-
失眠是现代社会常见的临床症状之一,对人们的身心健康和生活质量造成严重影响,同时还会伴发多种躯体和精神疾病。随着社会的高速发展,工作压力大,生活不规律,导致失眠的发病率逐年上升且呈现低龄化趋势,引起社会各界的高度重视[1]。有研究表明,我国大约有45.5%的人群有不同程度的睡眠障碍[2]。夜宁胶囊为联勤保障部队第904医院(本院)自制制剂,该制剂是《中华人民共和国药典》(一部)2020版收载的夜宁糖浆[3]的改剂型,主要由合欢皮、灵芝、首乌藤等7味药材组成,具有镇静、养心、安神的功效,用于改善心血不足所致的失眠、多梦、头晕、乏力。该文通过研究夜宁胶囊对小鼠自主活动、协同阈上/阈下戊巴比妥钠催眠作用以及小鼠脑组织中γ-氨基丁酸(GABA)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)含量变化的影响,验证夜宁胶囊的镇静催眠作用,并初步对其作用机制进行探讨。
-
雄性ICR小鼠[体质量为(20±2) g,SPF级 ,常州卡文斯实验动物有限公司,动物合格证号:SCXK(苏)2016-0010]。动物在温度为25 ℃±2 ℃,湿度为55%±10%的环境中适应性饲养7 d,自由摄取饮用水和标准饲料,保持昼夜节律和环境干净整洁。
-
夜宁胶囊(批号:2020081,本院院内自制制剂);艾司唑仑片(批号:20200111,常州四药);戊巴比妥钠(批号:191201,Sigma分装);生理盐水(批号:020100201,四川科伦药业股份有限公司);GABA ELISA试剂盒(货号:xy-E12157,信裕生物);NE ELISA试剂盒(货号:MBS2600834,Mybiosource);DA ELISA试剂盒(货号:MBS269234,Mybiosource);5-HT ELISA试剂盒(货号:MBS266457,Mybiosource)。
-
电子分析天平(XS105型,梅特勒托利多仪器有限公司);超声波清洗机(FQ-1006HTD型,杭州法兰特超声波科技有限公司);旋转蒸发器(RE-5C式,上海青浦沪西仪器厂);电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂); CT-C-O型烘箱(常州市范氏干燥设备有限公司);自制开野实验敞箱(50 cm×50 cm×30 cm),箱内为黑色,箱底画出25个同等面积的方格;酶标仪(ELX 800型,Bio-Tex);离心机(80-2型,上海手术器械厂);可调高速匀浆机(FSH-2A型,常州翔天实验仪器厂)。
-
夜宁胶囊的制法为:浮小麦加水浸泡2 h,煮沸,于80 ℃~90 ℃温浸2次,每次2 h,滤过合并温浸液;灵芝粉碎成粗粉,用95%乙醇浸泡7 d,压榨滤过,滤液减压浓缩干燥,粉碎成细粉,过80目筛,备用;上述灵芝粗粉药渣与合欢皮、首乌藤、大枣、女贞子、甘草加水煎煮滤过,滤液和上述温浸液合并,减压浓缩干燥,碎成细粉,过80目筛,加入灵芝细粉,混匀装胶囊,即得夜宁胶囊,规格为400 mg/粒,推荐服用量约10粒/日。按照一个成年人体质量60 kg,服用剂量约为60 mg/kg,换算得到小鼠的中剂量约为600 mg/kg。将ICR小鼠随机分成5组(每组10只):① 空白对照组(相应体积的溶剂灌胃);② 艾司唑仑组(0.8 mg/kg);③ 夜宁胶囊低剂量组(400 mg/kg,YNL组);④ 夜宁胶囊中剂量组(600 mg/kg,YNM组);⑤ 夜宁胶囊高剂量组(800 mg/kg,YNH组)。每天下午5点灌胃给药,连续灌胃8 d。
-
在第6天给药30 min后,将小鼠放置在开野实验敞箱中先适应1 min,待适应时间结束后观察小鼠5 min内自主活动,记录其活动次数,实验过程中保持环境安静。自主活动包括:① 舔爪、清洗整理身体、擦脸均可记为清洗身体1次;② 四肢全部进入一格记为水平走格1次;③ 前肢攀附箱壁或离箱底站立记为站立1次。每只小鼠录像结束后需清理敞箱,以免对下一只小鼠造成干扰。
-
基于前期研究戊巴比妥钠剂量的预实验,选定腹腔注射戊巴比妥钠溶液的阈下剂量为35 mg/kg。在第7天给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠溶液(35 mg/kg),观察15 min内小鼠睡眠情况,若小鼠翻正反射消失且持续1 min以上认为进入睡眠状态,根据睡眠小鼠只数,计算入睡率。入睡率(%)=(进入睡眠动物只数/总动物只数)×100%。
-
基于前期研究戊巴比妥钠剂量的预实验,选定腹腔注射戊巴比妥钠溶液的阈上剂量为41 mg/kg。在第8天给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠溶液(41 mg/kg),注射后立刻计时并观察,记录小鼠入睡潜伏期和睡眠时长。评判标准:① 入睡潜伏期指的是小鼠从注射阈上剂量戊巴比妥钠至翻正反射消失的时间;② 睡眠时长指小鼠从翻正反射消失至翻正反射恢复的时间。
-
行为学实验结束后,在末次给药24 h后脱臼处死小鼠,取出小鼠大脑,用冰冷生理盐水进行冲洗,滤纸吸干后称重。随后匀浆机匀浆(4℃),以4 000 r/min,离心10 min,收集上清液。按照试剂盒说明书操作,采用ELISA法测定小鼠脑组织中GABA、5-HT、DA、NE的水平。
-
采用SPSS 19.0 软件对实验数据进行分析处理。实验数据组间比较采用单因素方差分析法,组间两两比较采用LSD-t检验;阈下剂量戊巴比妥钠实验数据采用Fisher精确检验分析。实验结果均用(
$ \bar{x} $ ± SEM)表示,当P<0.05时即认为其有统计学意义。 -
实验结果如表1所示,与空白对照组相比,艾司唑仑组(P<0.05)、YNM组(P<0.05)、YNH组(P<0.01)均显著降低了小鼠自主活动的次数。由此表明,YNM组和YNH组具有明显的镇静作用。
表 1 夜宁胶囊对小鼠自主活动的影响(
$ \bar{x} $ ±SEM,n=10)组别 剂量(mg/kg) 小鼠自主活动次数 空白对照组 − 188.90±7.78 艾司唑仑组 0.8 160.50±7.10* YNL组 400 169.60±13.15 YNM组 600 156.80±8.34* YNH组 800 151.70±7.28** 注:*P<0.05,** P<0.01,与空白对照组比较。 -
