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曲马多是一种具有阿片受体激动剂性质的合成镇痛药，一般用于急、慢性疼痛，中、轻度癌症疼痛，骨折或各种术后疼痛、牙痛等[1]，长期使用曲马多可导致成瘾。由于曲马多的缓释制剂、复方制剂在中度及以上疼痛的老年患者中应用范围和使用剂量不断扩大，曲马多引起的不良反应、药物相互作用等潜在不合理用药（PIM）案例报道呈现上升趋势[2]。2023年7月1日起，中国将曲马多复方制剂列入第二类精神药品目录。建立快速测量患者体液中曲马多的方法，有助于减少该类药物滥用和潜在不合理用药。
口服盐酸曲马多约60%的剂量由肾脏代谢，29%的剂量以原型经尿液排出体外[3]。目前检测体液中曲马多的方法一般是采用高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）法[4-5]，但这些方法灵敏度低，且相对耗时、费力，检测成本较高，很难在基层的临床药品检测中大规模推广。分子光谱技术由于其快速、无损、高效、简单的特点，犹如拉曼光谱技术，近几年在临床药品检测中逐渐被推广应用[6-9]，如用于快速监测血清中卡马西平[8]以及尿液中氯氮平的监测[9]。2015年，Alharbi等[10]利用表面增强拉曼光谱（SERS）检测模拟人工尿液中曲马多的含量，其检测限（LOD）可以达到657.5 ng/ml，这已经非常接近临床使用曲马多需要检测的药物浓度。
为了尽量减少尿液中成分对SERS信号影响，本研究提出用液-液萃取（LLE）来改进基于SERS的尿液中待测成分检测[11-12]。LLE-SERS法测定患者服用曲马多后的真实尿液样品，能够快速确认患者是否服用曲马多以及监测尿药浓度，有助于确定曲马多在缓解老年患者疼痛时的个体化合理剂量，最大程度降低因曲马多药物相互作用带来的药物不良反应和不良事件，提高患者的依从性。此外，本研究还测定了老年患者服用包含曲马多在内多种药物后的尿液，并观察同时服用的其他药物是否干扰曲马多的SERS检测。
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BWS415-785H便携式拉曼光谱仪（美国B& W Tek Inc.）；KQ-250DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Vortex-Genie2多功能旋涡混合器（美国 Scientific Industries 公司）；TG16-WS 离心机（上海卢湘仪离心机有限公司）；电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；TU-1902 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Zeiss EVO MA-10 扫描电子显微镜（德国 Carl-Zeiss 公司）。
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盐酸曲马多（99.0%，中国食品药品检定研究院）；柠檬酸三钠（C6H5NaO7·H2O，国药集团化学试剂有限公司）；硼酸钠（Na2B4O7）、氢氧化钾（KOH）、硝酸银（AgNO3）、碘化钾（KI）、硫酸镁（MgSO4）、异丙醇（iPrOH）、氯仿（CHCl3）、甲苯（C7H8）和乙醚（C4H10O） （分析纯， 购自上海试剂公司）。
本研究使用了空白尿液及医院患者的真实尿液，取样后立即冷冻并储存于−80℃低温冰箱。医疗期间盐酸曲马多收集时间和使用情况的信息，以及从健康志愿者和患者获得的人尿液样本的分析得到了当地伦理委员会的批准。
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精密称量盐酸曲马多对照品100 mg，配制成浓度为100 μg/ml的储备液。再利用去离子水按照浓度梯度稀释，依次得到浓度为 10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45 μg/ml的曲马多溶液。
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按照Lee等[13]的方法制备银胶。在300 ml去离子水中加入54 mg AgNO3并不断加热至微沸，然后加入6 ml质量分数为1%的C6H5NaO7· H2O溶液，继续加热并充分搅拌约1 h，直到溶液变为灰绿色，停止加热，自然冷却至室温，置于棕色玻璃瓶中，避光保存。
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银胶中加入5 μl KI溶液（1 mol/L），孵育20 min去除银胶表面杂质信号，然后取10 μl胶体与5 μl样品混合，并加入2 μl MgSO4（0.01 mol/L，加入Mg2+目的是团聚银胶颗粒以增强检测信号），最后将混合物加入石英玻璃管中，立即置于拉曼光谱仪中采集光谱。真实尿液实验步骤同空白尿液。
