胞壁的组成成分,可诱导细胞产生炎性反应,其中促炎性细胞因子发挥了重要介导作用。IL-6可促进B细胞分化,并活化MAPK,激活STAT转录因子,从而加重炎性反应[20]。KEGG分析富集到156条信号通路,主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎,表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19多通路的特点。

    综上所述,本研究采用网络药理学方法,初步揭示了柴胡达胸合剂可能一方面通过多种黄酮类化合物和β-谷甾醇直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性,另一方面通过多成分、多靶点、多通路减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平,从而对COVID-19产生治疗作用。

  • 图  1  单因素实验考察结果

    图  2  料液比与提取温度的等高线及响应面图

    图  3  超声提取时间与提取温度的等高线及响应面图

    表  1  Box-Behnken 试验设计因素与水平

    因素水平
    −101
    料液比(A) 51015
    超声时间(B)203040
    超声提取温度(C)405060
    下载: 导出CSV

    表  2  提取金线莲多糖方法比较

    方法提取率(%)平均得率(g/g)
    实验1实验2实验3
    超声提取[8]10.5310.9111.2110.89
    回流提取[9]9.278.438.828.84
    温水浸提[10]5.455.634.105.06
    酶提取[9]9.5510.3010.3310.06
    下载: 导出CSV

    表  3  Box-Behnken试验设计方案及结果

    实验号ABC多糖提取率(%)
    1−1.0000.000−1.00012.22
    21.0000.000−1.00010.16
    30.0001.000−1.00013.13
    40.0000.0000.00013.03
    51.0000.0001.00012.98
    60.000−1.000−1.00010.86
    7−1.000−1.0000.00011.19
    80.0000.0000.00013.21
    90.0001.0001.00012.28
    100.000−1.0001.00012.25
    11−1.0001.0000.00011.88
    121.000−1.0000.00011.08
    130.0000.0000.00013.12
    140.0000.0000.00012.85
    15−1.0000.0001.00010.83
    161.0001.0000.00012.11
    170.0000.0000.00013.21
    下载: 导出CSV

    表  4  模型回归系数显著性检验结果

    来源平方和自由度均方F P
    模型15.4191.7151.68< 0.0001
    A5.513×10−315.513×10−30.170.6955
    B2.0212.0260.980.0001
    C0.4910.4914.640.0065
    AB0.02910.0290.870.3814
    AC4.4314.43133.76< 0.0001
    BC1.2511.2537.870.0005
    A24.6514.65140.33< 0.0001
    B20.9210.9227.870.0011
    C20.9910.9929.990.0009
    残差0.2370.033
    失拟项0.1430.0472.070.2463
    纯误性0.09140.023
    总离性15.6416
    下载: 导出CSV

    表  5  不同脱蛋白方法对金线莲多糖损失及蛋白脱除的考察结果(n=3)