实验结果如表2所示,与空白对照组相比,艾司唑仑组(P<0.001)、YNM组(P<0.05)、YNH组(P<0.01)的小鼠入睡率显著增加,结果表明YNM组和YNH组具有明显的镇静催眠作用。
表 2 夜宁胶囊对阈下剂量戊巴比妥钠镇静催眠作用的影响(n=10)
组别 剂量(mg/kg) 入睡数量(只) 入睡比率(%) 空白对照组 − 0 0 艾司唑仑组 0.8 9 90*** YNL组 400 1 10 YNM组 600 5 50* YNH组 800 7 70** 注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,与空白对照组比较。 -
实验结果如表3所示,与空白对照组相比,艾司唑仑组(P<0.01)、YNM组(P<0.05)、YNH组(P<0.01)均显著增加了小鼠的睡眠时长;艾司唑仑组(P<0.05)、YNM组(P<0.05)、YNH组(P<0.05)显著缩短了小鼠的入睡潜伏期。结果表明YNM组和YNH组具有明显的镇静催眠作用。
表 3 夜宁胶囊协同阈上剂量戊巴比妥钠对小鼠睡眠时长和入睡潜伏期的影响(
$ \bar{x} $ ±SEM,n=10)组别 剂量(mg/kg) 睡眠潜伏期(t/min) 睡眠时长(t/min) 空白对照组 − 5.69±0.69 8.20±3.23 艾司唑仑组 0.8 3.86±0.45* 34.20±5.89** YNL组 400 4.73±0.18 17.86±3.63 YNM组 600 4.05±0.17* 22.15±4.66* YNH组 800 3.83±0.21* 28.26±4.38** 注:*P<0.05,**P<0.01,与空白对照组比较。 -
各组小鼠脑组织中各神经递质的检测结果如表4所示,与空白对照组相比:艾司唑仑组(P<0.01)和YNH组(P<0.05)小鼠脑组织中GABA含量显著增加;艾司唑仑组(P<0.05)和YNH组(P<0.05)小鼠脑组织中5-HT含量显著增加;艾司唑仑组(P<0.001)和YNH组(P<0.05)小鼠脑组织中DA含量显著增加;艾司唑仑组(P<0.01)和YNH组(P<0.01)小鼠脑组织中NE含量显著增加。结果表明,YNH组能显著性升高小鼠脑组织中的GABA、5-HT、DA和NE水平。
表 4 夜宁胶囊对小鼠脑组织中GABA、5-HT、DA和NE水平的影响(
$ \bar{x} $ ±SEM,n=10)组别 剂量(mg/kg) GABA含量(μmol/g) 5-HT含量(μg/g) DA含量(ng/g) NE含量(ng/g) 空白对照组 − 1.08±0.11 0.52±0.11 153.61±16.88 66.74±6.14 艾司唑仑组 0.8 2.33±0.28** 1.16±0.18* 327.14±22.77*** 155.14±19.12** YNL组 400 1.02±0.12 0.52±0.09 152.72±26.68 80.50±7.25 YNM组 600 1.17±0.20 0.75±0.13 168.17±14.90 91.76±12.66 YNH组 800 1.80±0.21* 1.02±0.14* 235.99±27.31* 116.31±13.02** 注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,与空白对照组比较。 -
目前临床上治疗失眠的镇静催眠药物主要是以苯二氮䓬类为主的西药,长期服用此类药物不但带来严重的不良反应,还会产生明显的耐受性、依赖性[5]。而中医药在治疗失眠方面具有疗效好、安全性高和无成瘾性等特点,相较于西药有着独特优势,是目前研究镇静催眠药物的新方向[6]。夜宁胶囊的主要成分为合欢皮、首乌藤、灵芝、大枣、浮小麦、女贞子、甘草,有安神、养心之功效,用于治疗头昏失眠、神经衰弱、血虚多梦[7]。其中合欢皮舒肝解郁、悦心安神,用于治疗烦躁不宁、失眠多梦之症;首乌藤养心安神、祛风通络,可治疗阴虚血少而致的虚烦不眠、多梦易惊等症;灵芝利益气血,安神健脾,用于治疗心悸、失眠、虚劳、头晕等症;甘草、大枣补中益气,养血安神,缓和药性;女贞子补肝肾阴;浮小麦敛汗、益气、除热。七味药相互促进、相互依赖,协同发挥了养血安神的作用[8]。
该研究通过建立小鼠开野实验、阈上、阈下戊巴比妥钠协同作用实验等用于考察镇静催眠药物的经典的药理实验模型,对夜宁胶囊的镇静催眠作用进行了研究,并进一步考察了夜宁胶囊对小鼠脑内GABA、5-HT、DA和NE等神经递质含量的影响。在研究镇静催眠药物时,开野实验、阈上、阈下戊巴比妥钠协同作用实验均为经典的、可靠的、简单易行的动物模型,而氨基酸类神经递质GABA以及单胺类神经递质5-HT、NE和DA均为公认的参与睡眠-觉醒机制的经典神经递质,当其水平提高时,睡眠质量随之提升[9-11]。研究结果显示,在开野实验中,YNM组、YNH组能显著降低小鼠自主活动的次数;在阈上戊巴比妥钠协同作用实验中,YNM组、YNH组能明显缩短小鼠的入睡潜伏期、延长小鼠的睡眠时间;在阈下戊巴比妥钠协同作用实验中,YNM组、YNH组能显著增加小鼠的入睡率,这表明夜宁胶囊具有显著的镇静催眠作用。进一步研究发现,YNH组可显著性增加小鼠脑组织中的GABA、5-HT、DA和NE含量。综上所述,夜宁胶囊具有良好的镇静催眠作用,并初步推测其镇静催眠作用机制与GABA、5-HT、DA和NE等神经递质水平改变有关。该研究为夜宁胶囊的开发利用提供了更多的科学依据,在此基础上,其具体的作用机制有待进一步探索研究。
Sedative and hypnotic effects and mechanism of Yening Capsules on mice
-
摘要:
目的 研究夜宁胶囊对小鼠的镇静催眠作用,并初步探究其作用机制。 方法 将小鼠随机分成空白对照组,艾司唑仑组(0.8 mg/kg),夜宁胶囊低、中和高剂量组(400、600和800 mg/kg),通过开野实验,协同阈上和阈下剂量戊巴比妥钠对小鼠睡眠影响的实验,观察并记录夜宁胶囊对小鼠自主活动、入睡潜伏期、睡眠时长和入睡率的影响。用酶联免疫法检测小鼠脑组织中γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)的水平。 结果 与空白对照组相比,夜宁胶囊中、高剂量组(P<0.05、P<0.01)能显著降低小鼠自主活动次数;夜宁胶囊中、高剂量组能显著缩短小鼠入睡潜伏期(P<0.05、P<0.05),并延长睡眠时间(P<0.05、P<0.01);夜宁胶囊中、高剂量组(P<0.05、P<0.01)能显著增加小鼠的入睡率。与空白对照组相比,高剂量的夜宁胶囊可明显增加小鼠脑组织中GABA(P<0.05)、5-HT(P<0.05)、DA(P<0.05)、NE(P<0.01)含量。 结论 夜宁胶囊具有良好的镇静催眠作用,其作用机制与提高脑内GABA、5-HT、DA和NE水平有关。 Abstract:Objective To study the sedative and hypnotic effects of Yening Capsules and investigate its bioactive mechanism in mice. Methods The mice were randomly divided into control group, estazolam group (0.8 mg/kg), low, medium and high-dose Yening Capsules groups (400, 600 and 800 mg/kg). The locomotor activity, latency to persistent sleep, sleep duration and sleep rate were determined respectively in mice via the open field test and injection of pentobarbital sodium in subthreshold and suprathreshold doses. The content of GABA, 5-HT, DA and NE in brain tissue of mice were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Results Compared with the control group, Yening Capsules medium and high dose group (P<0.05, P<0.01)significantly decreased the locomotor activity of mice.The sleep latency in Yening Capsules medium and high dose group were significantly shorten (P<0.05, P<0.05)and the sleep duration (P<0.05, P<0.01)were extended. The sleep rate of Yening Capsules medium and high dose groups (P<0.05, P<0.01) was significantly increased. Compared with the control group, high dose of Yening Capsules can significantly increase GABA (P<0.05), 5-HT (P<0.05), DA (P<0.05), NE (P<0.01) in mouse brain tissue. Conclusion Yening Capsules had obvious sedative and hypnotic effects, and its mechanism may be related to the increasement of GABA, 5-HT, DA and NE level in brain tissue of mice. -
Key words:
- Yening Capsules /
- sedative hypnosis /
- insomnia /
- pentobarbital sodium /
- neurotransmitter
-
阿尔茨海默病(AD)是一种以进行性记忆功能和神经行为障碍为表现的中枢神经系统退行性疾病。目前全球约有AD患者
5000 余万人,随着人口老龄化的进展,这一数字还将持续增加,给全球发展带来巨大的健康和经济负担[1] 。到目前为止,临床尚缺乏有效的AD治疗手段。胆碱酯酶抑制剂、NMDA拮抗剂等传统AD治疗药物效果有限,FDA新批准上市的Aβ单克隆抗体仑卡奈单抗等疗效尚存争议,且治疗费用昂贵[2] 。因此,开发经济、有效的AD治疗药物仍是当前研究热点。中药因其多靶点系统作用和低毒副作用的优势,近年来在AD等复杂疾病治疗药物发掘中发挥重要作用[3] 。中药葛根和知母临床应用历史悠久,葛根解肌退热、生津止渴,知母清热泻火、滋阴润燥,二者配伍可清热生津、滋阴润燥,改善代谢紊乱,对热邪灼津、痰浊阻窍所致的健忘呆钝、消渴等症具有治疗作用,主要代表方剂为玉液汤[4-6] 。近年来研究发现该药对的一些成分如葛根素[7] 、芒果苷[8] 、知母皂苷BⅡ[9] 等对AD具有药效作用。作为一种复杂的异质性疾病,AD的发生与糖尿病存在紧密的因果关联,也被称为脑型糖尿病(3型糖尿病)[10] 。但是目前鲜见葛根与知母配伍后在AD治疗中作用效果的报道。因此,本研究拟通过建立AD大鼠模型考察葛根和知母配伍防治AD的效果,同时运用代谢组学策略探究葛根与知母作为药对配伍后防治AD潜在的作用机制,为中药防治AD研究提供参考借鉴。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent
1290 Infinity液相色谱仪和6538 UHD Accurate-Mass 四级杆飞行时间串联高分辨质谱仪(美国安捷伦公司);HERAEUS FRESCO 17高速冷冻离心机(美国赛默飞公司);ANALOG 涡旋振荡器(美国奥豪斯公司);Milli-Q Integral超纯水机(美国Millipore公司);十万分之一电子分析天平(日本A&D公司);Digbehav动物行为学分析系统-水迷宫(上海吉量软件科技有限公司)。1.2 药物与试剂