将盐酸曲马多溶解在水中，浓度范围为0.5～100 μg/ml。此外，对掺入空白尿液中的盐酸曲马多使用相同的浓度范围。
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光谱检测参数如下：激光波长785 nm，分辨率5 cm−1，积分时间3 s，扫描次数为1次，激光功率为 7 mW。
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将1 ml尿样与0.05 ml一定浓度的药物溶液混合在4 ml EP管中。然后，用Na2B4O7/KOH缓冲溶液调节pH至7。添加1 ml萃取剂氯仿∶异丙醇（9∶1，V/V）以从尿样中提取曲马多。在室温下剧烈震荡后，以
6000 r/min 离心5 min。弃去上层清液，取下层液0.5 ml至试管里，用氮气仪吹干下层液，加入与下层液等量的去离子水，用于进一步实验。 -
采用BWSpec软件对采集到的光谱原始数据进行初步处理，主要为光谱平滑和基线校正，然后利用 Matlab 软件对数据进行光谱波段的截取，选取300～
1800 cm−1 处的光谱数据进行分析，再采用Origin 8软件对处理好的数据进行绘图。 -
紫外图谱表征：使用紫外分光光度计在 300～700 nm 波长范围内对银胶进行紫外光谱扫描，并观察物质的紫外特征吸收峰。银纳米颗粒的紫外吸收光谱如图1所示。银纳米颗粒的紫外可见吸收光谱仅在419 nm处有一个吸收峰，半峰宽较窄，这反映出银纳米颗粒大小较均匀，具有良好的分散性。
图 1 银胶的紫外可见光吸收光谱图
扫描电镜表征：使用扫描电子显微镜（SEM）扫描纳米银胶颗粒，观察纳米银胶颗粒的形态。银胶颗粒形似球状，大小均匀，直径约为50 nm。
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将盐酸曲马多对照品溶于去离子水中，改变溶液的pH值，并评估了其对SERS的影响。使用Na2B4O7/KOH缓冲液将溶液pH值调整在4.5～8之间变化，立即获取SERS数据。由图2可知，样本pH 为7.0时，盐酸曲马多SERS信号最强。
图 2 盐酸曲马多水溶液在pH值4.5～8的SERS光谱
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Borong等研究发现氯仿∶异丙醇（9∶1）比氯仿或正丁醇能更有效提取尿液中吗啡[6]。本文评估了氯仿、氯仿∶异丙醇（9∶1）以及甲苯和乙醚提取空白尿液加标和真实尿液的效果，以993.8 cm−1的相对峰强度为指标。SERS检测结果显示空白尿液加标和真实尿液中曲马多993.8 cm−1信号均以氯仿∶异丙醇（9∶1）作为萃取剂时最强，乙醚作为萃取剂时最弱，故选定氯仿∶异丙醇（9∶1）作为曲马多的萃取溶剂（图3）。
图 3 基于LLE法采用不同溶剂所得的SERS光谱
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由图4A可见，未经前处理尿样直接进行拉曼光谱仪测定，结果显示空白尿液中尿素分子信号与空白尿液加标的704 cm−1和800～850 cm−1处的拉曼信号部分重叠。该干扰峰是由尿素分子中的肌氨酸酐干扰引起的，因此不应把704 cm−1和800～850 cm−1处作为特征峰。而993.8 cm−1处受尿素分子的拉曼信号干扰较弱，可初步选作快速鉴定尿液中存在曲马多的定性依据。此外，经LLE尿液中曲马多的前处理方法，993.8 cm−1处目标分子的特征峰信号受尿液干扰进一步变弱，信号明确增强。
图 4 空白尿液加标与真实尿液的基质成分对曲马多测定的干扰
图4B可见，由于真实尿液与空白尿液的澄清度不如去离子水，影响了检测器对拉曼散射光的感应，其特征峰较水溶液中信号相对较弱。同时空白尿液与真实尿液中其他杂质与曲马多形成竞争关系，共同吸附在银胶金属粒子表面，产生一定抑制作用，对特征峰峰形也有一定的影响。因此经LLE尿液中曲马多的前处理方法，真实尿液中993.8 cm−1特征峰信号最强。
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Kimani等[14]研究显示曲马多的 SERS 以 452、660、704、804、836、993.8、
1172、 1253、 1288、 1448 和1603 cm−1 处的峰为主。由图5可得，研究发现804、836与993.8 cm−1在低浓度情况下SERS信号较强，但银胶基底SERS的峰与曲马多804、836 cm−1处峰重合，故本研究以993.8 cm−1 处尿液中曲马多峰为特征峰。
图 5 空白尿液加标与银胶的SERS光谱图
