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糖尿病脑血管并发症是其致死致残的常见原因。鉴于内皮祖细胞(EPCs)在血管形成中的重要作用，近年来在心脑血管方面的研究越来越受到重视。多项研究证实EPCs移植治疗对脑缺血性疾病有改善作用[1-2]。然而糖尿病可影响EPCs功能[3]，单纯EPCs移植治疗的效果并不理想。前期研究证实雌激素体外孵育可改善糖尿病大鼠的EPCs的功能。因此，本研究通过分离培养糖尿病大鼠EPCs，经雌激素孵育后对糖尿病缺血性脑卒中大鼠进行移植治疗并评价治疗的效果，为临床治疗糖尿病脑血管并发症提供新的思路。
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雄性Wistar大鼠，体重(180±10)g（上海斯莱克实验动物有限公司）。动物房保持室温在22 ℃左右，相对湿度70%左右。所有实验动物均符合实验动物伦理学要求。
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雌激素 (Abcam公司)；链脲佐菌素(Sigma aldrich公司)； EGM-2 培养基(LON-ZA 公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC, Sigma Aldrich)；水合氯醛、甲醛溶液(国药集团化学试剂有限公司)。
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Wistar雄性大鼠，10～12周，适应性地喂养1周后，连续7 d空腹腹腔注射新鲜配制的链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）55 mg/（kg·d），对照组大鼠腹腔注射等体积枸橼酸钠缓冲液。7 d后测空腹血糖(禁食12 h)，将血糖值为(13.5～25) mmol/L的大鼠作为糖尿病大鼠进行实验。
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分离收集大鼠骨髓，采用密度梯度离心法获取骨髓单核细胞。将单核细胞重悬于培养基EGM-2并调整细胞浓度至1×106个/ml并接种于预先包被好纤维连接蛋白的细胞培养皿，置于细胞培养箱37 ℃和5%CO2条件下培养。培养3 d后洗去未贴壁细胞，继续培养至7 d。PBS洗去未贴壁细胞，贴壁细胞供实验用。
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将消化下来的细胞悬液置于无菌离心管中，加入M199培养基离心后弃掉上清液。加入1 ml稀释液C重悬细胞。PKH26染料用稀释液C稀释。将细胞悬液加入到PKH26稀释液中，立即用吸管混匀样本，在25 ℃孵育2～5 min，并定时轻轻的颠倒离心管保证充分混匀。加入等量血清孵育1 min终止染色反应。细胞清洗3次后用PBS重悬备用。
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1.5%异氟烷在氮气/氧气（70/30）吸入式麻醉后，大鼠手术期间置于保温垫上维持体温在（37±0.5） ℃，在体视显微镜下分离出左侧颈总、颈内和颈外动脉，结扎颈外及颈总动脉，从一侧颈总动脉插入线栓经颈内动脉至大脑中动脉并阻断其血流，手术期间应用激光散斑仪实时监测小鼠大脑皮层血流量的变化情况。
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实验分3组：①对照组和②糖尿病组：M199培养基；③雌激素组：含雌激素10 nmol/L的M199培养基。在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h 后进行实验。
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实验动物分4组：①正常雄性Wistar大鼠脑缺血组（CI）；②糖尿病大鼠脑缺血组（DM+CI）；③接受糖尿病大鼠EPCs移植治疗的糖尿病大鼠组（DM+CI+EPCs）；④接受经雌激素体外干预糖尿病EPCs移植治疗的糖尿病大鼠（DM+CI+EPCs+estrogen）。所有大鼠行脑缺血术后24 h，③和④组大鼠经尾静脉注入相应的经PKH26标记的EPCs悬液（1×106个细胞，悬于PBS中），①和②组经尾静脉注入等体积PBS。术后3 d进行实验。
