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便秘是临床中常见的胃肠道疾病，随着人们生活节奏加快、饮食结构改变、精神心理因素的影响，便秘的患病率不断上升，全球便秘的患病率约为14%，严重影响人们的生活质量[1, 2]。目前，主要采用西药治疗便秘，虽然其在短期内可取得较好的疗效，然而西药不良反应多，停药后易复发，整体疗效欠佳。中医治疗主张治病求本，临床上对便秘的治疗具有丰富的经验，在安全性及长期疗效上更具优势[3, 4]。
通便灵胶囊是北部战区总医院自主研发的医院制剂，由番泻叶、肉苁蓉和当归三味药组成[5]。番泻叶清热导滞，泻下通便，用治热结便秘；当归补血润肠，用治血虚肠燥便秘；肉苁蓉补肾助阳，润肠通便，长于治疗肠燥津枯便秘。三者相合，共奏泻热导滞、滑肠通便之效。番泻叶具有良好的润肠通便的功效[6, 7]，奚肇庆等[8]提出在治疗便秘时可用当归、肉苁蓉润下焦。因此，笔者通过药效学、网络药理学以及分子生物学的方法，探讨通便灵胶囊对小鼠便秘的治疗作用及初步的分子机制。
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KM小鼠，雄性，SPF级20~22 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号（SCXK（辽）2020-0001），适应性饲养7 d，自由饮食和饮水。通便灵胶囊（北部战区总医院制剂室，20220304）；盐酸洛哌丁胺胶囊（西安杨森制药有限公司，MHJ1309）；麻仁丸（李时珍医药集团有限公司，202206003）。羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司，20210615），活性炭粉（国药集团化学试剂有限公司，20211110）。
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取小鼠50只，随机分为5组，每组10只，分别为空白组，通便灵胶囊低剂量（0.2 g/kg）、中剂量（0.6 g/kg）和高剂量（1.8 g/kg）组，阳性药麻仁丸（0.8 g/kg）对照组，每组10只。禁食不禁水12 h后，通便灵胶囊各剂量组按0.2 ml/10 g剂量给予通便灵胶囊混悬液，阳性对照组按0.2 ml/10 g剂量灌胃给予麻仁丸混悬液，空白对照组按0.2 ml/10 g剂量灌胃给予生理盐水，记录排出第 1 粒粪便的时间，同时记录给药3 h内排便的总粒数。
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取小鼠60只，随机分为6组，每组10只，分别为空白组、模型组、通便灵胶囊低剂量（0.2 g/kg）、中剂量（0.6 g/kg）和高剂量（1.8 g/kg）组，阳性药麻仁丸（0.8 g/kg）对照组。模型组和各给药组利用盐酸洛哌丁胺溶液灌胃造模，剂量为6 mg/kg，2次/d，连续2 w，空白组采用等体积蒸馏水灌胃，2次/d，连续2 w。造模后各给药组灌胃给药1次/d，连续灌胃6 d后，禁食不禁水20 h，进行实验。末次给药后30 min，各组小鼠灌服0.5%羧甲基纤维素钠配置的碳末混悬液0.2 ml/只；30 min后小鼠经颈椎脱臼法处死，立刻剖腹后将幽门至回盲部的肠道取出后，肠管全长及墨水在肠管内推进长度在无拉力状况下测量。小肠推进率=幽门至染黑肠管的距离/幽门至回盲部全长×100%。
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通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）分别收集处方中番泻叶、肉苁蓉和当归的成分，以口服生物利用度（OB）≥30%以及类药性（DL）≥0.18为筛选条件，获得通便灵胶囊中的活性成分。将获得的活性成分导入Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）中，收集潜在的靶点。通过Uniprot数据库（http://www.uniprot.org）限定物种为人类，将预测的靶点蛋白名称标准化。
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分别在GeneCards（https://www.genecards.org/）、Disgenet（https://www.disgenet.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）数据库中输入关键词“constipation”，搜索与便秘相关靶点，剔除重复基因，即得。
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将预测的通便灵胶囊靶点与便秘疾病靶点取交集，得到通便灵胶囊治疗便秘的潜在作用靶点。
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将交集靶点导入STRING数据库（http://string-db.org/），获取靶点之间的相互作用关系。设置“Organism”为“Homo Sapiens”，构建PPI 网络，并进行聚类分析。将上述PPI关系导入Cytoscape 3.9.1软件进行可视化处理，对得到的网络进行网络拓扑学分析，以节点度值（degree）和中介中心度（betweenness centrality）来反映“节点”的重要程度，度值和中介中心度的值越大，说明该“节点”在作用网络中越重要。