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经查阅文献，头孢拉定与阿托品均以原形药物形式从尿液排出，且他们的特征峰也在993.8cm−1附近[15-16]，这可能会影响曲马多的检测。为了进一步验证以上药物同时服用时对尿液中曲马多的检测是否有干扰，本研究采用LLE 预处理并使用SERS检测空白尿液加头孢拉定、阿托品及曲马多的样本。由图6可知，空白尿液加头孢拉定、阿托品未检测到993.8 cm−1处特征峰，而检测空白尿液加头孢拉定、阿托品及曲马多仍可以清晰地识别出曲马多993.8 cm−1处的特征峰。因此，SERS结合LLE可以实现对同时服用头孢拉定与阿托品的老年患者尿液中曲马多的测定。
图 6 SERS检测空白尿液中含曲马多等多种药物及空白尿液中头孢拉定、阿托品
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配制不同浓度空白尿液中盐酸曲马多溶液（1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/ml），将这些溶液置于拉曼光谱仪下的石英玻璃管中进行拉曼光谱测定，以波峰993.8 cm−1的相对强度（Y）为纵坐标，盐酸曲马多对照品溶液浓度（X）为横坐标，拟合线性回归方程为Y=204.35 X−465.62，回归系数r=
0.9952 ，盐酸曲马多的浓度在1～100 μg/ml范围内与特征峰993.8 cm−1的相对强度呈良好线性关系。取上述盐酸曲马多对照品溶液逐级稀释测定，测得盐酸曲马多的定量限（S/N=10）和检测限（S/N=3）分别为 1.54 μg/ml和0.53 μg/ml。
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取“3.4.2”项下曲马多分别为 5、50、80 μg/ml的加标溶液，分别于1 d和1周内重复测定6次，测得日内精密度和日间精密度（RSD）及准确度（RE）见表1。结果表明，低、中、高含量的日内精密度、日间精密度及准确度均良好。
表 1 回收率、精密度及准确度
浓度
（μg/ml）平均
回收率
（n=3）RSD
（n=5）日内精密度（n=6） 日间精密度（n=6） RSD（%） RE（%） RSD（%） RE（%） 5 93.01 3.92 3.38 −1.47 4.61 −4.03 50 96.5 4.27 3.33 −2.64 4.68 4.67 80 94.9 4.68 3.54 −2.92 4.65 −4.91 -
取“3.4.2”项下标准品液配制低、中、高（ 5、50、80 μg/ml）3个浓度的加标溶液，每个浓度3份供试样品，按“2.3”项下处理并用SERS测定，测得结果与实际浓度比值计算回收率，见表1。
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同回收率试验，配制3个浓度的盐酸曲马多加标溶液，于−25 ℃冷冻后，按“2.3”项下处理并用SERS测定，每个样本重复冻融5次，计算RSD，见表1。
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通过检测3位服用曲马多患者的尿液样本，SERS分析结果可以清楚地识别出患者尿液中曲马多的特征峰。根据标准曲线可得患者A、B、C尿液中曲马多浓度分别为39.55、33.74、27.57 μg/ml。因此，SERS结合LLE可以实现对服用曲马多者尿液中曲马多的快速、灵敏的测定。
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对比Alharbi等[10]的研究使用人工尿液做模拟试验，本研究进一步对临床上服用曲马多患者的真实尿液进行检测，采用LLE前处理方法降低尿液中成分对背景 SERS 信号的影响，曲马多的检测限与之前的研究相当（530 ng/ml），证明了本方法检测真实尿液中曲马多的有效性，且方法简单、高效、经济，可以用于曲马多个性化用药的定性和定量分析，并进一步扩展至其他潜在不适当药物的监测。
Rapid determination of tramadol in urine by surface-enhanced Raman spectroscopy
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摘要:
目的 应用液-液萃取（LLE）-表面增强拉曼光谱（SERS），建立快速检测尿液中曲马多的方法。 方法 以氯仿∶异丙醇（9∶1）萃取剂从尿液中提取曲马多，采用增强拉曼光谱（波长为785 nm）检测尿液样品中的曲马多。 结果 曲马多的定量曲线Y=204.35 X−465.62，r= 0.9952 ，线性范围为1～100 μg/ml，该方法曲马多的检测限（S/N=3）为0.53 μg/ml；与常规方法相比，SERS具有高灵敏度及合理的重现性。结论 此方法简单、高效、经济，可以用于曲马多个性化用药的定性和定量分析。 Abstract:Objective To establish a method for rapid detection of tramadol in urine by liquid-liquid extraction（LLE）-surface-enhanced Raman spectroscopy （SERS）. Methods Tramadol was extracted from urine with chloroform∶isopropyl alcohol （9∶1） extractant and detected in urine samples by enhanced Raman spectroscopy （wavelength 785 nm）. Results The quantitative curve of tramadol was Y=204.35 X−465.62, r= 0.9952 , and the linear range was 1-100 μg/ml. The detection limit of tramadol by this method （S/N=3）was 0.53 μg/ml. The sensitivity of SERS was higher than that of conventional methods, and it had reasonable reproducibility.Conclusion This method is simple, efficient and economical, and can be used for qualitative and quantitative analysis of tramadol personalized medicine. -
花椒为芸香科植物红花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.或青花椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.的干燥成熟果皮，味辛，性温，具有温中止痛、杀虫止痒的功效，主治脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛[1]。生物碱是花椒的主要特征性成分，组成丰富、结构多样，具有抗炎、镇痛、抗菌、抗氧化、降脂和抗肿瘤等多种药理活性[2-8]。其中，不饱和脂肪酰胺类生物碱如羟基-α-山椒素（HAS）、羟基-β-山椒素（HBS）已经被证实能够调节脂质代谢，对非酒精性脂肪肝病等代谢性疾病的预防具有潜在效果[9]。然而，对花椒生物碱的制备、富集纯化工艺优化的研究较少。花椒生物碱高效提取与纯化是其后续活性评价和产品开发的基础，有利于花椒药用价值的深度开发，因此优化花椒生物碱的富集纯化工艺具有重要意义。
大孔吸附树脂法是最常用的富集纯化手段，具有选择性好、吸附能力强、富集效果好、环保绿色等优点，在中药材、中药制剂方面应用广泛[10-11]。因此，本实验以HAS、HBS的得率为指标，筛选适宜纯化花椒生物碱的大孔树脂类型，采用单因素实验和正交试验确定树脂的最佳吸附、除杂、洗脱条件，建立大孔树脂富集纯化花椒生物碱的最佳工艺。采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MSE）技术鉴定成分，以期为花椒生物碱的物质基础研究和进一步的综合开发利用提供科学依据。
1. 材料
1.1 样品
花椒药材（批号：20220705-2，购于陕西省渭南韩城市），经海军军医大学张成中副教授鉴定为芸香科花椒属红花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）的干燥果皮。
1.2 仪器与试剂
1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Acquity I-CLASSTM UPLC 超高效液相色谱系统、Xevo G2-XS 四级杆串联飞行时间质谱（美国沃特世科技有限公司）；R-100型旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；XS205DU电子分析天平（梅特勒托利多科技公司）。
HAS对照品（纯度≥98%，批号：P2834270，源叶）；HBS对照品（纯度≥98%，批号：P2832664，诗丹德）；95%乙醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技公司）；APS-17型、NKA-9型、HP-20型、AB-8型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；HPD-400型大孔吸附树脂（上海一飞生物科技有限公司）；HP-20型大孔吸附树脂（日本三菱化学株式会社）。
2. 方法
2.1 花椒中生物碱成分含量测定方法的建立
2.1.1 溶液的配制
称取50 g花椒于圆底烧瓶中，加入500 ml的50%乙醇，95℃水浴加热，回流提取1 h，共提取3次。过滤后合并滤液，45℃减压浓缩至无醇味，过滤，加水分散至250 ml，即得上样液。
