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金线莲Anoectochilus roburghii (Wall.) Lindl，又名金线兰、金蚕、乌人参、金线入骨消等，是一种多年生兰科草本植物[1]，主产地为福建。文献报道多糖类、黄酮类、生物碱类、氨基酸类等是金线莲主要化学成分[2]。其中金线莲多糖是其主要药理活性物质，具有降血糖、抗氧化、抗肝损伤、增强免疫功能、抗肿瘤等药用功效[3]。本研究为提高金线莲多糖提取率，采用超声提取的方法，在单因素实验的基础上以响应面法优化其提取工艺。蛋白质的存在往往影响到多糖的活性，蛋白的脱除是多糖提取纯化的一个关键步骤[4]，且天然植物中多糖与蛋白质两种高分子成分分子量相近，严重制约了进一步的分析[5]，而Sevage试剂法、三氯乙酸（TCA）法、盐法（氯化钙和氯化钠法）、盐酸法等是多糖脱蛋白的常用方法[4-6]，为此，笔者对以上方法在金线莲多糖提取中的影响进行了考察，为进一步深入研究金线莲多糖奠定一定的基础。
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UV-3200紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；AR224CN电子天平（美国奥豪斯仪器常州有限公司）；HWS-12型电热恒温水浴锅、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SC-04低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
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福建永泰产金线莲样品经福建中医药大学药学院黄泽豪副教授鉴定为兰科开唇兰属的金线莲Anoectochilus roburghii (Wall.) Lindl。D-水葡萄糖（中国食品药品检定研究院，批号：110833-201506）；乙醇（批号：20181208）、苯酚（批号：P815401）、氢氧化钠（批号：20160509）购自上海国药集团化学试剂有限公司；硫酸（批号：1706191）、盐酸（批号：1903301，）、氯化钠（批号：1610141）、氯仿（批号：1803121）购自广东西陇科学股份有限公司；氯化钙（广东光华化学有限公司，批号：20091031）；正丁醇（江苏强盛功能化学股份有限公司，批号：20130418）；超纯水（实验室制备）。
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取D-葡萄糖50 mg溶于1000 ml的量瓶中，加水定容，得对照品溶液。
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取金线莲鲜品清洗干净，于60 ℃恒温干燥箱中烘干，打粉，过60目筛，得金线莲干品。取金线莲粉末5 g，以料液比为1：10加水，48 ℃超声提取30 min，超声功率为300 W，超声提取2次；对上述提取液3600 r /min离心15 min，弃去沉淀，即得金线莲原始液。取上述原始液5 ml加4倍体积无水乙醇放置过夜，4000 r/min下离心10 min，沉淀加水溶解，于1000 ml的量瓶中定容，得供试品溶液。
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按本课题先前研究的“优化的苯酚硫酸法”[7]，计算金线莲多糖提取得率。
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按“2.2”项下的方法，对超声提取工艺中各单因素进行考察：①以超声温度30、40、50、60、70、80 ℃分别进行提取；②以超声功率200、250、300、350、400 W分别进行提取；③用超声分别提取10、20、30、40、50 min；④以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30的料液比加水；⑤用超声分别提取1、2、3次。
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在单因素考察的基础上，利用软件Design-Expert.V8.0.6.1中Box-Behnken试验原理，选择对多糖提取率影响较大3个因素料液比（A）、超声提取时间（B）、超声温度（C）为自变量，以多糖提取率（R）为响应值，设计3因素3水平实验。因素与水平设计如表1。
表 1 Box-Behnken 试验设计因素与水平