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将通便灵胶囊治疗便秘疾病作用的交集靶点导入Metascape平台（https://metascape.org/），设置P<0.01进行基因本体（GO）功能及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，得到有效化合物作用靶点的主要生物学功能生物过程（BP）、分子功能（MF）、及细胞组分（CC）的分析。同时得到KEGG代谢通路富集分析，得到通便灵胶囊发挥治疗便秘潜在作用机制。选取排名前20的通路进行可视化处理。
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取小鼠结肠组织，加入含有磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，用低温组织研磨仪匀浆，以4 ℃，14 000 r/min离心20 min，吸取上清液，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。向蛋白样品中加入5×loading buffer混匀，100 ℃煮沸10 min，作为上样样品。通过SDS-PAGE进行电泳，转膜后用5%脱脂奶粉封闭2 h，将PVDF膜分别置于p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、CASP3一抗溶液中，4 ℃孵育过夜，以TBST缓冲溶液洗膜，再将PVDF膜加入二抗溶液中，室温孵育1 h，再以TBST缓冲溶液洗膜，最后PVDF膜上覆盖ECL发光液，用化学发光仪使蛋白条带曝光成像，用Image J软件对蛋白条带进行灰度值分析，以目的蛋白与内参β-actin灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。
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采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，计量资料以（
$ \bar{x} $ ± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05被认为差异有统计学意义。 -
与空白组比较，通便灵胶囊各给药组均可明显缩短排便时间，增加排便粒数，详见表1和图1。
表 1 通便灵胶囊对正常小鼠肠道功能的影响（
$ \bar{x} $ ±s）组别 只 给药剂量（g/kg） 排便时间（t/min） 排便粒数（粒） 空白组 10 − 30.21±2.31 10.30±2.65 通便灵胶囊低剂量组 10 0.2 20.35±2.67* 16.42±3.10* 通便灵胶囊中剂量组 10 0.6 16.62±3.14** 19.64±2.43** 通便灵胶囊高剂量组 10 1.8 13.55±1.29** 24.43±2.37** 阳性对照组 10 0.8 14.98±2.23** 20.55±3.22** *P<0.05，**P<0.01，与空白组比较。 
图 1 通便灵胶囊对正常小鼠肠道功能的影响
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与空白组比较，模型组小鼠小肠推进率明显抑制；与模型组比较，通便灵胶囊各给药组可明显提高小鼠小肠推进率且呈剂量依赖性，见表2和图2。
表 2 通便灵胶囊对小鼠碳末推进的影响（
$ \bar{x} $ ±s）组别 只 给药剂量（g/kg） 推进率（%） 空白组 10 − 70.21±2.31 模型组 10 − 48.64±3.58*** 通便灵胶囊低剂量组 10 0.2 78.35±2.67### 通便灵胶囊中剂量组 10 0.6 86.62±3.14### 通便灵胶囊高剂量组 10 1.8 93.55±1.29### 阳性对照组 10 0.8 92.98±2.23### ***P<0.001，与空白组比较；### P<0.001，与模型组比较。 
图 2 通便灵胶囊对小鼠碳末推进的影响
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通过TCMSP数据库共搜集到通便灵胶囊的活性成分253个，其中番泻叶53个、肉苁蓉75个、当归125个。以OB≥30%和DL≥0.18为条件筛选去重得到16个活性成分，活性成分的基本信息表见表3。利用Swiss target prediction数据库预测活性成分的靶点，借助UniProt数据库标准化并去重后共得到366个潜在靶点。
表 3 通便灵胶囊活性成分信息表
序号 ID号 活性成分 OB DL 中药 1 MOL000358 β-谷甾醇 36.91 0.75 当归、肉苁蓉 2 MOL000449 豆甾醇 43.83 0.76 当归、番泻叶 3 MOL002259 大黄素甲醚葡萄糖苷 41.65 0.63 番泻叶 4 MOL002268 大黄酸 47.07 0.28 番泻叶 5 MOL002276 番泻苷E 50.69 0.61 番泻叶 6 MOL002288 大黄素-1-O-β-D-