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移植后3 d，大鼠麻醉处死取脑，将各组大鼠脑组织切为厚约3 mm的切片并浸入1% TTC中，37 ℃染色30 min。正常脑组织TTC染色为鲜红色，而缺血区脑组织为白色，拍照并计算脑缺血体积。
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移植后3 d，取各组大鼠脑组织做冰冻切片，160倍荧光显微镜下观察并获取图像，计数PKH26标记的细胞数并统计分析。同时进行VEGFR2免疫组化，每张切片取5个不同视野在160倍荧光显微镜下观察计数新生小管数。
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与CI组比较，DM+CI组脑梗死体积明显增加(P<0.01)；经EPCs移植治疗后糖尿病大鼠的脑缺血体积明显减小且经雌激素体外干预后的EPCs移植能进一步减少脑缺血梗死体积，说明雌激素干预可能加强了EPCs对脑卒中大鼠脑部缺血损伤的治疗作用(P<0.05, P<0.01,与 DM+CI组比较; P<0.05, 与 CI组比较)，见图1。
图 1 雌激素干预糖尿病EPCs移植降低大鼠脑缺血体积
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水迷宫实验结果显示， DM+CI组大鼠游泳路程和总时间相较于CI组明显增加(P<0.05)，平均速度和潜伏时间则无明显变化（P>0.05）；与DM+CI组比较，DM+CI+EPCs组以及DM+CI+EPCs+ estrogen组游泳总时间明显缩短(P<0.05)，平均速度均明显提高(P<0.05)，游泳总路程则无明显变化（P>0.05）；但只有DM+CI+EPCs+ estrogen组潜伏期明显降低(P<0.01)，见图2和表1。
图 2 各组大鼠水迷宫游泳轨迹图
表 1 不同处理组大鼠Morris迷宫实验指标对比（
$\bar x $ +s）组别(n=8) 总时间(s) 总路程(mm) 平均速度(mm/s) 潜伏期(s) CI 30.71±18.28 6721.56±4838.88 198.36±78.74 26.34±21.20 DM+CI 35.15±15.29* 7855.55±4262.89* 197.49±59.9 27.93±20.36 DM+CI+EPCs 29.49±13.46# 7459.41±4829.74 236.85±56.49# 25.14±16.04 DM+CI+EPCs+estrogen 28.80±13.75## 8477.04±5226.29 269.68±94.16## 22.41±14.16## *P<0.05，与CI组比较；#P<0.01,##P<0.01，与DM+CI组比较。 -
免疫荧光结果显示，与CI组比较，DM+CI组大鼠脑梗死区域新生血管数量明显降低(P<0.01)；而DM+CI+EPCs组以及DM+CI+EPCs+ estrogen组大鼠脑梗死区域新生血管数量明显增加(P<0.01)，且DM+CI+EPCs+ estrogen新生血管数量高于CI组（P<0.05），见图3。
图 3 雌激素干预糖尿病EPCs移植改善缺血区血管新生功能
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EPCs移植后第3天，取大鼠脑组织，切片后观察EPCs归巢情况。与CI组比较，DM+CI组大鼠脑组织缺血区域EPCs数量明显降低；而EPCs移植组大鼠脑组织梗死区域EPCs数量均明显增加，其中经过雌激素干预的EPCs移植组显示出梗死区域有更多数量的EPCs（图4）。
图 4 PKH26染色观察脑缺血区域EPCs细胞归巢