因素 水平 −1 0 1 料液比（A） 5 10 15 超声时间（B） 20 30 40 超声提取温度（C） 40 50 60 -
取5 ml金线莲原始液，用2 mol/L盐酸调节至pH 3，并保持过夜。将该混合物在4000 r/min下离心10 min，弃去沉淀，上清液加入4倍体积无水乙醇放置过夜，4000 r/min下离心10 min，所得沉淀物加水溶解，于1000 ml的量瓶中定容，得脱蛋白供试品溶液。
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取5 ml金线莲原始液，以2% NaOH溶液将其调至pH 8～9，加热至85 ℃。将CaCl2固体调至5%（50 g/L）的浓度，煮沸30 min，冷却至室温并过滤，用稀盐酸将滤液调至pH 7，加入4倍体积无水乙醇放置过夜，4000 r/min下离心10 min，得多糖沉淀。加水溶解重复上述操作3次，所得沉淀物加水溶解，于1000 ml的量瓶中定容，得脱蛋白供试品溶液。
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取5 ml金线莲原始液，在沸腾(90 ℃)条件下，用2%NaOH溶液将多糖溶液调节到pH 9～10。加入NaCl固体，浓度调至5%（50 g/L），然后混合煮沸30 min。冷却至室温并过滤，上清液用稀盐酸调至pH 7。添加4倍体积无水乙醇放置过夜沉淀多糖，在4000 r/min下离心10 min，弃上清液得多糖沉淀。加水溶解重复上述操作3次，所得沉淀物加水溶解，于1000 ml的量瓶中定容，得脱蛋白供试品溶液。
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取5 ml金线莲原始液，加入10% TCA溶液将其调节到pH 3，静置过夜。样品4000 r/min离心10 min，沉淀物丢弃，上清液加4倍体积无水乙醇放置过夜，在4000 r/min下离心10 min，弃去上清液得多糖沉淀。加水溶解重复上述操作3次，所得沉淀物加水溶解，于1000 ml的量瓶中定容，得脱蛋白供试品溶液。
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取5 ml金线莲原始液，以金线莲水提溶液：正丁醇：氯仿按1：1：4的比例进行除蛋白，振荡器振荡20 min 后，4000 r/min 转速离心 5 min，弃去下层有机相。该过程重复3次，上层水相添加4倍体积无水乙醇放置过夜，在4000 r/min下离心10 min，弃去上清液得多糖沉淀物，所得沉淀物加水溶解，于1000 ml的量瓶中定容，得脱蛋白供试品溶液。
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以“紫外分光光度法”对蛋白含量进行测定[5],
蛋白质浓度C(mg/ml) = 1.45A280−0.74A260
多糖损失率=[(供试品多糖含量－脱蛋白供试品多糖含量)/供试品多糖含量]×100%
蛋白脱除率=[(供试品蛋白含量－脱蛋白供试品蛋白含量)/供试品蛋白含量]×100%
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参考相关文献，按“2.2” 项下使用不同提取方法制得对应的供试品，比较多糖得率，结果如表2。
表 2 提取金线莲多糖方法比较
实验结果表明，超声提取和酶提取均能获得较高的多糖提取率，由于酶价格昂贵，超声提取操作简便，且能获得高提取率，故选择超声提取进行下一步研究。
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如图1所示：①随着提取温度的增加，提取得率逐渐增加，在50 ℃提取得率达到最大值，后随着温度的增加提取率逐渐下降并趋于稳定，故初步确定提取温度40～60℃作为进一步响应面考察设计的水平；②在超声功率为300 W时多糖提取率最高，实验结果显示，随着超声功率的增加，多糖提取率先上升后下降，但影响相对较小，故选定功率为300 W进行下一步分析；③以超声提取30 min，提取率最高，故初步确定超声时间20～40 min作为进一步响应面考察设计的水平；④料液比为1∶10时，多糖提取率最高，随着料液比的增加，提取率稍有下降且趋于平稳，故初步确定料液比1∶5～1∶15作为进一步响应面考察设计的水平；⑤随着提取次数的增加，提取率逐渐降低，提取3次后，多糖已基本提取完全，考虑实际操作及原料等，选定提取2次进行下一步分析。
图 1 单因素实验考察结果
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在单因素考察的基础上，利用软件Design-Expert. V 8.0.6.1中Box-Behnken试验原理，设计3因素3水平实验。响应值设计方案及结果见表3，方差分析见表4。对数据分析后得到回归方程为：