吡喃葡葡糖苷44.81 0.8 番泻叶 7 MOL002293 番泻苷D 61.06 0.61 番泻叶 8 MOL002369 番泻苷元A 74.55 0.57 番泻叶 9 MOL002372 角鲨烯 33.55 0.42 番泻叶 10 MOL000359 谷甾醇 36.91 0.75 番泻叶 11 MOL000422 山奈酚 41.88 0.24 番泻叶 12 MOL005320 花生四烯酸 45.57 0.2 肉苁蓉 13 MOL005384 苏齐内酯 57.52 0.56 肉苁蓉 14 MOL007563 鹅掌楸树脂酚B二甲醚 57.53 0.81 肉苁蓉 15 MOL000098 槲皮素 46.43d 0.28 肉苁蓉 16 MOL008871 枫马京 37.05 0.69 肉苁蓉 -
使用GeneCards、Disgenet、OMIM数据库检索收集便秘靶点，经筛选、剔除重复靶点和标准化后共获得1505个便秘相关靶点。应用Draw Venn Diagram 在线工具，绘制韦恩图，活性成分的潜在靶点与便秘靶点取交集，得到潜在作用靶点108个（图3）。
图 3 活性成分靶点与便秘靶点的交集
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在String数据库中导入108个潜在靶点，聚类分析得到6类靶点，通过Cytoscape3.9.1软件中利用“Network Analyze”构建PPI相互作用的PPI网络图（图4），其中节点表示蛋白，边表示蛋白之间相互作用关系，颜色越深、节点越大则度值越大，表明该靶点关联的靶点越多、作用越关键。
图 4 潜在靶点的PPI网络图
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通过Metascape数据库，对通便灵胶囊治疗便秘的28个潜在作用靶点进行GO富集分析，共得到生物学过程（BP）
1421 个条目、分子功能（MF） 101个条目和（CC） 116个条目。BP主要包括蛋白质磷酸化、肽基丝氨酸磷酸化等，CC主要分布在膜筏、膜微区、神经元细胞体等，MF涉及蛋白激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等。根据参数计数进行排序，对 BP、MF、CC 排名前10位的条目用簇状条形图表示（图5）。
图 5 GO富集分析
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KEGG通路富集分析得到168条信号通路，根据P值将KEGG富集分析结果排序，将排在前20条的信号通路进行可视化处理，分类并绘制气泡图（图6），横坐标表示靶点数，纵坐标表示通路名称，通路上靶点数越多颜色越红，靶点数越少颜色越蓝。通便灵胶囊治疗便秘主要与磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B PI3K-Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用等信号通路密切相关。
图 6 潜在靶点KEGG富集分析气泡图
通便灵胶囊对便秘小鼠结肠组织 PI3K、AKT、CASP3蛋白表达水平的影响Western Blot结果显示，与空白组比较，模型组小鼠结肠组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、CASP3的蛋白表达均显著升高。与模型组比较，通便灵胶囊各给药组均能显著下调p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、CASP3的蛋白表达。结果见图7。
图 7 通便灵胶囊对便秘小鼠结肠 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、CASP3蛋白表达的影响
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本研究中的通便灵胶囊由番泻叶、肉苁蓉和当归组成。番泻叶具通便利水、泻热行滞的功效。肉苁蓉可润肠通便、补肾阳和益精血。当归可润肠通便、补血活血、调经止痛。三味药可协同作用于便秘，共奏泻热导滞、滑肠通便之效。
动物实验表明通便灵胶囊具有缩短小鼠排便时间，增加排便粒数的作用；可使便秘小鼠的肠道运动功能增强，使小鼠肠道推进速度加快，显示出通便灵胶囊对便秘等症状具有明显的改善作用，但其作用机制尚不明确。网络药理学可为中药复方的作用机制研究提供一定的参考。
网络药理学是通过归纳、整理文献和数据库中的活性成分和作用靶点，利用在线工具或软件构建药物-靶点网络、药物-疾病网络和富集分析等，结合相关文献系统地分析药物治疗疾病的潜在作用机制，进而阐明中药可以通过多成分、多靶点和多通路作用于疾病[11-13]。本文借助网络药理学的研究方法，根据筛选条件得到16个活性成分和366个靶点蛋白，它们可能是通便灵胶囊发挥通便作用的药效物质基础。网络药理学调控网络分析得出大黄酸、番泻苷、槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等为主要活性成分。通便灵胶囊与便秘的共同靶点共有108个，从一定程度上说明通便灵胶囊发挥通便作用很大可能是通过这108 个潜在靶点作用于便秘。构建关键靶点核心筛选网络显示，AKT1、CASP3、EGFR、HIF1A、PI3K等靶点在便秘过程中发挥重要作用。