葛根(批号:A220901)与知母药材饮片(批号:
20220201 )购自上海市白鹿堂中药店,经海军军医大学药学系蒋益萍副教授鉴定为豆科植物野葛P. lobate(Willd.)Ohwi的干燥根和百合科植物知母A. asphodeloides Bge.的干燥根茎;乙醇(分析纯,国药集团上海化学试剂有限公司); 乙腈、甲酸(均为LC-MS级,赛默飞世尔科技中国有限公司);乙腈、甲醇(色谱纯,北京迪马科技有限公司);乌拉坦(批号:P2091859)、D-gal(批号:P1616089)和AlCl3(批号:P2391168)购自上海泰坦科技股份有限公司;生理氯化钠溶液(四川科伦药业股份有限公司);L-2-氯苯丙氨酸(98%,上海麦克林生化有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)试剂盒购自上海源桔生物科技中心。1.3 实验动物
健康雄性清洁级SD大鼠,体重(200±20)g,购自浙江省实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK(浙)2019-0002。大鼠饲养于海军军医大学药学系实验动物中心,笼饲条件为:温度恒定为(22±2)℃,湿度区间为40%~60%,昼夜循环时间为12 h。
2. 实验方法
2.1 中药提取液制备
分别取葛根、知母和葛根-知母药对(15∶12)粉末适量,以10倍体积70%乙醇浸泡,在85 ℃下加热回流提取90 min,滤过,滤渣以同等条件重复提取2次。合并3次滤液,60 ℃减压浓缩至无乙醇味,制备得到用于灌胃的提取液,密封保存于−20 ℃待用。
2.2 AD模型建立与药效评价
2.2.1 分组与给药
40只SD大鼠适应性喂养1周后按照体重随机分为空白对照组、AD模型组、葛根组、知母组和葛根-知母药对组共5组(n=8)。除对照组外,其余4组大鼠每日给予D-gal 300 mg/kg腹腔注射和AlCl3 200 mg/kg灌胃,连续给药21周建立AD动物模型。对照组每日给予等量的生理盐水(灌胃+腹腔注射)。自第14周起,3个中药干预组分别给予葛根、知母和葛根-知母药对提取液灌胃(相当于生药量:葛根6.25 g/(kg·d),知母5 g/(kg·d),药对11.25 g/(kg·d)。对照组和模型组大鼠灌胃等量纯水。
2.2.2 Morris 水迷宫实验
采用Morris水迷宫行为学实验评价大鼠的学习和记忆能力。水迷宫实验全程共6 d,其中包括5 d的定位航行训练和1 d的空间探索试验。利用动物行为学分析系统记录大鼠在定位航行训练期间每日的逃避潜伏时间和空间探索训练中的运动轨迹、穿越站台次数、各象限的运动距离和停留时间等参数,供分析评价使用。
2.2.3 样本获取与前处理
行为学实验结束后,大鼠腹腔注射乌拉坦麻醉,经腹主动脉取血,静置后,在4 ℃、
4 000 r/min转速下离心10 min,取上清液分装冻存于−80 ℃,供后续分析用。2.2.4 血清MDA、SOD和NO检测
使用ELISA试剂盒,按照说明书步骤检测大鼠血清中的SOD、MDA、NO等氧化应激和脂质过氧化相关指标。
2.3 代谢组学实验
2.3.1 含内标的甲醇溶液配制
精密称取L-2-氯苯丙氨酸适量,加入甲醇溶解得浓度为5 mg/ml的内标母液,随后用甲醇稀释得到浓度为2 μg/ml的内标溶液。
2.3.2 分析样本制备
各取200 μl解冻后的血清样本置于1.5 ml的离心管中,加入600 μl预冷的含内标的甲醇溶液,涡旋2 min后,在4 ℃、
12 500 r/min转速下离心15 min,取上清液供UPLC-Q/TOF-MS分析用。取各样本20 μl,混合得到质控(QC)样本。2.3.3 色谱与质谱条件
色谱条件:反相色谱柱为Waters X Select HSS T3柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm),亲水作用色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH HILIC柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm);进样量:2 μl;柱温:40 ℃;流动相为0.1%甲酸-水(A )和0.1%甲酸-乙腈溶液(B);T3柱梯度洗脱模式:0~2 min,2%B;2~17 min,2%~98% B;17~19 min,98%B。HILIC柱梯度洗脱模式:0~2 min,95%B;2~4 min,95%~89% B;4~10 min, 89% B;10~12 min, 89%~66% B;12~15 min, 66% B。流速:0.4 ml/min;色谱柱平衡时间:5 min。
质谱条件:采用 ESI 离子源,正、负离子检测模式;干燥气温度,350 ℃,干燥气体流量:11 L/min;毛细管电压:正离子模式为
4 000 V,负离子模式为3 500 V;碎裂电压:120 V;质谱扫描范围:50~1 500 m/z。2.3.4 数据预处理与分析
质谱数据用XCMS程序包进行预处理,按80%原则过滤无效数据并进行内标归一化处理。使用SIMCA 14.1(Umetrics公司,瑞典)进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交矫正偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)并进行模型验证,结合R2X、R2Y和Q2判断模型的拟合效果和预测效果。以变量权重值(VIP)>1、P<0.05且差异倍数(fold change,FC)>1.2或<0.8作为筛选标准,获得AD疾病关联生物标志物。借助HMDB数据库(https://hmdb.ca/)等在线代谢物质谱数据库对筛选得到的差异代谢物进行比对和注释。借助MetaboAnalyst 6.0(https://www.metaboanalyst.ca/)网站进行代谢通路分析。
2.4 统计分析