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糖尿病是脑卒中的独立风险因素，且糖尿病脑缺血具有高致死及致残率的特点。但受到目前治疗条件的限制，急需新的治疗手段。内皮祖细胞(EPCs)为一种来源于骨髓并能分化为内皮细胞的前体细胞。在适当条件下（如缺血、缺氧）能从骨髓动员、迁移并归巢到受损部位，分化为内皮细胞，参与受损血管内皮的再内皮化及受损部位的血管新生[11]。研究表明，通过外源性的补充内皮祖细胞，外源的内皮祖细胞可以归巢于损伤部位，促进受损部位的血管新生及组织的修复[12]。Wang[13]等通过制造小鼠颈动脉球囊损伤模型并采用EPCs移植治疗，结果显示EPCs移植后附着在受伤的动脉内膜上能促进受伤部位的再内皮化和抑制新内膜增生。Huang[14]等的研究显示，EPCs移植通过增加循环中的EPCs数量和脑微血管密度可以恢复全脑放疗对血脑屏障和脑部毛细血管造成的损害。Garbuzova-Davis[8]等将人骨髓内皮祖细胞（hBMEPCs）系统移植至G93A小鼠，改善肌受损的萎缩性脊髓炎的血脊髓屏障的同时明显改善疾病结局。此外， EPCs移植治疗可有效改善心肌梗死、冠心病、糖尿病肾病及脑缺血等缺血性疾病[2, 15-17]。因此，鉴于EPCs移植在心脑血管疾病中的良好治疗作用，EPC移植有可能成为治疗糖尿病脑血管并发症的重要措施。然而高龄及疾病可导致自身内皮祖细胞数量减少及功能降低[3]，单纯EPCs移植治疗的效果将大打折扣。若通过药物改善糖尿病EPCs功能，将使EPCs移植治疗达到事半功倍的效果。
雌激素在激发女性第二性征的出现及维持中发挥不可替代的作用，并参与机体脂肪、水盐及肌肉蛋白质的合成与代谢。雌激素对心脑血管具有保护作用，可能与其增强EPCs的功能相关[18-19]。本课题组前期研究结果显示雌激素体外孵育能改善糖尿病大鼠的EPCs的功能。Ying等研究表明雌激素通过改善糖尿病小鼠的EPCs功能进而促进其伤口处血管新生和伤口愈合[20]。但雌激素干预后的EPCs移植治疗糖尿病脑卒中的研究较少。
本研究采用EPCs对糖尿病脑卒中大鼠进行移植治疗，并采用TTC染色法对各组大鼠的脑组织染色以比较不同EPCs移植后大鼠脑梗死体积的变化。结果显示，糖尿病大鼠脑缺血梗死体积较正常大鼠相比明显增加，EPCs移植能明显减小脑梗死体积。与单独移植EPCs相比，雌激素干预的EPCs移植能进一步降低大鼠的脑梗死体积。同时水迷宫实验结果显示，雌激素干预EPCs移植明显提高脑卒中大鼠平均游泳速度、游泳总时间和明显缩短潜伏期，说明雌激素干预的EPCs移植对糖尿病脑卒中大鼠的脑缺血损伤有治疗作用。
研究表明EPCs通过促进缺血部位的血管新生在改善缺血性疾病预后中发挥重要作用[21-23]。为探讨EPCs移植治疗降低脑缺血体积是否与促进缺血部位血管新生相关，本实验采用免疫荧光法观察脑缺血部位的血管新生情况。结果发现与对照组大鼠相比，糖尿病组大鼠脑梗死区域新生血管数量明显降低，而EPCs移植组以及雌激素干预的EPCs移植组大鼠脑梗死区域新生血管数量明显增加，且雌激素干预的EPCs移植组新生血管数量最多并高于对照组，说明雌激素干预的EPCs移植通过促进缺血部位血管新生改善糖尿病脑卒中大鼠的脑缺血损伤。
研究发现移植的EPCs可以归巢于损伤部位促进血管新生[24-25]。为了解移植的EPCs是否归巢于脑缺血部位，我们利用荧光染料PKH26标记EPCs并将标记的EPCs移植入脑卒中大鼠体内，快速冰冻切片后置于荧光显微镜下观察。结果显示，糖尿病组大鼠脑组织缺血区域EPCs归巢数量较少；而EPCs移植组大鼠脑组织梗死区域EPCs归巢数量明显增加，且经雌激素干预的EPCs移植组显示出梗死区域有最多数量的EPCs归巢，说明雌激素能促进EPCs的归巢。
综上所述，雌激素体外孵育的糖尿病EPCs移植对糖尿病大鼠缺血性脑卒中有治疗作用，作用机制可能与雌激素促进EPCs归巢于缺血部位并促进缺血部位血管新生相关。该研究结果为糖尿病缺血性脑卒中提供了潜在的治疗手段。
Therapeutic effects of estrogen-intervened EPCs transplantation on diabetic ischemic stroke rats
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摘要:
目的 探讨雌激素干预的EPCs移植对糖尿病缺血性脑卒中的治疗作用。 方法 制备大鼠糖尿病缺血性脑卒中模型，24 h后通过尾静脉移植经PKH26标记的糖尿病EPCs和雌激素干预的糖尿病EPCs。移植3 d后测定各组大鼠脑缺血体积、大鼠行为学变化、缺血部位血管新生及EPCs的归巢情况。 结果 与糖尿病脑缺血大鼠相比，雌激素干预的糖尿病EPCs移植能降低脑缺血体积、改善行为学评分和缺血部位的血管新生及促进EPCs归巢到损伤部位(P<0.05)。 结论 雌激素干预的糖尿病EPCs移植，通过促进EPCs归巢和血管新生对糖尿病缺血性脑卒中有较好的治疗作用。 Abstract:Objective To explore the therapeutic effects of estrogen-intervened endothelial progenitor cells( EPCs) transplantation on diabetic ischemic stroke rats. Methods PKH26-labeled diabetic EPCs and estrogen-intervened diabetic EPCs were injected into rats via the tail vein 24 h after cerebral ischemia. Cerebral ischemic volume, behavioral changes, ischemic site vascularization and homing of EPCs were measured 3 d after EPCs injection. Results Compared with diabetic ischemic rats, estrogen-intervened EPCs transplantation had reduced infarct volumes, improved behavioral scores and ischemic site revascularization and promoted homing of EPCs to sites of injury(P<0.05). Conclusion Estrogen-intervened EPCs transplantation had a better therapeutic effect on diabetic ischemic stroke by promoting EPCs homing to injury site and EPCs-medicated neovascularization . -
Key words:
- estrogen /
- EPCs transplantation /
- diabetic ischemic stroke /
- neovascularization /
- homing
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银屑病是受遗传与环境影响[1]的由免疫介导[2]的一种慢性、炎症性皮肤病，患者症状常表现为暗红色斑块或浸润性红斑，上覆有白色、层状鳞屑，有蜡滴、薄膜、点状出血等，又称为牛皮癣、白疕。其病理组织在显微镜下呈现表皮层异常增厚、颗粒层变薄或缺失、毛细血管扩张和炎症细胞浸润等特征[3]。据统计，全球约有1.25亿人受银屑病影响[4]，发病率呈逐年递增趋势，患者还常伴有心血管疾病、代谢性疾病、精神性疾病和免疫性疾病等合并共病，这些共病不仅影响患者的生活质量，还增加了治疗的难度和复杂性[5]。治疗银屑病存在周期长、易复发等难点，临床治疗主要以缓解患者症状、抑制病情复发及减少共病并发为主[6]。
目前，银屑病的治疗方法包括外用药物、口服药物、生物制剂、光疗法等。轻中度患者常单独外用润肤剂、糖皮质激素、维生素D3衍生物、维A酸类、钙调磷酸酶抑制剂和生物制剂等药物；中重度患者则多系统治疗，如联用糖皮质激素与维生素D3衍生物类等外用药物，口服甲氨蝶呤、环孢素、维A酸类、糖皮质激素等制剂，皮下注射生物制剂及结合光疗法、辅助疗法等[7]。然而，以上治疗方法疗效有限，长期使用可能诱发局部皮肤萎缩、酒渣鼻及依赖性等不良反应，因此，寻求安全、有效、延长复发的药物是治疗银屑病的难点。对此中医药具有辨证论治、副作用小、疗效显著及性价比高等优势。