GO功能分析结果反映了通便灵胶囊发挥通便效应主要与蛋白质磷酸化等过程密切相关。KEGG通路富集结果、关键通路筛选及查阅相关文献发现通便灵胶囊治疗便秘与PI3K-Akt等信号通路密切相关。PI3K-Akt是一种细胞内信号通路，在细胞周期过程中起着重要的作用，具有细胞增殖与基因修复、凋亡、新陈代谢等作用。进一步的实验研究证明，经通便灵胶囊干预后，便秘小鼠结肠组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、CASP3蛋白表达水平均显著降低，提示通便灵胶囊可能通过抑制PI3K-Akt信号通路改善便秘小鼠的便秘症状及肠道功能，进一步证明了通过 KEGG 预测到的通便灵胶囊发挥治疗作用相关通路的可信性。
综上，本研究考察了通便灵胶囊治疗便秘的药效，整合了网络药理学、生物信息学分析并进行了实验验证，预测了通便灵胶囊治疗便秘的潜在活性成分，关键作用靶点与潜在分子作用机制及生物通路，大黄酸、番泻苷等16个潜在活性成分，通过PI3K、AKT、CASP3等108个靶点，调控PI3K-Akt、神经活性配体-受体相互作用、5-HT等信号通路，发挥其治疗便秘的作用，为进一步深入研究通便灵胶囊通便作用机制提供了理论依据，也为通便灵胶囊治疗便秘的临床应用提供了科学依据。
Study on the efficacy and mechanism of Tongbianling capsule in the treatment of constipation
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摘要:
目的 研究通便灵胶囊治疗便秘的药效以及潜在的作用机制。 方法 观察通便灵胶囊对正常小鼠肠道运动功能和便秘模型小鼠小肠碳末推进率的影响。利用网络药理学找到通便灵胶囊治疗便秘的潜在靶点以及关键通路，取小鼠结肠组织，通过检测p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、CASP3的蛋白表达情况验证其作用机制。 结果 通便灵胶囊使正常小鼠排第一粒黑便时间缩短，粪粒增多；通便灵胶囊便秘模型小鼠碳末推进率增高；网络药理学结果显示通便灵胶囊治疗便秘可能与PI3K-Akt信号通路和5-HT等信号通路有关；Western blot显示各给药组均能显著下调小鼠结肠组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、CASP3的蛋白表达。 结论 通便灵胶囊能有效促进小鼠肠道蠕动，增加排便次数，从而有效治疗便秘；其作用机制可能与PI3K-Akt信号通路直接或间接调节肠道运动功能有关。 Abstract:Object To study the efficacy and potential mechanism of Tongbianling capsule in constipation. Methods The effects of Tongbianling capsule on intestinal motility in normal mice and carbon powder propulsion rate in small intestine of constipation model mice after were observed administration. The potential targets and key pathways of Tongbianling capsule in treating constipation were identified through network pharmacology. To verify the mechanism, the expression of p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT and CASP3 proteins in mouse colon tissue was detected by the western blot. Results The time for mice to excrete the first black stool was shortened and the number of fecal particles was increased in Tongbianling capsule administration group, and the carbon powder propulsion rate of mice in each Tongbianling capsule administration group was increased. The results of network pharmacology showed that treatment of constipation by Tongbianling capsule may be related to signaling pathways such as PI3K-Akt signaling pathway and 5-HT. The protein expression of