    方法多糖损失率(%)蛋白脱除率(%)
    HCl法脱蛋白[46]41.8296.71
    NaOH-CaCl2法脱蛋白[5]18.7495.62
    NaOH-NaCl法脱蛋白[5]27.0792.95
    TCA法脱蛋白[5]46.6397.90
    Sevage法脱蛋白[6]47.2391.92
    下载: 导出CSV
  • [1] 朱建军, 黄雨佳, 金建红, 等. 不同栽培基质对金线莲3种基原植物生长及其活性成分含量的影响[J]. 中国中药杂志, 2019, 44(12):2467-2471.
    [2] YE S Y, SHAO Q S, ZHANG A L. Anoectochilus roxburghii: a review of its phytochemistry, pharmacology, and clinical applications[J]. J Ethnopharmacol,2017,209:184-202. doi:  10.1016/j.jep.2017.07.032
    [3] 张晓辉. 金线莲多糖结构分析及抗糖尿病活性研究[D]. 汕头: 汕头大学, 2011.
    [4] 宋逍, 赵鹏, 段玺, 等. 穿山龙多糖脱蛋白工艺研究[J]. 中药材, 2016, 39(5):1110-1113.
    [5] CHENG H, HUANG G L. Extraction, characterisation and antioxidant activity of Allium sativum polysaccharide[J]. Int J Biol Macromol,2018,114:415-419. doi:  10.1016/j.ijbiomac.2018.03.156
    [6] YANG B, YANG Y, WANG X F, et al. Optimization of deproteinized process from Echinops latifolius Tausch polysaccharide by response surface methodology[J]. Sci Technol Food Ind,2014,35(10):287-291.
    [7] 张松柏, 陈磊, 许文, 等. 优化苯酚硫酸法测定金线莲中多糖含量[J]. 福建中医药, 2019, 50(4):58-60. doi:  10.3969/j.issn.1000-338X.2019.04.021
    [8] 潘晓丽, 李萍, 郑小香, 等. 超声波法提取金线莲多糖的工艺研究[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2015, 23:201-203.
    [9] 刘帅, 莫俊恺, 潘丹阳, 等. 桑黄多糖的药理作用及提取方法研究进展[J]. 生物技术通报, 2018, 34(12):63-67.
    [10] 李萍, 潘晓丽, 郑小香, 等. 金线莲多糖提取工艺研究[J]. 安徽农业科学, 2015, 43(13):105-107. doi:  10.3969/j.issn.0517-6611.2015.13.039
  • [1] 张淑秀, 袁伯川, 杜丽娜, 金义光.  多糖用于放射性核素清除的研究进展 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-6. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202405060
    [2] 游飘雪, 陈兰, 施艺玮, 王辉, 晁亮, 洪战英.  脑胶质瘤微流控芯片模型的构建及中药半枝莲药效评价应用研究 . 药学实践与服务, 2025, 43(2): 59-66. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202409034
    [3] 姚小静, 计佩影, 陆峰, 施国荣, 傅翔.  表面增强拉曼光谱法快速测定尿液中曲马多的研究 . 药学实践与服务, 2025, 43(4): 1-5. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202401072
    [4] 肖农, 陆诗依, 唐文雅, 居敏俐, 徐刚锋, 杨明华.  中成药微生物计数法前处理的影响因素和优化方法 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-5. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202403014
    [5] 彭莹, 刘欣, 聂依文, 王歆荷, 年华, 朱建勇.  三种狼毒乙醇提取物对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠防治作用研究 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-6. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202406029
    [6] 关梦瑶, 夏天爽, 何旭辉, 史策, 蒋益萍, 辛海量.  黑蒜多糖抗便秘作用研究 . 药学实践与服务, 2025, 43(4): 1-5. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202403059
    [7] 陈方剑, 赵娟娟, 叶侃倜, 孙煜昕, 刘继勇, 杨骏.  血通胶囊提取工艺优化及质量控制研究 . 药学实践与服务, 2025, 43(2): 82-86, 91. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202409003
    [8] 乔方良, 蒋益萍, 夏天爽, 刘爱军, 赵凯, 辛海量.  对萼猕猴桃苷E提取分离纯化工艺的研究 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-7. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202407001
    [9] 冯婷婷, 张景翔, 王彦, 许维恒, 张俊平.  ANXA3基因及蛋白的研究进展 . 药学实践与服务, 2025, 43(2): 47-50, 74. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202309023
    [10] 邹思, 吴岩斌, 吴锦忠, 吴建国, 黄家兴.  虎奶菇菌核多糖功能化纳米硒抗疲劳功效研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(10): 426-432. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206072
    [11] 陈金涛, 乔子婴, 马明华, 张若曦, 王振伟, 年华.  基于网络药理学和分子对接技术研究金芪清疏颗粒治疗社区获得性肺炎的潜在机制 . 药学实践与服务, 2024, 42(11): 471-478. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202312014
    [12] 宋雨桐, 夏德润, 顾珩, 唐少文, 易洪刚, 沃红梅.  帕博利珠单抗与铂类化疗方案在晚期非小细胞肺癌一线治疗中的药物经济学评价 . 药学实践与服务, 2024, 42(8): 334-340. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202303023
    [13] 冯志惠, 邓仪卿, 叶冰, 安培, 张宏, 张海军.  雀梅藤石油醚提取物诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡的实验研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(6): 253-259. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311055
    [14] 刘汝雄, 杨万镇, 涂杰, 盛春泉.  铁死亡调控蛋白GPX4的小分子抑制剂研究进展 . 药学实践与服务, 2024, 42(9): 375-378. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202312075
    [15] 凯丽比努尔·奥布力艾散, 李倩, 谢志, 贾文彦, 尹东锋.  星点设计-效应面法优化仑伐替尼混合胶束的制备工艺 . 药学实践与服务, 2024, 42(11): 495-502. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202403019
  • 加载中
图(3) / 表(5)
计量
  • 文章访问数:  6185
  • HTML全文浏览量:  2084
  • PDF下载量:  25
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2020-01-07
  • 修回日期:  2020-05-18
  • 网络出版日期:  2020-07-27
  • 刊出日期:  2020-07-25