使用SPSS Statistics 23(IBM公司,美国)和GraphPad Prism 8(Graphpad软件公司,美国)进行统计分析与绘图。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P<0.05认为组间差异具有统计学意义。
3. 实验结果
3.1 AD大鼠模型建立与药效评价
3.1.1 学习和记忆能力评价
以水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期、穿越站台所在位置次数以及站台所在象限的停留时间作为评价指标,考察大鼠的学习和记忆水平。结果如图1所示,定位航行训练期间,各组大鼠的逃避潜伏期随训练时间增加均呈下降趋势,其中模型组逃避潜伏期下降趋势较为平缓,对照组和3个中药干预组下降趋势均较模型组显著,对照组和葛根-知母药对组第5日逃避潜伏期较模型组均有极显著差异(P<0.01)。同样,空间探索实验中,模型组大鼠穿越站台次数以及站台所在象限的停留时间较对照组均显著减少,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。中药干预后各组大鼠穿越站台次数及目标象限停留时间均有所增加,其中,葛根-知母药对组与模型组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明,造模后大鼠的学习和记忆能力出现下降,给予葛根、知母和葛根-知母药对干预均可不同程度改善大鼠的学习和记忆能力,以葛根-知母药对最为显著,效果优于单药。
3.1.2 血清生化指标测定
与对照组相比,模型组大鼠血清NO水平相对升高,MDA水平显著升高(P<0.05),SOD含量极显著降低(P<0.01)。中药干预后,各给药组血清NO和MDA水平出现不同程度降低,其中葛根-知母药对组降低效果最为明显,与模型组间差异具有统计学意义(P<0.05)。葛根、知母和葛根-知母药对给药组血清SOD含量较模型组均有所回调,组间差异具有统计学意义(P<0.05),见图2。
3.2 血清代谢组学
3.2.1 血清代谢轮廓和多元统计分析
血清样本经UHPLC-Q/TOF-MS分析后得到各组大鼠血清代谢图谱,不同色谱柱分析条件下各组大鼠血清代谢轮廓存在一定差异。多元统计分析结果表明(图3),在PLS-DA多组分析模型中,空白对照组、AD模型组和3个中药干预组组间区分度较好,组内差异相对较小。PLS-DA模型200次置换检验结果显示,Q2回归线与Y轴截距小于0,R2和Q2曲线斜率始终为正值,且Q2<R2,表明模型未出现过拟合,具有相对可靠的解释和预测能力。在OPLS-DA模型中,不同分析条件下,AD模型组与空白对照组间完全分离,表明模型组与对照组间具有显著组间差异,CV-ANOVA验证结果证实所建立的OPLS-DA模型未出现过拟合,具备解释和预测能力。
3.2.2 差异代谢物筛选与鉴定
对T3柱和HILIC柱正、负离子模式下的代谢物信息进行差异化分析,以VIP值>1、P<0.05和FC>1.2或FC<0.8作为筛选标准,对不同模式下空白对照组与AD模型组的差异代谢物进行筛选,并以火山图形式呈现(图4)。图中橙色标记点为显著上调代谢物,蓝色标记点为显著下调代谢物。
利用HMDB数据库对差异代谢物质谱信息进行匹配和鉴定,在AD模型组与对照组间鉴定出70个AD相关的潜在生物标志物,其中由HILIC柱鉴定得到31个代谢物,T3柱鉴定得到45个代谢物,T3和HILIC柱共同鉴定得到的代谢物6个,具体如表1所示。
表 1 差异代谢物鉴定、趋势和相关通路分析结果序号 代谢物 色谱柱 分子质量(m/z) 化学式 加合离子 趋势 相关通路 P 值 1 2-羟基丁酸 T3 127.0362 C4H8O3 M+Na ↑ 丙酸代谢 1.22E-03 2 肌酸 T3 132.0781 C4H9N3O2 M+H ↑# 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 6.98E-03 3 脯氨酸 T3、HILIC 138.0553 C5H9NO2 M+Na ↓#* 精氨酸和脯氨酸代谢 4.20E-03 4 L-天冬氨酸 T3 133.0606 C4H8N2O3 M+H ↑# 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢2.36E-02 5 L-乙酰基肉碱 T3 204.1218 C9H17NO4 M+H ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成 1.26E-03 6 棕榈酰肉碱 T3 400.3424 C23H45NO4 M+H ↑#* 脂肪酸降解 2.38E-04 7 喹啉酸 T3 168.0271 C7H5NO4 M+H ↑ 烟酸和烟酰胺代谢 4.97E-04 8 焦谷氨酸 T3 128.0329 C5H7NO3 M-H ↓# 谷胱甘肽代谢 2.89E-02 9 3b-羟基-5-胆酸 T3 357.2789 C24H38O3 M+H-H2O ↑ − 1.01E-02 10 香草酸 T3 151.0361 C8H8O4 M+H-H2O ↑ − 3.05E-03 11 肌酸酐 T3 136.0491 C4H7N3O M+Na ↑# − 1.89E-04 12 戊烯二酸 T3 153.0198 C5H6O4 M+Na ↑ − 8.96E-03 13 亚油酸 T3 303.2327 C18H32O2 M+Na ↑# 亚油酸代谢 2.45E-02 14 4-羟基丁酸 T3 103.0382 C4H8O3 M-H ↑# − 4.49E-03 15 糖原 T3 689.2111 C24H42O21 M+Na ↑ 淀粉和蔗糖代谢 2.24E-02 16 肉豆蔻酸 T3 211.2038 C14H28O2 M+H-H2O ↑# 脂肪酸生物合成 4.15E-02 17 丙酰肉碱 T3 218.1383 C10H19NO4 M+H ↓# 支链脂肪酸的氧化 1.97E-02 18 硬脂酰肉碱 T3 428.3734 C25H50NO4 M+H ↑#* 长链饱和脂肪酸的