p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, and CASP3 in mouse colon tissue could be significantly downregulated in administration group. Conclusion Tongbianling capsule could effectively promote intestinal peristalsis in mice, increase the frequency of defecation, and effectively treat constipation. The mechanism of its action may be related to the direct or indirect regulation of intestinal motility by the PI3K-Akt signaling pathway. -
Key words:
- Tongbianling capsule /
- constipation /
- mechanism
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流感是一种严重的上呼吸道病毒感染，由于其高毒力和突变率，该病毒仍然是对公众健康的主要威胁。据美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织估计，每年有多达65 万人死于季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。传统中医药预防和治疗流感病毒导致的感染（如呼吸道肺炎和支气管炎）已成为中国临床上常规治疗策略，发挥了独特的医疗优势[2,3]。
感冒安颗粒是由金银花、连翘、板蓝根、拳参、桑叶、紫苏和荆芥等七味中药制成的复方制剂，临床应用30 多年，具有疏散风邪，解表退热功能，其预防和治疗呼吸道感染的作用已得到很好的临床验证，特别是在病毒感染初期的治疗效果尤其显著，但药效物质基础并不清楚。目前，建立了TLC法对方中的板蓝根和连翘两味药材进行特征鉴别；同时对方中各药味的共有成分绿原酸和齐墩果酸也建立了TLC鉴别方法。在含量限度方面，则建立了制剂中连翘酯苷A的HPLC法。尽管这些获批的标准已用于制剂常规质量控制，但尚需进一步进行质量评价，以期更客观、准确地反映感冒安颗粒的临床疗效。
由于中药复方复杂的化学成分，它的药理作用是通过多靶点、多途径而实现的。流感病毒感染的病理生理过程主要是病毒的直接作用和宿主免疫反应损伤（如细胞因子风暴所致的炎性损伤和ROS导致的氧化应激损伤）的结果[2,4]。为了研究感冒安颗粒临床效果的药效物质基础，我们对组方各药味的化学成分进行了文献追踪，发现方中药味含有多种黄酮类成分，如异槲皮苷、芦丁、木樨草素及木樨草苷等[5-9]。而黄酮类成分对流感病毒的作用越来越受到关注[10,11]。异槲皮苷抑制流感病毒A和B的复制，与抗病毒药amantadine或者oseltamivir合用可抑制它们导致的耐药病毒出现[12]。槲皮素与流感病毒A H1N1（A/PR/8/34）的神经酰胺酶的结合与zanamivir相当，体内研究也证实了其抗流感病毒能力，可作为抗甲型H1N1流感的有效先导化合物[13]。Zima研究认为木犀草素及其同源物是强效流感核酸内切酶抑制剂，揭示黄酮类化合物的抗流感作用[14]。鉴于此，本研究在总黄酮含量测定的基础上[15]，采用HPLC-MS/MS方法建立5 种黄酮类成分的定量方法，不仅为制剂质量评价提供方法学，也为进一步研究感冒安颗粒防治流感病毒引起的呼吸道感染机制奠定物质基础。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS仪，配以Triple Quad B.02.01（B2043.12）数据处理软件（美国安捷伦公司）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；DL-720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。1.2 试药
感冒安颗粒（本院院内制剂，批号110418、110704、111025、111121、111130、111221、120131、120201、120207、120214）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，供UV法测定，含量以92.5 %计，批号：100080-200707）；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以93.9 %计，批号：111521-201004）；木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111520-200504）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100081-200406）；异槲皮苷对照品（成都曼斯特生物制品有限公司，纯度>99.0 %，批号：MUST-10021901）；甲醇为色谱纯；甲酸为分析纯；水为蒸馏水。