近年来，多项临床研究表明，中药狼毒口服、外用均可有效治疗银屑病；其提取物可缓解疼痛、促进创面愈合，具有良好的抑菌、抗炎活性[8]。但狼毒的基源和药效物质尚不明确，阻碍了其临床应用。据记载，自西汉以来，药用狼毒以瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）或大戟科大戟属植物狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud.）、甘肃大戟（Euphorbia kansuensis Prokh.）的干燥根为主[9-10]，上述三种基源的狼毒均有临床应用。为了探究三种狼毒在临床上的疗效差异，本研究拟通过构建 IMQ 诱导的银屑病样小鼠模型，以醇提取物的方式，探究三种狼毒对银屑病的防治作用。
1. 材料
1.1 实验动物
SPF级雄性BALB/c小鼠36只，8 周龄，体质量约22～25 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号：20220004035001；实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004。 本实验经上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物伦理委员会批准。小鼠于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物房适应性喂养１周后开始实验。
1.2 药物和试剂
瑞香狼毒（采自河北保定）、狼毒大戟（采自东北吉林）和甘肃大戟（采自甘肃兰州）经上海中医药大学朱建勇副主任药师鉴定为Stellera chamaejasme L.、Euphorbia fischeriana Steud.及Euphorbia kansuensis Prokh.）；凡士林[联合利华（中国）有限公司，规格：100 g]；5%咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限责任公司，规格：3 g/支）；卡泊三醇软膏（爱尔兰利奥制药有限公司，规格：30 g：1.50 mg）；95%乙醇（规格：20 kg/塑桶）、二甲苯（规格：500 ml）和30% 双氧水（H2O2，规格：500 ml），均购于国药集团化学试剂有限公司；4% 多聚甲醛固定液（上海碧云天生物技术股份有限公司，规格：100 ml）；苏木素-伊红染色剂试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，规格：100 ml）；柠檬酸抗原修复液（规格：1 L，pH 6.0，即用型），Anti-Ki67 小鼠单克隆抗体（规格：50 μl）、PBS缓冲液（规格：500 ml，pH 7.4，即用型）、牛血清白蛋白（BSA，规格：100 g）和DAB显色试剂盒（规格：200 T），均购于武汉赛维尔生物科技有限公司；超纯水（实验室自制）。
1.3 仪器
BF-08小型高速粉碎机（河北本辰科技有限公司）；HDM-500恒温电热套（上海精密仪器仪表有限公司）；N-
1300 旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；EG1150H石蜡包埋机、RM2016切片机（德国徕卡仪器有限公司）；VS200全玻片扫描仪（日本奥林巴斯有限公司）；Heal Force SMART-N 超纯水机（香港力康生物医疗科技控股有限公司）。2. 方法
2.1 药物制备
将适量瑞香狼毒、狼毒大戟和甘肃大戟的干燥根粉碎成粗粉，各取50 g加至回流提取装置中，用4倍量95％乙醇回流提取3次，每次1 h。将提取液过滤、合并，减压蒸馏回收乙醇，分别得瑞香狼毒、狼毒大戟和甘肃大戟浸膏5.61 g、6.41 g和7.04 g。取适量浸膏，加超纯水制成生药含量为1 g/ml的醇提取物溶液，高压灭菌后备用。
2.2 造模
实验所用的BALB/c雄性小鼠，适应性喂养1周后，背部剃毛约2 cm × 3 cm面积，次日起，除空白组小鼠背部涂抹凡士林外，其余各组小鼠背部均匀涂抹 5% 咪喹莫特软膏，每次涂抹62.5 mg，每日1次，连续7 d。
2.3 分组及给药
将36只小鼠随机分为空白组、模型组、瑞香狼毒组、狼毒大戟组、甘肃大戟组和卡泊三醇组，每组6只。自造模第1 d起，除空白组和模型组外，其余各组小鼠背部在涂抹造模药4 h后，基于Selenge[11]、Wang[12]及徐[13]等人的报道及前期动物预实验结果，按0.4 ml/10 g分别涂抹浓度稀释至2.5 mg/ml的瑞香狼毒醇提取物、狼毒大戟醇提取物、甘肃大戟醇提取物溶液及62.5 mg卡泊三醇软膏，每日1次，连续7 d。