金线莲多糖的提取优化与纯化

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001025
    基金项目:  福建省科技厅高校产学合作项目(2019Y41010064);福建省科技厅引导性项目(2017Y0049);福建省食品药品监督管理局([3500]FJJF[DY]2018008);福建省自然基金(2017J01538)
    作者简介:

    张松柏,硕士研究生,研究方向:药物分析与质量评价研究,Email:1228263595@qq.com

    通讯作者: 陈抒云,讲师,研究方向:药物分析,Email:gomupooh@126.com
  • 中图分类号: R284

摘要:   目的  以响应面法优化超声提取金线莲多糖的工艺,同时,对多糖纯化中除蛋白方法进行考察。  方法  以多糖提取率为检测指标,在单因素考察的基础上采用Box-Behnken实验设计及响应面法对料液比、超声时间、超声提取温度3个因素进行优化;以多糖保留率和蛋白脱除率对Sevage试剂法、TCA法、盐法(NaOH-CaCl2法和NaOH-NaCl法)、盐酸法5种脱蛋白方法进行考察。  结果  金线莲多糖最佳提取工艺为: 料液比1∶10,超声提取温度48 ℃,超声提取时间36 min,超声提取次数2次,超声功率为300 W,该条件下金线莲多糖提取率达到了13.13%;同时以NaOH-CaCl2法脱蛋白,多糖损失率为18.74%,蛋白脱除率为95.62%。  结论  超声提取操作简单,优化后提取方法能够取得较高提取率,NaOH-CaCl2法脱蛋白能够获得较高蛋白脱除率及多糖保留率,该方法适用于金线莲多糖活性成分的开发研究。

English Abstract

毛智毅, 王筱燕, 陈晓颖, 汤逸斐. 度拉糖肽联合二甲双胍对肥胖型2型糖尿病患者机体代谢、体脂成分及血清脂肪因子的影响[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(7): 305-309. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202305032
引用本文: 张松柏, 张勋, 许文, 徐伟, 黄泽豪, 林羽, 陈抒云. 金线莲多糖的提取优化与纯化[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(4): 354-358, 382. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001025
MAO Zhiyi, WANG Xiaoyan, CHEN Xiaoying, TANG Yifei. Effects of dulaglutide combined with metformin on body metabolism, body fat composition and serum adipokines in obese patients with type 2 diabetes mellitus[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(7): 305-309. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202305032
Citation: ZHANG Songbai, ZHANG Xun, XU Wen, XU Wei, HUANG Zehao, LIN Yu, CHEN Shuyun. Optimization and purification of extraction of polysaccharides from Anoecto-chilus roxburghii[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(4): 354-358, 382. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001025
  • 金线莲Anoectochilus roburghii (Wall.) Lindl,又名金线兰、金蚕、乌人参、金线入骨消等,是一种多年生兰科草本植物[1],主产地为福建。文献报道多糖类、黄酮类、生物碱类、氨基酸类等是金线莲主要化学成分[2]。其中金线莲多糖是其主要药理活性物质,具有降血糖、抗氧化、抗肝损伤、增强免疫功能、抗肿瘤等药用功效[3]。本研究为提高金线莲多糖提取率,采用超声提取的方法,在单因素实验的基础上以响应面法优化其提取工艺。蛋白质的存在往往影响到多糖的活性,蛋白的脱除是多糖提取纯化的一个关键步骤[4],且天然植物中多糖与蛋白质两种高分子成分分子量相近,严重制约了进一步的分析[5],而Sevage试剂法、三氯乙酸(TCA)法、盐法(氯化钙和氯化钠法)、盐酸法等是多糖脱蛋白的常用方法[4-6],为此,笔者对以上方法在金线莲多糖提取中的影响进行了考察,为进一步深入研究金线莲多糖奠定一定的基础。