2. 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素对照品各适量，用甲醇溶解，摇匀，各配制成500 μg/ml的对照品贮备液。分别精密量取5种对照品贮备液适量，稀释成浓度如下：分别含芦丁0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml，金丝桃苷0.002、0.008、0.020、0.032、0.044、0.056、0.080 μg/ml，异槲皮苷0.03、0.10、0.25、0.45、0.65、0.95、2.00 μg/ml，槲皮素0.02、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.70 μg/ml，木犀草素0.012、0.026、0.040、0.054、0.082、0.096、0.200 μg/ml的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备
按已优化的黄酮提取方法进行[15]。取样品约0.5 g，精密称定，置量瓶中，加70 %甲醇35 ml，超声提取30 min，放冷，过滤，滤液加70 %甲醇溶液定容至50 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.2 色谱-质谱条件
色谱条件：采用Kromasil C 18（4.6 mm×150 mm，5 μm，100 Å）色谱柱；甲醇（A）- 0.1 %甲酸（B）作为流动相，按0～20 min，35 % A；20～40 min，45 % A梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾负离子化（ESI−）源：毛细管电压 3.0 kV；气体温度 350 ℃，气体流速 10 L/min，雾化气压 35 psi。多反应模式（MRM）监测。5种黄酮检测的离子对：芦丁m/z 609.1→300.1、金丝桃苷和异槲皮苷m/z 463.0→300.1、槲皮素m/z 301.0→151.0、木犀草素m/z 285.0→132.9。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测限和定量限
采用上述色谱条件，每个待测化合物对照品用70%甲醇溶液进行系列稀释，分别以信噪比（S/N）等于3和10确定各自的检测限和定量限。结果见表1。
表 1 5种黄酮成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限黄酮化合物 线性方程 相关系数
r线性范围
（ng/ml）检测限
（ng/ml）定量限
（ng/ml）芦丁 Y=24 527X–162.17 0.999 7 250~8 000 0.025 0.50 金丝桃苷 Y=34 123X– 1.7381 0.999 1 2~80 0.005 0.01 异槲皮苷 Y=29 935X+1 597.80 0.999 1 30 ~2 000 0.02 0.50 槲皮素 Y=19 667X+370.71 0.999 2 20~700 0.02 0.10 木犀草素 Y=33 076X–177.98 0.999 7 12~200 0.005 0.01 2.3.2 线性范围考察
精密量取“2.1.1”项下配制的5 种黄酮成分的对照品混合溶液，照“2.2”项下进样测定，记录各待测组分的峰面积积分值。横坐标为黄酮成分质量浓度（X，ng/ml），纵坐标为峰面积（Y），进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果见表1，表明5 种黄酮成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验
精密吸取供试品溶液（批号
120131 ），照“2.2”项下操作，进样，连续测定5 次和连续测定5 d，记录各待测组分的峰面积积分值，计算日内、日间RSD。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的日内精密度RSD分别为1.09 %、1.42 %、1.69 %、0.86 %、1.27 %（n=5），日间精密度RSD分别为1.85 %、1.76 %、1.43 %、2.01 %、1.90 %（n=5），表明仪器精密度良好。2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号
120131 ）5 份，各0.5 g，精密称定，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，并进行含量测定。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的含量分别为260.16、1.84、19.76、13.39、3.73 μg/g（n=5），RSD分别为1.51 %、1.73 %、0.90 %、1.44 %、1.68 %（n=5），表明方法的重复性良好。2.3.5 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号120131）9 份，每份约0.5 g，精密称定，各精密加入对照品贮备液适量，使已知样品中加入的相当对照品量分别含芦丁140.00 μg、金丝桃苷0.90 μg、异槲皮苷10.00 μg、槲皮素7.00 μg、木犀草素1.90 μg的各对照品贮备液，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算加样回收率。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的平均加样回收率分别为：102.06%、101.60%、100.63%、102.81%、101.80%（n=9），RSD分别为1.56%、1.93%、0.67%、2.07%、1.84%（n=9）。