线粒体β氧化2.84E-04 19 花生四烯酸 T3 327.232 C20H32O2 M+Na ↑#* 花生四烯酸代谢 1.53E-02 20 N1乙酰精胺 T3 267.208 C12H28N4O M+Na ↑# 赖氨酸降解 3.71E-02 21 N6, N6, N6-三甲基-L-赖氨酸 T3 189.16 C9H20N2O2 M+H ↑# α-亚麻酸代谢 4.44E-02 22 α-亚麻酸 T3 279.2316 C18H30O2 M+H ↑#* 初级胆汁酸生物合成 2.80E-02 23 24羟基胆固醇 T3 425.343 C27H46O2 M+Na ↑# 半胱氨酸和蛋氨酸代谢 8.17E-04 24 2-氧代-4-甲硫基丁酸 T3 131.0189 C5H8O3S M+H-H2O ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成 1.14E-02 25 二十碳五烯酸 T3 285.2212 C20H30O2 M+H-H2O ↑# − 2.45E-02 26 油酰乙醇酰胺 T3 348.2891 C20H39NO2 M+Na ↑# − 8.42E-03 27 吲哚-3-丙酸 T3 190.0858 C11H11NO2 M+H ↓# − 4.79E-04 28 棕榈油酸 T3 237.2193 C16H30O2 M+H-H2O ↑#* − 5.79E-03 29 15(S)-羟基二十碳三烯酸 T3 345.2341 C20H34O3 M+Na ↑# − 9.83E-03 30 十四酰肉碱 T3、HILIC 372.3103 C21H41NO4 M+H ↑# − 1.15E-02 31 3-羟基马尿酸 T3 178.0501 C9H9NO4 M+H-H2O ↓#* − 9.53E-03 32 18-羟基花生四烯酸 T3 343.225 C20H32O3 M+Na ↑# − 3.91E-02 33 亚麻酰基肉碱 T3 424.3414 C25H46NO4 M+H ↑# − 4.25E-04 34 LysoPC(15:0/0:0) T3 526.3057 C23H48NO7P M+FA-H ↓#* − 2.55E-02 35 PC(18:1(9Z)e/2:0) T3 550.3872 C28H56NO7P M+H ↑#* − 2.11E-03 36 7-酮胆固醇 T3 401.3455 C27H44O2 M+H ↑#* − 1.08E-04 37 9-十六碳烯酰肉碱 T3 398.3152 C23H43NO4 M+H ↑# − 9.43E-05 38 16(17)-EpDPE T3 343.2219 C22H32O3 M-H ↑#* − 3.33E-02 39 十八烯酰肉碱 T3 426.3578 C25H47NO4 M+H ↑# − 1.84E-04 40 肉豆蔻酰肉碱 T3 370.2951 C21H39NO4 M+H ↑ − 4.25E-03 41 DL-乙酰肉碱 T3 204.1227 C9H17NO4 M+H ↑ 嘧啶代谢 1.85E-03 42 胞苷一磷酸 HILIC 368.0407 C9H14N3O8P M+FA-H ↓# 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 2.74E-02 43 胆碱 HILIC 86.0963 C5H14NO M+H-H2O ↑ 初级胆汁酸生物合成 1.20E-02 44 甘胆酸 HILIC 466.33 C26H43NO6 M+H ↑#* 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 2.43E-04 45 L-酪氨酸 HILIC 182.0812 C9H11NO3 M+H ↑#* 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 2.89E-03 46 苯丙氨酸 HILIC 166.0862 C9H11NO2 M+H ↑ 嘌呤代谢 1.68E-03 47 肌苷酸 HILIC 383.0262 C10H13N4O8P M+Cl ↓#* 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢9.85E-04 48 L-天门冬氨酸 HILIC 134.0433 C4H7NO4 M+H ↑ 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 5.14E-04 49 苯丙酮酸 HILIC 165.0546 C9H8O3 M+H ↑#* 嘧啶代谢 6.25E-03 50 乳清酸 HILIC、T3 179.0029 C5H4N2O4 M+Na ↓#* 鞘脂代谢 3.04E-02 51 鞘氨醇 HILIC 302.3059 C18H39NO2 M+H ↑# 酪氨酸代谢 6.59E-04 52 香草扁桃酸 HILIC 233.0192 C9H10O5 M+Cl ↑#* 酪氨酸代谢 6.72E-05 53 酪胺 HILIC 120.079 C8H11NO M+H-H2O ↑ − 2.50E-03 54 3-氧代-4, 6 -胆二烯酸 HILIC 393.2315 C24H34O3 M+Na ↑# 初级胆汁酸生物合成 1.46E-02 55 鹅去氧胆酸 HILIC 437.2877 C24H40O4 M+FA-H ↑#* 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢7.30E-04 56 谷氨酰胺 HILIC 169.0584 C5H10N2O3 M+Na ↑# − 5.06E-04 57 亮氨酸 HILIC 133.0855 C6H12O3 M+H ↑ − 5.18E-03 58 高-L-精氨酸 HILIC 189.1292 C7H16N4O2 M+H ↑#* − 1.22E-02 59 马尿酸 HILIC、T3 178.0516 C9H9NO3 M-H ↓# − 2.94E-02 60 牛磺胆酸3-硫酸盐 HILIC 596.2653 C26H45NO10S2 M+H ↑ − 1.78E-05 61 鹅去氧胆酸3-硫酸盐 HILIC 455.2515 