2.4 银屑病面积和严重程度指数（PASI）
每日拍照记录小鼠背部的皮肤变化。并采用 PASI 评分，按照无（0分）、轻度（1分）、中度（2分）、重度（3分）和极度严重（4分）5个等级，对小鼠的红斑（Erythema）、鳞屑（Scales）和浸润（Tickness）程度进行评分，并将三者的评分相加为总评分，取平均分（n = 6）绘制趋势线，以反映小鼠皮损的变化情况。
2.5 苏木精-伊红染色法（HE）
末次给药24 h后，各组小鼠经异氟烷麻醉，脱颈处死后取小鼠背部皮损组织，采用4%多聚甲醛溶液固定24 h以上；经过脱水、石蜡包埋、切片和脱蜡处理后，苏木素染色5 min后，流水冲洗；用 1% 盐酸乙醇分化 0.5 min，流水冲洗 ；用伊红染色2 min，流水冲洗；用乙醇脱水后，二甲苯透化10 min；最后滴加中性树脂封片，自然晾干后，在显微镜下观察皮损组织病理变化，并利用Image J软件测量各组小鼠背部皮损组织表皮层厚度。
2.6 免疫组化（IHC）
取“2.5”项下皮肤组织切片脱蜡、水化，放入柠檬酸缓冲溶液煮沸10 min进行抗原修复，3% H2O2室温阻断内源性过氧化物酶25 min，PBS冲洗3次，3% BSA室温封闭30 min后，PBS冲洗3次，Ki67抗体（1：500）4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次，二抗室温孵育50 min，PBS冲洗3次，DAB显色2 min，流水冲洗终止显色，苏木精复染细胞核 1 min，脱水、透明、封片。风干后置显微镜下观察，并运用Image Pro Plus 8.0 软件统计Ki67阳性细胞数，并计算Ki67阳性细胞百分率及累计光密度（IOD）。
2.7 统计学方法
采用GraphPad Prism 9统计软件进行数据分析及科研绘图；计量资料以
$ \bar x \pm s $ 表示，若满足正态分布且方差齐性，多组间比较采用单向方差分析，以P≥0.05表示无差异，P<0.05表示有差异且具统计学意义，P<0.01表示有显著差异。3. 结果
3.1 三种狼毒醇提取物对银屑病小鼠的影响
如图1所示，空白组小鼠无皮损变化。与空白组相比，模型组小鼠经IMQ诱导后，其背部剃毛区出现不同程度的皮损；造模第4 d可见小鼠皮肤上伴有大面积红斑和片状鳞屑；第7 d斑块颜色有所加深，鳞屑呈层状分布，有部分鳞屑脱落，以上症状均与寻常型银屑病相符。与模型组相比，经瑞香狼毒、狼毒大戟和甘肃大戟干预后的银屑病样小鼠的皮损程度均有所缓解，其中瑞香狼毒醇提取物的效果较为显著，小鼠皮肤上的斑块颜色变浅、鳞屑大面积脱落、浸润程度减轻。
3.2 三种狼毒醇提取物对银屑病小鼠 PASI评分的影响
PASI评分结果显示（图2），小鼠自造模第1 d开始，其红斑、鳞屑、浸润及总积分会随时间推移而升高，在第 5 ～ 7 d达到峰值；而瑞香狼毒组、狼毒大戟组、甘肃大戟组和卡泊三醇组的评分均低于同时期的模型组，且在第 4 ～ 5 d后呈下降趋势，其中以瑞香狼毒组的下降幅度最为显著。
3.3 三种狼毒醇提取物对银屑病小鼠皮损组织病理的影响
皮肤组织病理结果显示（图3），空白组小鼠表皮层厚度相对其余各组明显较薄（图4），基底层细胞正常排列，真皮浅层及血管周围未见明显炎性细胞浸润；模型组小鼠表皮层厚度显著增加，角化过度伴角化不全，角质层可见微脓肿，棘层肥厚，棘突向下延伸呈棒槌状，真皮层内毛细血管扩张，且血管周围淋巴细胞浸润明显，符合银屑病样皮肤组织病理特点。瑞香狼毒组、狼毒大戟组、甘肃大戟组和卡泊三醇组小鼠的表皮层厚度均低于模型组（P<0.01），角化不全有所减轻，浸润情况有所改善。结果表明，三种狼毒醇提物均能抑制银屑病样小鼠表皮细胞的异常增殖，降低炎症细胞的浸润。与临床常见的外用药卡泊三醇相比，瑞香狼毒醇提取物的抗银屑病活性更为显著。瑞香狼毒醇提取物能显著改善IMQ诱导的寻常型银屑病小鼠皮损。
3.4 三种狼毒醇提取物对银屑病小鼠皮损组织中Ki67 表达的影响