    • UV-3200紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);AR224CN电子天平(美国奥豪斯仪器常州有限公司);HWS-12型电热恒温水浴锅、电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);SC-04低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司);KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

    • 福建永泰产金线莲样品经福建中医药大学药学院黄泽豪副教授鉴定为兰科开唇兰属的金线莲Anoectochilus roburghii (Wall.) Lindl。D-水葡萄糖(中国食品药品检定研究院,批号:110833-201506);乙醇(批号:20181208)、苯酚(批号:P815401)、氢氧化钠(批号:20160509)购自上海国药集团化学试剂有限公司;硫酸(批号:1706191)、盐酸(批号:1903301,)、氯化钠(批号:1610141)、氯仿(批号:1803121)购自广东西陇科学股份有限公司;氯化钙(广东光华化学有限公司,批号:20091031);正丁醇(江苏强盛功能化学股份有限公司,批号:20130418);超纯水(实验室制备)。

    • 取D-葡萄糖50 mg溶于1000 ml的量瓶中,加水定容,得对照品溶液。

    • 取金线莲鲜品清洗干净,于60 ℃恒温干燥箱中烘干,打粉,过60目筛,得金线莲干品。取金线莲粉末5 g,以料液比为1:10加水,48 ℃超声提取30 min,超声功率为300 W,超声提取2次;对上述提取液3600 r /min离心15 min,弃去沉淀,即得金线莲原始液。取上述原始液5 ml加4倍体积无水乙醇放置过夜,4000 r/min下离心10 min,沉淀加水溶解,于1000 ml的量瓶中定容,得供试品溶液。

    • 按本课题先前研究的“优化的苯酚硫酸法”[7],计算金线莲多糖提取得率。

    • 按“2.2”项下的方法,对超声提取工艺中各单因素进行考察:①以超声温度30、40、50、60、70、80 ℃分别进行提取;②以超声功率200、250、300、350、400 W分别进行提取;③用超声分别提取10、20、30、40、50 min;④以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30的料液比加水;⑤用超声分别提取1、2、3次。

    • 在单因素考察的基础上,利用软件Design-Expert.V8.0.6.1中Box-Behnken试验原理,选择对多糖提取率影响较大3个因素料液比(A)、超声提取时间(B)、超声温度(C)为自变量,以多糖提取率(R)为响应值,设计3因素3水平实验。因素与水平设计如表1

      表 1  Box-Behnken 试验设计因素与水平

      因素水平
      −101
      料液比(A) 51015
      超声时间(B)203040
      超声提取温度(C)405060
    • 取5 ml金线莲原始液,用2 mol/L盐酸调节至pH 3,并保持过夜。将该混合物在4000 r/min下离心10 min,弃去沉淀,上清液加入4倍体积无水乙醇放置过夜,4000 r/min下离心10 min,所得沉淀物加水溶解,于1000 ml的量瓶中定容,得脱蛋白供试品溶液。

    • 取5 ml金线莲原始液,以2% NaOH溶液将其调至pH 8~9,加热至85 ℃。将CaCl2固体调至5%(50 g/L)的浓度,煮沸30 min,冷却至室温并过滤,用稀盐酸将滤液调至pH 7,加入4倍体积无水乙醇放置过夜,4000 r/min下离心10 min,得多糖沉淀。加水溶解重复上述操作3次,所得沉淀物加水溶解,于1000 ml的量瓶中定容,得脱蛋白供试品溶液。

    • 取5 ml金线莲原始液,在沸腾(90 ℃)条件下,用2%NaOH溶液将多糖溶液调节到pH 9~10。加入NaCl固体,浓度调至5%(50 g/L),然后混合煮沸30 min。冷却至室温并过滤,上清液用稀盐酸调至pH 7。添加4倍体积无水乙醇放置过夜沉淀多糖,在4000 r/min下离心10 min,弃上清液得多糖沉淀。加水溶解重复上述操作3次,所得沉淀物加水溶解,于1000 ml的量瓶中定容,得脱蛋白供试品溶液。