C24H40O7S M+H-H2O ↑ 半胱氨酸和蛋氨酸代谢 2.76E-03 62 硫代半胱氨酸 HILIC 187.9645 C3H7NO2S2 M+Cl ↓# 亚油酸代谢 8.23E-05 63 13-L-过氧化氢亚油酸 HILIC 311.2187 C18H32O4 M-H ↓# − 4.63E-03 64 S-亚硝基谷胱甘肽 HILIC 381.0763 C10H16N4O7S M+FA-H ↓#* 鞘脂代谢 8.86E-05 65 LacCer(d18:1/12:0) HILIC 806.5705 C42H79NO13 M+H ↑ 花生四烯酸代谢 1.30E-04 66 LysoPC(14:0/0:0) HILIC、T3 512.3009 C22H46NO7P M+FA-H ↓ − 3.34E-02 67 2-(14,15-环氧二十碳三烯酰基)甘油 HILIC 395.2749 C23H38O5 M+H ↑ − 1.41E-03 68 赖氨酰苯丙氨酸 HILIC 294.1891 C15H23N3O3 M+H ↑ 醚脂代谢 2.52E-04 69 二十四碳四烯酸肉碱 HILIC、T3 526.3786 C31H53NO4 M+Na ↑ − 2.98E-05 70 1-(11Z二十二碳烯酰基)-3-磷酸甘油酯 HILIC 515.3163 C25H49O7P M+Na ↑ − 8.91E-07 注:↑表示模型组较对照组相对升高趋势,↓表示模型组较对照组相对下降趋势,P值为模型组与对照组间代谢物水平的t检验计算结果;
#表示代谢物经葛根-知母药对干预后具有回调趋势(共47个),*表示代谢物(共20个)经葛根-知母药对干预后回调差异具有统计学意义(P<0.05)。3.2.3 药物的干预效果
利用各组间的FC值变化情况判断药对干预后的回调代谢物。对于具有回调趋势的代谢物多组间变化情况进行单因素方差分析,P<0.05的代谢物确定为药对干预后显著回调的差异代谢物。结果显示,葛根-知母药对干预后出现回调的差异代谢物共计47个,其中,显著回调代谢物20个(表1和图5)。
对70个AD相关的差异代谢物和葛根-知母药对干预后显著回调的20个差异代谢物分别进行通路富集分析后发现(图6),AD模型大鼠潜在疾病生物标志物涉及通路主要包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、亚油酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、酪氨酸代谢、嘧啶代谢等。葛根-知母药对干预可对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢和初级胆汁酸生物合成等通路产生回调影响。
4. 讨论
AD是一种复杂的中枢神经系统异质性疾病,具体病因尚不明确。目前已知可导致AD的因素包括基因突变、氧化应激、神经炎症以及多种环境和疾病因素[11] 。衰老被认为是AD最相关的危险因素[12] ,啮齿类动物长期摄入D-gal可产生包括氧化应激、炎症反应在内的多种与人类相似的衰老相关变化[13] 。铝元素可通过促进中枢神经系统炎症反应、降低脑中SOD活性,影响胆碱能神经传递、促进Tau蛋白磷酸化等形式诱导神经毒性,过量铝暴露与AD等中枢神经系统退行性疾病进展相关[14] 。研究表明,D-gal与AlCl3联合应用可产生类似于自然衰老的变化及AD相关特征[15] 。因此,本研究选取D-gal与AlCl3联合造模,通过大鼠长程给药模拟和还原AD相关的病程和病理变化,力求更加精准地反映AD患者体内代谢分子水平变化。药效学实验表明,D-gal和AlCl3联合给药后大鼠学习和记忆能力明显下降,体内氧化应激和炎症相关因子水平发生变化,表明该模型成功模拟AD相关的病理变化和特征。而葛根-知母药对干预可显著改善AD模型大鼠的学习和记忆能力,并回调SOD、NO和MDA等相关生化指标,改善和回调效果优于单药,表明葛根和知母配伍后在AD防治中具有一定的增效作用,具备进一步研究的价值。
代谢组学结果表明,葛根-知母药对可以显著回调血清中20种代谢物,主要涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢等途径。酪氨酸是一些神经递质或者神经调节剂的前体。Liu[16]等对尸源样本进行非靶向和靶向代谢组学分析发现,AD患者海马中苯丙酮酸含量普遍上调,表明苯丙氨酸代谢失调可能是AD病理形成的重要机制。本研究同样发现AD模型大鼠血清中苯丙酮酸水平较对照组显著升高,葛根-知母药对可以显著回调苯丙酮酸至生理水平。脯氨酸是一种非必需氨基酸,参与氧化还原调控和细胞凋亡,既是活性氧(ROS)清除剂,也是ROS生产者,因此,平衡脯氨酸水平和脯氨酸相关代谢酶活性对维系细胞生理功能至关重要。脯氨酸代谢可能会通过ROS、细胞衰老和细胞免疫等机制影响神经元功能[17] 。Xu等[18]整合代谢组学与蛋白质组学结果发现,脱脂核桃粉可以通过升高小鼠脑组织中脯氨酸等多种氨基酸水平发挥对东莨菪碱诱导的AD小鼠神经保护机制。这与本实验结果相似,葛根-知母药对可以通过回调脯氨酸水平发挥AD防治作用。
此外,本研究发现多种回调代谢物与脂质代谢密切相关。花生四烯酸和α-亚麻酸是由多不饱和脂肪酸氧化产生的脂氧化物,广泛参与机体炎症、免疫等多种生理病理进程。花生四烯酸升高可进一步提高氧化应激水平,与AD等疾病进程紧密相关[19] 。AD与胆汁酸代谢异常之间存在紧密关联,这可能与肠-肝-脑轴机制相关。有研究表明AD患者血浆中胆汁酸水平升高[20] 。磷脂是保持细胞膜完整性的主要物质,溶血磷脂酰胆碱是磷脂的降解产物,与磷脂代谢密切相关,磷脂代谢异常可导致溶血磷脂酰胆碱下调,表现为细胞凋亡及信号转导异常,是AD的潜在诱因之一[21] 。本研究表明,葛根-知母药对的AD防治作用效果可能与显著回调血清中花生四烯酸、α-亚麻酸、甘胆酸、鹅去氧胆酸和溶血磷脂酰胆碱水平相关。