2.3.6 样品含量测定
取10 个批号的感冒安颗粒，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算含量，结果见表2。
表 2 不同批号感冒安颗粒含量测定结果（$\bar x $ ±s, n=3）批号 芦丁 金丝桃苷 异槲皮苷 槲皮素 木犀草素 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 110418 479.83±1.99 0.41 0.855±0.004 0.49 20.54±0.25 1.23 14.83±0.05 0.31 3.46±0.06 1.70 110704 198.98±3.01 1.52 0.596±0.006 1.05 11.79±0.20 1.68 15.31±0.13 0.86 4.51±0.01 0.19 111025 32.23±0.26 0.83 0.993±0.012 1.26 13.31±0.00 0.02 6.53±0.04 0.55 5.15±0.08 1.58 111121 69.18±1.03 1.51 0.499±0.006 1.26 13.36±0.21 1.56 8.04±0.14 1.69 5.65±0.07 1.19 111130 67.53±0.27 0.40 0.533±0.008 1.57 13.36±0.21 1.54 7.48±0.12 1.62 5.42±0.06 1.15 111221 275.38±3.61 1.31 0.291±0.002 0.73 11.44±0.02 0.21 15.74±0.02 0.14 6.51±0.02 0.24 120131 264.55±0.51 0.19 1.825±0.012 0.68 20.29±0.04 0.17 13.66±0.02 1.52 3.78±0.01 0.26 120201 239.19±1.55 0.65 0.593±0.010 1.76 18.95±0.06 0.33 18.41±0.21 1.16 3.86±0.03 0.81 120207 109.20±2.14 1.97 0.503±0.004 0.83 18.00±0.21 1.16 6.72±0.08 1.22 4.21±0.02 0.37 120214 108.93±0.59 0.54 0.461±0.002 0.45 17.67±0.10 0.01 6.32±0.08 1.19 4.73±0.01 0.11 3. 讨论
3.1 MS/MS条件的优化
为了获得良好的MS结果，优化了检测的离子模式、碎裂电压、碰撞能量等参数，以获得高灵敏度的分子离子和碎片离子。结果显示，ESI采用负离子模式可使待测的黄酮成分有更高的灵敏度。对照品混合液经产物离子扫描显示，芦丁的主要碎片为m/z：300.1、271.0；金丝桃苷和异槲皮苷的主要碎片为m/z：300.1、270.8；槲皮素的主要碎片为m/z：178.6、151.0、120.9、106.9；木犀草素的主要碎片为m/z：150.9、132.9、106.8。依据定量碎片离子选择原则，从远离母离子、裂解方式稳定、碎片离子有足够的丰度等方面进行考察，最终选择的碎裂电压、碰撞能量和定量离子如表3所示。由于金丝桃苷和异槲皮苷是结构异构体，它们有相同分子离子峰[M-H]− m/z 463，MS/MS图谱中有相同的产物离子峰m/z 300，这两个化合物通过比较两者在HPLC中的保留时间进行定位。
表 3 5种黄酮化合物的质谱检测参数黄酮化合物 母离子 产物离子 碰撞电压
（U/ V）碰撞能量
（U/ eV）芦丁 609.1 300.1 190 38 金丝桃苷 463.0 300.1 170 25 异槲皮苷 463.0 300.1 170 25 槲皮素 301.0 151.0 130 19 木犀草素 285.0 132.9 150 37 3.2 定量方法学验证
采用已优化的测定条件，感冒安颗粒中5 种黄酮类成分通过与各自标准对照品的保留时间和MS谱图的比较得以鉴别和确认，结果见图1。由于金丝桃苷、异槲皮苷和芦丁均是以槲皮素为苷元，结合不同的糖而形成，金丝桃苷与异槲皮苷还具有相同的分子量，它们的保留时间非常相近。采用HPLC-UV或二极管阵列检测的方法专属性不强，待测成分间相互干扰，很难保证测定结果的准确性。而本研究采用MS/MS-MRM模式测定，实现了准确定量的目的。
图 1 感冒安颗粒提取液5 种黄酮成分的MRM色谱图A. 芦丁的MRM色谱图；B.金丝桃苷、异槲皮素的MRM色谱图；C.槲皮素的MRM色谱图；D.木犀草素的MRM色谱图；1.芦丁；2. 金丝桃苷；3.异槲皮苷；4.槲皮素；5.木犀草素3.3 结果分析