取216 ml上样液，上样于直径为2.7 cm、高度为18.9 cm的三菱HP-20型大孔树脂柱，动态吸附30 min，静置1 h后，取216 ml 20%乙醇除杂24 min；540 ml 80%乙醇洗脱1 h。收集洗脱液，45℃减压浓缩并干燥，即得提取物粉末。
对照品溶液：精密称定HAS、HBS对照品适量，加50%乙醇定容，分别制成0.61 mg/ml、0.11 mg/ml的对照品溶液。
供试品溶液：精密称定适量提取物粉末，加50%乙醇定容后，0.45 μm微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。
2.1.2 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）；流速：0.3 ml/min；检测波长：270 nm；柱温：30℃；进样量：5 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%三乙胺（B）；洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~30 min，35%→50%A；30~36 min，50%→90%A，36~39 min，90%A，39~40 min，90%→10%A。
2.1.3 线性关系
取HAS对照品溶液、HBS对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ml置于5个5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，摇匀后得到系列梯度浓度的标准工作溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.2”项下色谱条件下进样。
2.1.4 精密度
取“2.1.1”项下对照品溶液2.0 ml置于5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，混匀后0.45 μm微孔滤膜过滤，连续进样6次。
2.1.5 稳定性
取“2.1.1”项下的供试品溶液，于0、1、2、4、8、24 h分别进样。
2.1.6 重复性
按照“2.1.1”项方法平行制备供试品溶液 6 份，在“2.1.2”项下色谱条件进样测定。
2.1.7 加样回收率
精密称取已知HAS、HBS含量的花椒生物碱粉末适量, 共取9份，分别准确加入HAS、HBS对照品适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，进样分析并计算加样回收率。
2.2 大孔树脂纯化富集工艺优化
2.2.1 树脂类型
95%乙醇浸泡树脂24 h，充分溶胀后湿法装柱，95%乙醇淋至洗脱液澄清透明，水洗至洗脱液无醇味，备用。取预处理后的不同类型的大孔树脂，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液并进样，计算HAS、HBS的总得率。
2.2.2 上样量
湿法装柱，取“2.1.1”项下制备的上样液450 ml，以2 BV/h上样，流出液每30 ml收集1份。按“2.1.2”项下色谱条件进样，以累计上样体积（V/ml）为横坐标（X），以HAS、HBS的总泄漏率（%）为纵坐标（Y），绘制泄漏曲线。
2.2.3 单因素实验考察上样条件
除变量外固定其他工艺条件（树脂类型、上样量与树脂体积比、除杂溶剂、除杂体积、除杂流速、洗脱溶剂、洗脱体积及洗脱流速分别为三菱HP-20型、1 g∶2.5 ml、10%乙醇，2 BV、5 BV/h、70%乙醇、5 BV及5 BV/h）不变的情况下，分别考察上样液浓度（0.1、0.2、0.4 g生药/ml）、树脂柱径高比（1∶5、1∶7、1∶9）及吸附流速（1、2、4 BV/h）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响。
2.2.4 正交试验考察除杂、洗脱条件
在单因素实验的基础上，采用L9（33）正交试验进一步分析除杂条件（除杂溶剂、体积、流速）、洗脱条件（洗脱溶剂、体积、流速）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响（表1），总结最佳工艺并进行验证。统计分析使用SPSS 26.0 软件。
表 1 除杂、洗脱条件正交试验因素水平表条件 水平 因素 A因素溶剂 B因素体积（BV） C因素流速（BV/h） 除杂 1 蒸馏水 1 2 2 10%乙醇 2 3 3 20%乙醇 3 5 洗脱 1 55%乙醇 3 2 2 70%乙醇 5 3 3 80%乙醇 8 5 2.3 花椒生物碱的化学成分分析
2.3.1 样品制备
精密称定“2.2.4”项下以最佳工艺制备的花椒生物碱粉末5.0 mg，50%甲醇定容至25 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤备用。