表 3 Box-Behnken试验设计方案及结果
实验号 A B C 多糖提取率(%) 1 −1.000 0.000 −1.000 12.22 2 1.000 0.000 −1.000 10.16 3 0.000 1.000 −1.000 13.13 4 0.000 0.000 0.000 13.03 5 1.000 0.000 1.000 12.98 6 0.000 −1.000 −1.000 10.86 7 −1.000 −1.000 0.000 11.19 8 0.000 0.000 0.000 13.21 9 0.000 1.000 1.000 12.28 10 0.000 −1.000 1.000 12.25 11 −1.000 1.000 0.000 11.88 12 1.000 −1.000 0.000 11.08 13 0.000 0.000 0.000 13.12 14 0.000 0.000 0.000 12.85 15 −1.000 0.000 1.000 10.83 16 1.000 1.000 0.000 12.11 17 0.000 0.000 0.000 13.21 表 4 模型回归系数显著性检验结果
来源 平方和 自由度 均方 F P 模型 15.41 9 1.71 51.68 < 0.0001 A 5.513×10−3 1 5.513×10−3 0.17 0.6955 B 2.02 1 2.02 60.98 0.0001 C 0.49 1 0.49 14.64 0.0065 AB 0.029 1 0.029 0.87 0.3814 AC 4.43 1 4.43 133.76 < 0.0001 BC 1.25 1 1.25 37.87 0.0005 A2 4.65 1 4.65 140.33 < 0.0001 B2 0.92 1 0.92 27.87 0.0011 C2 0.99 1 0.99 29.99 0.0009 残差 0.23 7 0.033 失拟项 0.14 3 0.047 2.07 0.2463 纯误性 0.091 4 0.023 总离性 15.64 16 多糖提取率(R)=13.08+0.026A+0.50B+0.25C+0.085AB+1.05AC−0.56BC−1.05A2−0.47B2−0.49C2。
由表3知，回归模型有很好的显著性（P< 0.0001），说明二项式方程拟合良好，模型二项式方程失拟项不显著（P=0.2463），说明未知因素对实验干扰较小，拟合的相关系数r=0.9926，模型可信度良好，故可运用此模型实现超声提取金线莲多糖最佳工艺的分析探究。
根据拟合方程绘制响应面图谱，响应面分析的等高线图和响应面图（图2、图3），AC、BC具有相互影响，各图为料液比（A）、超声时间（B）、超声提取温度（C）中任意一个变量取零水平，其余变量对金线莲多糖提取率的交互作用影响。由图2、图3可以看出，提取时间对提取率影响最为显著，三者的主效应关系为：提取时间(B)>提取温度(A)>料液比（C），其中料液比与提取温度的响应曲面最为陡峭，证明料液比与提取温度的交互作用最为强。
图 2 料液比与提取温度的等高线及响应面图
图 3 超声提取时间与提取温度的等高线及响应面图
通过Design-Expert. V 8.0.6.1软件对二项式回归方程进行最优值的计算，确定理论上的多糖提取最佳工艺：料液比为1∶9.88，超声提取温度为48.76 ℃，超声提取时间为36.08 min，超声提取次数为2次，超声功率为300 W，其多糖提取的理论得率为13.22%，考虑到实际操作的可行性，最佳工艺定为料液比1∶10，超声提取温度48 ℃，超声提取时间36 min，超声提取次数为2次，超声功率为300 W。为验证实验结果，进行3组平行实验，多糖提取得率分别为13.14%、13.05%、13.20%，其RSD为0.57%，提取得率的均值13.13%与理论值13.22%偏差0.09%，表明优化后的提取工艺可行，适用于金线莲中多糖的提取。
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按“2.6”项下的方法进行脱蛋白操作，得出多糖损失率及蛋白脱除率结果如表5。实验结果表明，NaOH-CaCl2法脱蛋白可以获得较高蛋白脱除率，同时也能获得最低的多糖损失率。
Optimization and purification of extraction of polysaccharides from Anoecto-chilus roxburghii
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摘要:
目的 以响应面法优化超声提取金线莲多糖的工艺，同时，对多糖纯化中除蛋白方法进行考察。 方法 以多糖提取率为检测指标，在单因素考察的基础上采用Box-Behnken实验设计及响应面法对料液比、超声时间、超声提取温度3个因素进行优化；以多糖保留率和蛋白脱除率对Sevage试剂法、TCA法、盐法（NaOH-CaCl2法和NaOH-NaCl法）、盐酸法5种脱蛋白方法进行考察。 结果 金线莲多糖最佳提取工艺为: 料液比1∶10，超声提取温度48 ℃，超声提取时间36 min，超声提取次数2次，超声功率为300 W，该条件下金线莲多糖提取率达到了13.13%；同时以NaOH-CaCl2法脱蛋白，多糖损失率为18.74%，蛋白脱除率为95.62%。 结论 超声提取操作简单，优化后提取方法能够取得较高提取率，NaOH-CaCl2法脱蛋白能够获得较高蛋白脱除率及多糖保留率，该方法适用于金线莲多糖活性成分的开发研究。 Abstract:Objective To optimize the process of ultrasonic extraction of polysaccharide in Anoectochilus roxburghii and to investigate the method of protein removal. Methods The extraction rate of polysaccharide was used as the detection index. On the basis of single factor investigation, Box-Behnken experimental design and response surface method were used to optimize the three factors of material-liquid ratio, ultrasonic time and ultrasonic extraction temperature. The five deproteinization methods including Sevage reagent method, TCA method, salt method (NaOH-CaCl2 and NaOH-NaCl) and hydrochloric acid method were investigated with the retention rate of polysaccharide and protein removal rate. Results The optimal extraction conditions of polysaccharide from Anoectochilus roxburghii were as follows: liquid-to-solid ratio was 10∶1, extraction temperature was 48 ℃ and extraction time was 36 min with extraction 2 times, ultrasonic power was 300 W, the extraction rate was 13.13%. NaOH-CaCl2 deproteinized methods∶ the loss rate of polysaccharide was 18.74%, and the removal rate of protein was 95.62%. Conclusion Ultrasonic extraction is easy to operate, and the optimized extraction method can achieve a high extraction rate. NaOH-CaCl2 deproteinization methods can get high protein removal rate and polysaccharide retention rate. This method is suitable for the research and development of the active components of the polysaccharides from Anoectochilus roxburghii. -
在我国，肺炎链球菌是引起中国婴幼儿和老年人发病和死亡的重要病因，是社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia, CAP)、菌血症、儿童化脓性脑膜炎的常见病原菌[1]。2012年亚太地区病原体耐药监测网络数据显示，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, S.p)在亚洲地区总体多重耐药比例为59.3%，而在中国的多重耐药比例高达83.3%[2]，且部分地区肺炎链球菌耐药率呈逐年增长趋势[3-4]。