免疫组化结果显示（图5），Ki67在银屑病小鼠的皮肤组织中为椭圆形、棕黄色点状分布。各组小鼠表皮中均有Ki67阳性细胞存在，但着色深浅与面积均有差异，其中空白组小鼠的表皮基底层有极少量Ki67表达，呈单层点状分布；与空白组相比，模型组小鼠的阳性表达显著增加（ P<0.01），呈多层密集分布；与模型组相比，三种狼毒均能降低Ki67的表达（ P<0.01），其中瑞香狼毒组中Ki67基本呈单层线状分布，其阳性细胞百分率（图6）和累计光密度值（图7）均显著降低（P<0.01），其抑制作用优于卡泊三醇组。
4. 讨论
中医认为银屑病是由于血热、湿热、风邪[14]等因素导致的，治疗时使用清热解毒、祛风止痒、活血化瘀等中药可有效改善银屑病的症状[15]。据报道，狼毒在治疗血热证银屑病、角化病等皮肤病上具有显著的疗效[11]，在银屑病的治疗和预防方面具有潜在价值和应用前景。然而狼毒的同名异物品种很多，基源多达十几种，使得狼毒的质量和疗效存在一定的不确定性。据历代本草记载和近现代文献考证，瑞香科狼毒属瑞香狼毒 Stellera chamaejasme L.是药用狼毒的主流品种[16]，为狼毒正品，其味苦辛、性平，入肺、脾、肝经，可用于治疗心腹冷痛、结核及疥癣等诸多病症，具有镇痛、免疫调节、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等药理活性[17]，其根含有二萜类、黄酮类和苯丙素类等多种化学成分[18-20]；而大戟科大戟属狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.和月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata分别是䕡茹和草䕡茹[21]，为狼毒的混淆品[22]，且经《中国植物志》中的形态对比，月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata实为甘肃大戟Euphorbia kansuensis Prokh.的异名[23]。狼毒大戟根呈圆锥形，切面可见同心环；月腺大戟根偏椭圆型，切面可见不规则的大理石样纹理或环纹[24]。两者的根含有二萜类、三萜类、酚酸类、生物碱类和蒽醌类等成分[25-27]。
为了探究上述三种基源的狼毒治疗银屑病的疗程差异，本研究对其进行了体内抗银屑病活性实验。结果表明，三个品种的狼毒均能有效改善银屑病样小鼠皮损，其中瑞香狼毒的抗银屑病活性最佳，但其作用机制暂未明确。因此，本课题组后续拟借助中药靶点钩钓技术及体内外研究方式，将进一步探讨瑞香狼毒治疗银屑病的药效成分及作用机制，为银屑病的治疗提供新的思路和方法。同时，也为狼毒的质量控制和标准化提供参考，确保其安全性和有效性。
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图 1 雌激素干预糖尿病EPCs移植降低大鼠脑缺血体积
A.各组大鼠脑切片TTC染色；B.各组大鼠脑缺血体积组间比较。*P<0.05，**P<0.01,与CI组比较；#P<0.05， ##P<0.01,与DM+CI组比较。
图 3 雌激素干预糖尿病EPCs移植改善缺血区血管新生功能
A.缺血部位的VEGFR2免疫荧光染色；B.新生血管计数分析。每个样本随机选取5个视野计算新生血管数量，并计算平均值。*P<0.05，**P<0.01，与 CI组比较；##P＜0.01，与 DM+CI组比较。
表 1 不同处理组大鼠Morris迷宫实验指标对比（
$\bar x $ +s）组别(n=8) 总时间(s) 总路程(mm) 平均速度(mm/s) 潜伏期(s) CI 30.71±18.28 6721.56±4838.88 198.36±78.74 26.34±21.20 DM+CI 35.15±15.29* 7855.55±4262.89* 197.49±59.9 27.93±20.36 DM+CI+EPCs 29.49±13.46# 7459.41±4829.74 236.85±56.49# 25.14±16.04 DM+CI+EPCs+estrogen 28.80±13.75## 8477.04±5226.29 269.68±94.16## 22.41±14.16## *P<0.05，与CI组比较；#P<0.01,##P<0.01，与DM+CI组比较。 
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