ROS产生与消除之间的不平衡被称为氧化应激,氧化应激是AD等疾病的关键因素和共同点。NO是ROS的一种,也是神经传递和炎症相关的重要因素。高水平ROS会触发不饱和脂肪酸的脂质过氧化,导致MDA等高反应性化合物的产生,因此MDA是脂质过氧化和氧化应激的标志。SOD是抵消ROS有害影响最有效的一线防御机制。SOD可以通过去除超氧自由基防止更具破坏力的过氧亚硝酸盐生成,并维持体内NO在生理相关水平[22, 23] 。代谢组学结果提示,葛根-知母药对回调干预的多种途径与氧化应激和脂质过氧化相关。ELISA实验结果进一步表明,葛根-知母药对干预可提高AD大鼠体内SOD水平,回调NO和MDA至生理水平,提示葛根-知母药对可以通过调节氧化应激和脂质过氧化,维持体内NO的生理水平对AD产生防治作用。
综上,本文通过建立AD大鼠模型考察了葛根-知母药对防治AD的作用效果,药对药效优于单药;运用代谢组学策略揭示其改善AD大鼠学习和记忆能力相关的潜在代谢物和代谢路径,其作用机制可能与调节苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等代谢通路、改善氧化应激和脂质过氧化水平等相关,为中药药对防治AD的临床应用和进一步开发提供了科学依据。
-
表 1 夜宁胶囊对小鼠自主活动的影响(
$ \bar{x} $ ±SEM,n=10)组别 剂量(mg/kg) 小鼠自主活动次数 空白对照组 − 188.90±7.78 艾司唑仑组 0.8 160.50±7.10* YNL组 400 169.60±13.15 YNM组 600 156.80±8.34* YNH组 800 151.70±7.28** 注:*P<0.05,** P<0.01,与空白对照组比较。 表 2 夜宁胶囊对阈下剂量戊巴比妥钠镇静催眠作用的影响(n=10)
组别 剂量(mg/kg) 入睡数量(只) 入睡比率(%) 空白对照组 − 0 0 艾司唑仑组 0.8 9 90*** YNL组 400 1 10 YNM组 600 5 50* YNH组 800 7 70** 注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,与空白对照组比较。 表 3 夜宁胶囊协同阈上剂量戊巴比妥钠对小鼠睡眠时长和入睡潜伏期的影响(
$ \bar{x} $ ±SEM,n=10)组别 剂量(mg/kg) 睡眠潜伏期(t/min) 睡眠时长(t/min) 空白对照组 − 5.69±0.69 8.20±3.23 艾司唑仑组 0.8 3.86±0.45* 34.20±5.89** YNL组 400 4.73±0.18 17.86±3.63 YNM组 600 4.05±0.17* 22.15±4.66* YNH组 800 3.83±0.21* 28.26±4.38** 注:*P<0.05,**P<0.01,与空白对照组比较。 表 4 夜宁胶囊对小鼠脑组织中GABA、5-HT、DA和NE水平的影响(
$ \bar{x} $ ±SEM,n=10)组别 剂量(mg/kg) GABA含量(μmol/g) 5-HT含量(μg/g) DA含量(ng/g) NE含量(ng/g) 空白对照组 − 1.08±0.11 0.52±0.11 153.61±16.88 66.74±6.14 艾司唑仑组 0.8 2.33±0.28** 1.16±0.18* 327.14±22.77*** 155.14±19.12** YNL组 400 1.02±0.12 0.52±0.09 152.72±26.68 80.50±7.25 YNM组 600 1.17±0.20 0.75±0.13 168.17±14.90 91.76±12.66 YNH组 800 1.80±0.21* 1.02±0.14* 235.99±27.31* 116.31±13.02** 注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,与空白对照组比较。 -
[1] 陈贵海. 失眠的研究进展[J]. 中国临床医生杂志, 2017, 45(8):1-6,125. doi: 10.3969/j.issn.2095-8552.2017.08.001 [2] 叶增杰, 梁木子, 胡蕖, 等. 失眠障碍的国内外研究进展[J]. 医学与哲学(B), 2017, 38(5):60-63. [3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)2020年版[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 1193. [4] 魏伟, 吴希美, 李元建. 药理实验方法学[M]. 4版. 北京: 人民卫生出版社, 2010: 639-640. [5] 朱尧, 夏伟, 刘溦溦, 等. 中医论治失眠研究进展[J]. 吉林中医药, 2016, 36(3):320-324. [6] 李丽娜. 近10年中医药治疗失眠症的研究进展[J]. 中医药信息, 2018, 35(3):119-123. [7] 陈云, 时维武, 齐建新. 夜宁胶囊治疗失眠的临床观察[J]. 中草药, 2017, 48(22):4731-4733. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.22.022 [8] 王争平, 丁青龙, 李莹. 夜宁胶囊治疗神经衰弱及神经衰弱症候群的临床研究[J]. 中国现代药物应用, 2010, 4(6):106-107. doi: 10.3969/j.issn.1673-9523.2010.06.094 [9] 胡文卓, 贾力莉, 马澜, 等. 佛手柑内酯对PCPA失眠大鼠神经递质及学习记忆的影响[J]. 时珍国医国药, 2020, 31(4):821-823. doi: 10.3969/j.issn.1008-0805.2020.04.014 [10] 胡晓炜, 罗广彬, 范琼尹, 等. 柴牡安神颗粒抗焦虑作用及其活性机制[J]. 中国实验方剂学杂志, 2019, 25(13):41-48. [11] 向熙, 周龙甫, 马超英, 等. 水芹不同提取物的镇静催眠作用[J]. 中医学报, 2019, 34(6):1244-1247. 期刊类型引用(1)
1. 熊亚娟,冯思雨,郭泽磾. 肺炎患儿雾化吸入结合大环内酯类抗生素的治疗效果分析. 中国医学工程. 2024(11): 104-106 . 百度学术
其他类型引用(1)
-