莫西沙星属第四代喹诺酮类抗菌药物，DNA拓扑异构酶抑制剂，抗菌谱广，对常见呼吸道病菌特别是肺炎链球菌抗菌作用强大，2016年中国成人CAP诊治指南推荐可选择莫西沙星等喹诺酮类药物作为初始经验性抗感染药物[5]。莫西沙星所有适应证口服给药的常规剂量均为400 mg/d。随着莫西沙星上市以来临床研究的深入，不良反应事件也有所增加[6]。本研究采用微透析方法获取肺炎大鼠肺组织间液中的游离药物浓度，旨在模拟莫西沙星在感染患者靶器官中的药动学变化，探究正常与感染状态下的靶器官药物分布的差异，分析链球菌感染状态下莫西沙星体内代谢动力学的变化。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
取Wistar大鼠24只，雄性，SPF级，4~6周龄，其体质量为200~220g（上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号：2007000514232）。随机分为健康组及肺炎组各12只，两组大鼠体质量分别为（210.92±5.95）g和（208.58±5.33）g，无统计学差异（P>0.05）。实验前各组大鼠禁食12 h过夜，动物饲养遵从中华人民共和国实验动物使用协议。
1.2 实验设备与试剂
CMA402型微量泵、CMA820型微量收集器、血管探针、肺探针（瑞典 CMA公司）；ALC-V8S小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司）；安捷伦1100高效液相色谱仪，配有Chemstation工作站；XW-80型涡旋混合器（其林贝尔）；Thermo LEGEND Micro 17高速离心机（赛默飞）；METTLER AE240电子天平（梅特勒）。莫西沙星标准品（中国食品药品检定研究院，纯度>99%，批号1448606），莫西沙星片（拜耳医药保健有限公司，批号BJ13520）；甲醇（HPLC级，Burdick & Jackson公司），乙腈（HPLC级，Merck公司），甲酸（Fluka公司，瑞士）。
1.3 实验菌株
肺炎链球菌由第二军医大学附属长海医院微生物实验室提供，于接种前1 d接种于血琼脂平板，置于37 ℃ CO2培养箱中培养24 h，用无菌生理盐水稀释成含细菌浓度为0.6×108 cfu/ml的混悬液，备用。质控菌株为肺炎链球菌标准株（ATCC49619 上海宝米科生物科技有限公司提供）。
1.4 实验方法
1.4.1 动物处理
造模：采用气管穿刺法注入菌液建立肺炎大鼠模型。腹腔麻醉后，切开颈部皮肤暴露气管，经气管软骨环间穿刺，注入肺炎链球菌混悬液 0.2 ml（约0.12×108cfu/只），将大鼠直立位20 s，再使大鼠保持右侧卧位10 min，促使菌液充分流入右肺。于接种后第5~7天建立大鼠右侧肺炎模型。所有大鼠实验结束后行病理解剖及肺组织匀浆培养证实建模成功。
1.4.2 探针植入
取造模成功的肺炎大鼠麻醉后，固定于保温垫，在气管上段做一T型切口，插入气管导管，接小动物呼吸机辅助通气，频率75~80次/min，潮气量2.5 ml。于大鼠右侧胸壁做斜行切口，止血钳离断第5肋骨前肋，充分暴露右肺。用注射器针尖稍刺破右肺中叶脏层胸膜，将肺探针向肺门方向钝性植入肺组织，复位肺叶，固定探针并关闭胸腔。切开左侧股静脉，植入血管探针推送至下腔静脉固定。
1.5 莫西沙星药动学分析
1.5.1 给药及样本收集
取莫西沙星1片，刮去包衣后磨成细粉末状，加入0.5%羧甲基纤维素钠无菌注射用水溶解，制成混悬溶液，浓度为10 mg/ml。
两组大鼠分别通过灌胃给药的方式注入莫西沙星混悬液，给药剂量按4 ml/kg计算，5 s内注入完毕，立即开始收集血浆及肺组织透析样品。采用HPLC法分别测定前5 h的莫西沙星浓度。
1.5.2 HPLC法测定透析液中莫西沙星含量
(1)色谱条件 色谱柱：Agilent SB-C18 (250 mm×4.6 mm，5.0 µm)，流动相：乙腈: 0.1%甲酸水（25:75，V/V）；流速：1.0 ml/min，分析时间10 min，柱温：30 ℃，进样量：5 μl，检测波长295 nm。
(2)透析液处理 精密量取100 μl透析液样品，置1.5 ml塑料离心管中，加入200 μl甲醇，漩涡混合30 s后，12000 r/min离心10 min，取200 μl上清液于进样瓶中，进样5 μl进行HPLC分析。