    • 取5 ml金线莲原始液,加入10% TCA溶液将其调节到pH 3,静置过夜。样品4000 r/min离心10 min,沉淀物丢弃,上清液加4倍体积无水乙醇放置过夜,在4000 r/min下离心10 min,弃去上清液得多糖沉淀。加水溶解重复上述操作3次,所得沉淀物加水溶解,于1000 ml的量瓶中定容,得脱蛋白供试品溶液。

    • 取5 ml金线莲原始液,以金线莲水提溶液:正丁醇:氯仿按1:1:4的比例进行除蛋白,振荡器振荡20 min 后,4000 r/min 转速离心 5 min,弃去下层有机相。该过程重复3次,上层水相添加4倍体积无水乙醇放置过夜,在4000 r/min下离心10 min,弃去上清液得多糖沉淀物,所得沉淀物加水溶解,于1000 ml的量瓶中定容,得脱蛋白供试品溶液。

    • 以“紫外分光光度法”对蛋白含量进行测定[5],

      蛋白质浓度C(mg/ml) = 1.45A280−0.74A260

      多糖损失率=[(供试品多糖含量-脱蛋白供试品多糖含量)/供试品多糖含量]×100%

      蛋白脱除率=[(供试品蛋白含量-脱蛋白供试品蛋白含量)/供试品蛋白含量]×100%

    • 参考相关文献,按“2.2” 项下使用不同提取方法制得对应的供试品,比较多糖得率,结果如表2

      表 2  提取金线莲多糖方法比较

      方法提取率(%)平均得率(g/g)
      实验1实验2实验3
      超声提取[8]10.5310.9111.2110.89
      回流提取[9]9.278.438.828.84
      温水浸提[10]5.455.634.105.06
      酶提取[9]9.5510.3010.3310.06

      实验结果表明,超声提取和酶提取均能获得较高的多糖提取率,由于酶价格昂贵,超声提取操作简便,且能获得高提取率,故选择超声提取进行下一步研究。

    • 图1所示:①随着提取温度的增加,提取得率逐渐增加,在50 ℃提取得率达到最大值,后随着温度的增加提取率逐渐下降并趋于稳定,故初步确定提取温度40~60℃作为进一步响应面考察设计的水平;②在超声功率为300 W时多糖提取率最高,实验结果显示,随着超声功率的增加,多糖提取率先上升后下降,但影响相对较小,故选定功率为300 W进行下一步分析;③以超声提取30 min,提取率最高,故初步确定超声时间20~40 min作为进一步响应面考察设计的水平;④料液比为1∶10时,多糖提取率最高,随着料液比的增加,提取率稍有下降且趋于平稳,故初步确定料液比1∶5~1∶15作为进一步响应面考察设计的水平;⑤随着提取次数的增加,提取率逐渐降低,提取3次后,多糖已基本提取完全,考虑实际操作及原料等,选定提取2次进行下一步分析。

      图  1  单因素实验考察结果

    • 在单因素考察的基础上,利用软件Design-Expert. V 8.0.6.1中Box-Behnken试验原理,设计3因素3水平实验。响应值设计方案及结果见表3,方差分析见表4。对数据分析后得到回归方程为:

      表 3  Box-Behnken试验设计方案及结果

      实验号ABC多糖提取率(%)
      1−1.0000.000−1.00012.22
      21.0000.000−1.00010.16
      30.0001.000−1.00013.13
      40.0000.0000.00013.03
      51.0000.0001.00012.98
      60.000−1.000−1.00010.86
      7−1.000−1.0000.00011.19
      80.0000.0000.00013.21
      90.0001.0001.00012.28
      100.000−1.0001.00012.25
      11−1.0001.0000.00011.88
      121.000−1.0000.00011.08
      130.0000.0000.00013.12
      140.0000.0000.00012.85
      15−1.0000.0001.00010.83
      161.0001.0000.00012.11
      170.0000.0000.00013.21