本研究采用经优化的超声提取法提取感冒安颗粒中黄酮成分，用所建立的LC-MS/MS方法测定了10 个批号样品，结果显示，每批样品中均为芦丁含量最高，金丝桃苷含量最低；批间样品同种黄酮成分含量存在差异。为了保证感冒安颗粒质量的稳定性，临床疗效的一致性，对其中的主要黄酮成分可以考虑设定最低限度要求。感冒安颗粒是经传统水提醇沉工艺制得的稠膏制粒而成，我们以往的研究表明，制剂中含有大量的酸性成分[16]，工艺提取过程中的高温、偏低的pH值可能导致金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等苷类黄酮化合物发生水解反应。本研究将3种黄酮苷对照品及生产工艺获得的稠膏经2 % HCl溶液在80 ℃水浴加热处理30 min，进行HPLC-MS/MS分析，处理后的稠膏样品中金丝桃苷和芦丁含量降低，异槲皮苷和槲皮素含量增加；在3种黄酮苷对照品水解液中，均有槲皮素产生；除此之外，芦丁对照品溶液水解还出现了异槲皮苷。由此可以推测，感冒安颗粒的制备工艺可能导致黄酮类成分的水解和转化。
本研究采用HPLC-MS/MS同时测定了感冒安颗粒中5 种黄酮类成分的含量，所建立方法的专属性、灵敏度、精密度和准确性均已得到确证，达到了同时测定多种结构相似的黄酮类成分的目的，为其质量标准的建立提供了方法学依据。我们的研究已经证明感冒安颗粒中含有多种酚酸类成分[17]，本研究又测定了其中的黄酮类成分。这些成分可能共同作用于流感病毒在宿主内复制的多环节，或者改善流感病毒对机体的炎性损伤，降低炎性细胞因子表达，改善氧化应激损伤，提高机体的免疫力等，充分发挥其多途径和多靶点作用优势，为其预防和治疗流感病毒所致呼吸道感染性疾病奠定物质基础。
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图 7 通便灵胶囊对便秘小鼠结肠 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、CASP3蛋白表达的影响
A.p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、CASP3的蛋白表达分析；B.p-PI3K/PI3K 的光密度分析；C.p-AKT/AKT的光密度分析；D. CASP3的光密度分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001,与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较。
表 1 通便灵胶囊对正常小鼠肠道功能的影响（
$ \bar{x} $ ±s）组别 只 给药剂量（g/kg） 排便时间（t/min） 排便粒数（粒） 空白组 10 − 30.21±2.31 10.30±2.65 通便灵胶囊低剂量组 10 0.2 20.35±2.67* 16.42±3.10* 通便灵胶囊中剂量组 10 0.6 16.62±3.14** 19.64±2.43** 通便灵胶囊高剂量组 10 1.8 13.55±1.29** 24.43±2.37** 阳性对照组 10 0.8 14.98±2.23** 20.55±3.22** *P<0.05，**P<0.01，与空白组比较。 
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表 2 通便灵胶囊对小鼠碳末推进的影响（
$ \bar{x} $ ±s）组别 只 给药剂量（g/kg） 推进率（%） 空白组 10 − 70.21±2.31 模型组 10 − 48.64±3.58*** 通便灵胶囊低剂量组 10 0.2 78.35±2.67### 通便灵胶囊中剂量组 10 0.6 86.62±3.14### 通便灵胶囊高剂量组 10 1.8 93.55±1.29### 阳性对照组 10 0.8 92.98±2.23### ***P<0.001，与空白组比较；### P<0.001，与模型组比较。
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表 3 通便灵胶囊活性成分信息表
序号 ID号 活性成分 OB DL 中药 1 MOL000358 β-谷甾醇 36.91 0.75 当归、肉苁蓉 2 MOL000449 豆甾醇 43.83 0.76 当归、番泻叶 3 MOL002259 大黄素甲醚葡萄糖苷 41.65 0.63 番泻叶 4 MOL002268 大黄酸 47.07 0.28 番泻叶 5 MOL002276 番泻苷E 50.69 0.61 番泻叶 6 MOL002288 大黄素-1-O-β-D-
吡喃葡葡糖苷44.81 0.8 番泻叶 7 MOL002293 番泻苷D 61.06 0.61 番泻叶 8 MOL002369 番泻苷元A 74.55 0.57 番泻叶 9 MOL002372 角鲨烯 33.55 0.42 番泻叶 10 MOL000359 谷甾醇 36.91 0.75 番泻叶 11 MOL000422 山奈酚 41.88 0.24 番泻叶 12 MOL005320 花生四烯酸 45.57 0.2 肉苁蓉 13 MOL005384 苏齐内酯 57.52 0.56 肉苁蓉 14 MOL007563 鹅掌楸树脂酚B二甲醚 57.53 0.81 肉苁蓉 15 MOL000098 槲皮素 46.43d 0.28 肉苁蓉 16 MOL008871 枫马京 37.05 0.69 肉苁蓉
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