(3)标准曲线与线性范围 取空白透析液100 μl，精密加入莫西沙星标准对照品溶液20 μl旋涡混匀，配成莫西沙星浓度分别为5.00、2.00、1.00、0.50、0.20、0.10及0.05 µg/ml标准含药肺透析液，除不加200μl醇外，其余按“透析液样品处理方法”项下操作，进样分析，记录色谱图，计算莫西沙星峰面积。莫西沙星以肺透析液中待测物浓度(X)为横坐标，莫西沙星峰面积(Y)为纵坐标，求得回归方程：
Y=14.273X+0.555，r=0.999
结果表明莫西沙星在0.05~5.00 µg/ml浓度范围内线性关系良好。
1.5.3 定量限与检测限
配制莫西沙星浓度为0.05 µg/ml的标准含药透析液5份，进行分析，依照当日标准曲线方程求得实测浓度为（0.051 ± 0.004）µg/ml，准确度90.8%~116.66%。结果表明莫西沙星在血浆中的定量下限为0.05 µg/ml，S/N>10，线性关系良好。经逐级稀释，按S/N>3测得莫西沙星在血浆中的检测限为0.015 µg/ml。
1.5.4 精密度试验
制备含莫西沙星的浓度分别为0.05、0.50、5.00 µg/ml的标准含药肺透析液（每个浓度做5份），按“肺透析液样品预处理方法”项下操作，进样分析，连续做3 d，计算日内和日间精密度。测得日内精密度RSD分别为6.6281%、2.6247%、2.8282%；日间精密度分别为2.3793%、1.0271%、2.4221%，均小于10%，符合精密度要求。
1.5.5 准确度试验
以相对回收率表示，按“标准曲线制备”项下制备含有莫西沙星浓度分别为0.05、0.50、5.00 µg/ml的标准含药肺透析液，按“肺透析液样品预处理方法”项下操作，进样分析，记录色谱峰面积，代入标准曲线方程，计算实测浓度与实际浓度的比值即为相对回收率。结果分别为105.21%、104.82%、106.45%，均在80%~120%范围内，且RSD<10%，符合要求。
1.5.6 稳定性试验
莫西沙星浓度分别为0.05、0.5、5.0 µg/ml的肺透析液样品各3份，分别进行室温、4 ℃及冻融稳定性考察，RSD均<10%。结果表明样品在上述条件下保持稳定。
1.6 数据分析
采用反向透析法测定探针回收率（Rdial），体内实际药物浓度（Cu）由所得透析液浓度（Cm）按公式计算，Cu=Cm/Rdial转化获得。采用Pksolver 2.0软件，以非房室模型计算以下药动学数据：曲线下面积（AUC）、平均滞留时间（MRT）、药物消除半衰期（t1/2）、药物峰浓度（Cmax）、药物在肺部的穿透率（PR=C肺/C血液）、药物的分布系数（AUC肺/AUC血液）。
采用SPSS 17.0版统计学软件分析，计量资料采用均值±标准差(
$\bar{x}\pm s$ )表示。药动学参数先经方差齐性分析，符合正态分布者，采用两样本t检验，P<0.05表示其差异有统计学意义。2. 实验结果
2.1 正常大鼠和肺炎大鼠肺组织药-时曲线
经灌胃给予莫西沙星后，正常大鼠及肺炎大鼠肺组织药物浓度迅速上升，约1 h达峰，随后两者同步下降。整个实验过程肺炎大鼠肺组织浓度均高于正常大鼠，肺炎大鼠肺组织Cmax约为正常大鼠的3.4倍。两组大鼠肺组织中莫西沙星的浓度-时间数据分布情况见图1。
2.2 正常大鼠和肺炎大鼠血浆药-时曲线
灌胃给予莫西沙星后，正常大鼠及肺炎大鼠血浆游离药物浓度明显上升，Cmax无明显差异，两组大鼠血浆中莫西沙星的血药浓度-时间数据分布情况见图2。
2.3 肺组织穿透率（PR）
计算各时间点在肺组织中的穿透率(PR值)，正常大鼠和肺炎大鼠肺组织穿透率最高分别为0.27和1.87；最低分别为0.16和0.89，平均值分别为0.18±0.10和1.26±0.32(P<0.05)，见图3。
2.4 主要药动学参数
大鼠灌胃莫西沙星后，正常大鼠及肺炎大鼠药动学参数采用非房室模型进行分析，结果见表1。
表 1 灌胃给予莫西沙星的正常大鼠与肺炎大鼠血浆和肺组织中的药动学参数参数 单位 血浆 肺组织 正常组 肺炎组 正常组 肺炎组 Lambda_z 1/h 0.2±0.13 0.32±0.01 0.4±0.15 0.21±0.06 t1/2 h 5.27±4.38 2.15±0.07 1.9±0.63 3.39±0.79 Tmax h 0.67±0.14 1±0 0.89±0.2 0.94±0.1 Cmax μg/ml 4.94±0.98 4.83±0.05 1.42±0.05 4.84±0.02## Tlag h 0±0 0±0 0±0 0±0 Clast_obs/Cmax 0.02±0.03 0.27±0.04## 0.18±0.09 0.33±0.01 AUC 0-t μg/ml·h 22.33±2.02 12.88±1.19# 3.06±1.07 13.16±0.53## AUC 0-inf_obs μg/ml·h 23.51±1.41 16.96±1.71 3.77±1.29 20.93±1.35 