      表 4  模型回归系数显著性检验结果

      来源平方和自由度均方F P
      模型15.4191.7151.68< 0.0001
      A5.513×10−315.513×10−30.170.6955
      B2.0212.0260.980.0001
      C0.4910.4914.640.0065
      AB0.02910.0290.870.3814
      AC4.4314.43133.76< 0.0001
      BC1.2511.2537.870.0005
      A24.6514.65140.33< 0.0001
      B20.9210.9227.870.0011
      C20.9910.9929.990.0009
      残差0.2370.033
      失拟项0.1430.0472.070.2463
      纯误性0.09140.023
      总离性15.6416

      多糖提取率(R)=13.08+0.026A+0.50B+0.25C+0.085AB+1.05AC−0.56BC−1.05A2−0.47B2−0.49C2

      表3知,回归模型有很好的显著性(P< 0.0001),说明二项式方程拟合良好,模型二项式方程失拟项不显著(P=0.2463),说明未知因素对实验干扰较小,拟合的相关系数r=0.9926,模型可信度良好,故可运用此模型实现超声提取金线莲多糖最佳工艺的分析探究。

      根据拟合方程绘制响应面图谱,响应面分析的等高线图和响应面图(图2图3),AC、BC具有相互影响,各图为料液比(A)、超声时间(B)、超声提取温度(C)中任意一个变量取零水平,其余变量对金线莲多糖提取率的交互作用影响。由图2图3可以看出,提取时间对提取率影响最为显著,三者的主效应关系为:提取时间(B)>提取温度(A)>料液比(C),其中料液比与提取温度的响应曲面最为陡峭,证明料液比与提取温度的交互作用最为强。

      图  2  料液比与提取温度的等高线及响应面图

      图  3  超声提取时间与提取温度的等高线及响应面图

      通过Design-Expert. V 8.0.6.1软件对二项式回归方程进行最优值的计算,确定理论上的多糖提取最佳工艺:料液比为1∶9.88,超声提取温度为48.76 ℃,超声提取时间为36.08 min,超声提取次数为2次,超声功率为300 W,其多糖提取的理论得率为13.22%,考虑到实际操作的可行性,最佳工艺定为料液比1∶10,超声提取温度48 ℃,超声提取时间36 min,超声提取次数为2次,超声功率为300 W。为验证实验结果,进行3组平行实验,多糖提取得率分别为13.14%、13.05%、13.20%,其RSD为0.57%,提取得率的均值13.13%与理论值13.22%偏差0.09%,表明优化后的提取工艺可行,适用于金线莲中多糖的提取。

    • 按“2.6”项下的方法进行脱蛋白操作,得出多糖损失率及蛋白脱除率结果如表5。实验结果表明,NaOH-CaCl2法脱蛋白可以获得较高蛋白脱除率,同时也能获得最低的多糖损失率。

      表 5  不同脱蛋白方法对金线莲多糖损失及蛋白脱除的考察结果(n=3)

      方法多糖损失率(%)蛋白脱除率(%)
      HCl法脱蛋白[46]41.8296.71
      NaOH-CaCl2法脱蛋白[5]18.7495.62
      NaOH-NaCl法脱蛋白[5]27.0792.95
      TCA法脱蛋白[5]46.6397.90
      Sevage法脱蛋白[6]47.2391.92
    • 植物多糖的提取方法包括了超声提取法[8]、酶法[9]、回流提取[9]、传统温水浸提[10]等,传统热水浸提与回流提取的提取效率低,且操作烦琐,考虑到酶法中由于酶价格昂贵,不适用于批量金线莲多糖的提取,本文采用超声提取的方法,操作简单,且以响应面优化后的提取工艺能够取得较高得率。因金线莲多糖中所含蛋白对进一步分析产生影响[6],所以,本研究考察了5种除蛋白的方法,结果表明NaOH-CaCl2法最佳,既能获得较高蛋白脱除率,同时多糖损失最少;本研究将两者结合,实现了对金线莲多糖成分的最大化提取与保留,为金线莲多糖的深度开发提供了参考。

参考文献 (10)

目录

/

返回文章
返回