AUC0-t/0-inf_obs 0.95±0.08 0.76±0.01 0.81±0.09 0.63±0.07# AUMC 0-inf_obs μg/ml·h2 151.89±92.76 62.01±8.56 11.93±5.14 107.01±25.39# MRT 0-inf_obs h 6.41±3.77 3.65±0.14 3.17±0.77 5.07±0.92 Vz/F_obs (mg/kg)/(μg/ml) 13.51±10.9 7.76±0.97 33.98±20.28 9.74±1.72 CL/F_obs (mg/kg)/(μg/ml)·h 1.79±0.11 2.49±0.26# 12.02±3.9 2.01±0.13 #P<0.05，##P<0.01，与正常组比较 正常大鼠及肺炎大鼠肺组织Cmax分别为（1.42±0.05）μg/ml、（4.84±0.02）μg/ml（P<0.01），t1/2分别为（1.9±0.63）h、（3.39±0.79）h（P>0.05），一阶矩曲线下面积AUMC分别为（11.93±5.14）μg/ml·h2、（107.01±25.39）μg/ml·h2（P<0.05），AUC0-t分别为（3.06±1.07）μg/ml·h、（13.16±0.53）μg/ml·h（P<0.01）
2.5 血液中药动学和药效学(PK/PD)参数比较
结合相关报道的最低抑菌浓度(MIC)[7]及防耐药突变浓度(mutant prevention concentration，MPC)[8]值，将本实验结果Cmax和AUC0-∞与之相比，莫西沙星对肺炎链球菌的PK/PD参数见表2 [莫西沙星对肺炎链球菌的MIC90为0.125 mg/L；莫西沙星对肺炎链球菌的MPC90为2 mg/L]。
表 2 正常大鼠和肺炎大鼠体内莫西沙星的PK/PD参数比较PK/PD参数 血浆 肺组织 正常组 肺炎组 肺炎组/正常组 正常组 肺炎组 肺炎组/正常组 Cmax/MIC90 39.52 38.64 0.98 11.36 38.72 3.41 AUC0-∞/MIC90 188.08 135.68 0.72 30.16 167.44 5.54 Cmax/MPC90 2.47 2.42 0.98 0.71 2.42 3.41 AUC0-∞/MPC90 11.76 8.48 0.72 1.89 10.47 5.54 3. 讨论
我国的多中心研究结果显示，莫西沙星对肺炎链球菌的敏感度达99%，MIC90为0.125 mg/L[7]。莫西沙星和青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类抗菌药物均无交叉耐药性，口服生物利用度总计91%，可以被快速吸收并分布到血管外隙，稳态时表观分布容积可以达到21/kg。血浆蛋白结合率为45%，其在肺、窦及炎性损伤组织的药物浓度超过血药浓度。相关研究表明，口服莫西沙星400 mg后，在人肺组织[8]、微支气管镜肺泡灌洗液[9]、痰液[10]中的药时曲线与在血浆中的趋势相似，药物在以上样本中的浓度高于血浆，显示出良好组织穿透性，本研究的前期结果也得出相似的结论[11]。
莫西沙星为浓度依赖性抗菌药，抗生素后效应(PAE)较长，喹诺酮类治疗革兰阳性菌所需的AUC0-24h/MIC靶值为30～40。当PK/PD参数Cmax/MIC≥8～10和AUC0～24h/MIC≥125时可以明显减少氟喹诺酮类药物治疗革兰阴性杆菌、包括铜绿假单胞菌耐药菌出现的危险性[12]。本研究结果表明，莫西沙星在正常及肺炎链球菌感染大鼠血浆和肺组织的Cmax/MIC均远大于8～10，在肺炎大鼠的血浆及肺组织的AUC0-24h/MIC为135.68和167.44，正常大鼠血浆为188.08，远大于125。
耐药突变选择窗（MSW）是指防耐药突变浓度（MPC）与最低抑菌浓度（MIC）之间的浓度范围；当治疗药物浓度高于MPC时，在保证疗效的同时也能防止耐药突变；药物浓度如果在突变选择窗内，即使抑制了敏感菌生长，临床治疗可能成功，但还可能导致耐药突变。近年来在优化喹诺酮类给药方案的研究中，常需评价抗菌药物在耐药突变窗中的存在时间百分比和MPC值。TMSW<20%是预测防止出现耐药的有效参数，本研究药动学参数显示，莫西沙星在正常大鼠及肺炎大鼠的血浆和肺组织中的浓度基本保持在莫西沙星耐药突变选择窗之外。
药物常规剂量是在群体药动学结果和有限临床实践上建立的，大多数患者按照常规剂量会获得较好的临床疗效和安全性，但患者个体差异，生理病理状态都会对药动学参数产生一定影响。近年来，关于抗菌药物PK/PD的研究进展迅速，研究发现重症感染患者与健康人的PK/PD数据明显不同，例如万古霉素在重症感染患者群体分布相较正常人群快，患者存在高代谢和高循环动力状态，因而需要对治疗药物监测与给药方案的调整[13]。一项大样本临床研究表明莫西沙星最常见的药物不良反应为胃肠道症状，口服剂量400 mg/d，发生恶心、腹泻和头晕不良反应事件概率分别为7.1%、5.2%和2.6%[14]。国内也有莫西沙星不良反应的文献报道[15-16]，此外，莫西沙星的中枢神经系统潜在危险与其他喹诺酮类药物一致[17],因此老年人、中枢神经系统损伤的老年患者（如癫痫、明显动脉硬化）应当谨慎使用，必要时减量，但目前尚无莫西沙星剂量调整的相关依据。
机体发生感染后,病原菌释放内毒素和外毒素,诱发的全身炎症反应,大量的细胞因子炎性介质释放,引起机体内环境稳态失衡,血管内皮破坏和毛细血管通透性增加,导致体液向第三间隙渗漏迁移[18]，这一过程会使组织间分布的亲水性抗生素药物稀释，血浆和组织药物浓度下降，对亲脂性药物影响不大[19]。此外药物在体内以一定比例与血浆蛋白结合, 感染状态下血管通透性增加，蛋白向血管外间隙渗漏增加，以及肝脏合成减少，血浆白蛋白减低引起药物游离比例增多，这可能会增加组织内抗生素分布而增加抗感染效果，但同时可能增加药物的毒性作用[20]，莫西沙星是表观分布容积较高的脂溶性药物，在感染状态肺组织浓度较健康状态增高，可能与血管通透性增加，血浆蛋白结合率降低有关。
有研究表明喹诺酮类抗菌药物马波沙星在感染小鼠肺组织的药物浓度是血浆药物浓度的2~3倍[21]，多杀性巴氏杆菌感染显著增加了马波沙星的AUC、Cmax、MRT，这与本研究结论相似。肺炎模型大鼠与正常大鼠相比，莫西沙星在血浆中的浓度没有显著差异，而在肺炎大鼠肺组织中的浓度明显高于正常大鼠，最高为正常大鼠肺组织的3.4倍，这提示在肺炎链球菌感染的病理状态下，莫西沙星的肺组织穿透率升高。
莫西沙星在正常小鼠和肺炎链球菌感染小鼠的血浆和肺组织浓度均能够达到杀灭细菌并防止产生耐药性的要求。在感染状态下机体高敏、肝肾功能减退等病理因素可能增加莫西沙星不良反应的发生概率，而在肺炎病理状态下，莫西沙星肺组织AUC0-24h/MIC达到167.44，目前实验数据表明小鼠肺炎链球菌感染时莫西沙星肺组织浓度远高于健康状态，也远大于MIC和MPC，理论上有一定剂量调整的空间，其机制和具体方案还有待进一步实验研究，为优化特殊病人给药方案，调整药物剂量，减少药物不良反应提供可参考的数据。
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表 3 Box-Behnken试验设计方案及结果
实验号 A B C 多糖提取率(%) 1 −1.000 0.000 −1.000 12.22 2 1.000 0.000 −1.000 10.16 3 0.000 1.000 −1.000 13.13 4 0.000 0.000 0.000 13.03 5 1.000 0.000 1.000 12.98 6 0.000 −1.000 −1.000 10.86 7 −1.000 −1.000 0.000 11.19 8 0.000 0.000 0.000 13.21 9 0.000 1.000 1.000 12.28 10 0.000 −1.000 1.000 12.25 11 −1.000 1.000 0.000 11.88 12 1.000 −1.000 0.000 11.08 13 0.000 0.000 0.000 13.12 14 0.000 0.000 0.000 12.85 15 −1.000 0.000 1.000 10.83 16 1.000 1.000 0.000 12.11 17 0.000 0.000 0.000 13.21 
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表 4 模型回归系数显著性检验结果
来源 平方和 自由度 均方 F P 模型 15.41 9 1.71 51.68 < 0.0001 A 5.513×10−3 1 5.513×10−3 0.17 0.6955 B 2.02 1 2.02 60.98 0.0001 C 0.49 1 0.49 14.64 0.0065 AB 0.029 1 0.029 0.87 0.3814 AC 4.43 1 4.43 133.76 < 0.0001 BC 1.25 1 1.25 37.87 0.0005 A2 4.65 1 4.65 140.33 < 0.0001 B2 0.92 1 0.92 27.87 0.0011 C2 0.99 1 0.99 29.99 0.0009 残差 0.23 7 0.033 失拟项 0.14 3 0.047 2.07 0.2463 纯误性 0.091 4 0.023 总离性 15.64 16
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