2.3.2 色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY HSS T3柱（2.1×100 mm, 1.7 μm）；检测波长：270 nm；流速：0.3 ml/min；柱温：30℃；进样量：3 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~24 min，35%→46%A；24~30 min，46%→90%A；30~32 min，90%A；32~33 min，90%~10%A；33~36 min，10%A。
2.3.3 质谱条件
电喷雾离子源（ESI），正离子模式扫描。离子源温度120℃，雾化气流速为800 L/h，毛细管电压为3.0 kV。锥孔电压40 V，补偿电压80 V。低能量扫描电压6 eV，高能量扫描电压30~60 eV；喷雾器压力为6.5×105 Pa，气帘气体积流量为50 L/h，扫描范围m/z为50~
1500 。亮氨酸-脑啡肽（m/z∶ 554.261 5 [M-H]−）和（m/z∶ 556.277 1[M+H]+）作为外标进行质量实时校正，体积流量设为5 μl/min。MassLynx V4.1工作站使用MSE模式采集质谱数据。
3. 结果与分析
3.1 HPLC图与方法学实验结果
3.1.1 花椒生物碱的HPLC图
供试品HPLC图如图1所示，该色谱条件下，HAS与HBS色谱峰分离度大于1.5、理论塔板数均大于
30000 、峰形稳定、无干扰，能够满足样品分析检测要求。3.1.2 线性关系考察结果
以对照品溶液的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得到HAS的回归方程Y=
3312.7 X−8.887，r=0.999；HBS的回归方程Y=33030 X+12.061，r=0.999。即HAS、HBS分别在进样浓度为24.4~488 μg/ml、4.4~88 μg/ml范围内呈良好的线性关系。3.1.3 精密度实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.94%、0.34%，仪器精密度良好，符合定量测定要求。
3.1.4 稳定性实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.20%、0.43%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。
3.1.5 重复性实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.26% 和0.26%，表明方法重复性良好。
3.1.6 加样回收率实验结果
计算得到HAS低、中、高浓度的加样回收率分别为（103.66±0.62）%、（100.22±3.10）%、（102.47±1.24）%；HBS的低、中、高浓度的加样回收率分别为（101.35±0.89）%、（98.58±2.48）%、（98.86±1.02）%。结果表明该测定方法准确性好，可用于样品中HAS、HBS的含量测定。
3.2 大孔树脂纯化富集工艺
3.2.1 树脂类型的确定
使用三菱HP-20型树脂富集花椒生物碱类成分时，HAS、HBS两成分的总含量（X）最高且结果稳定，结果见表2。因此，优选三菱HP-20型大孔吸附树脂进行后续实验。
表 2 不同类型树脂对HAS、HBS总得率的影响（n=3）树脂类型 HAS、HBS
总浓度（mg/ml）HAS、HBS
总含量（%）$ \bar{X} $±SD（%） APS-17 2.42 4.06 4.06±2.17 NKA-9 2.08 3.50 3.50±1.76 宝恩HP-20 3.68 6.19 6.19±1.09 AB-8 3.58 6.02 6.02±1.28 HPD-400 3.59 6.03 6.03±0.98 三菱HP-20 4.10 6.89 6.89±0.62 3.2.2 上样量的确定
由图2可知，当上样液体积为90 ml时，花椒生物碱开始少量泄漏；随着上样体积增加，流出液中生物碱浓度呈现上升趋势；当上样液为210 ml时，累计泄漏率为9.61%，接近上样液中HAS、HBS总浓度的10%[12]。因此确定最大上样量为210 ml，即上样生药量与树脂体积比约为1 g∶2.5 ml。
3.2.3 上样条件的确定
由图3可知，当上样液浓度为0.2 g生药/ml时，HAS和HBS的得率最高；随着浓度升高，杂质增多，与生物碱竞争吸附活性位点，得率下降；此外高浓度上样液在静置吸附过程中较容易发生絮凝和沉淀现象[13-14]。故优选上样液浓度为0.2 g生药/ml。树脂径高比为1∶7、吸附流速为4 BV/h时，HAS和HBS的总得率最高。故选用树脂径高比为1∶7的三菱HP-20型树脂柱，动态吸附流速为4 BV/h。
3.2.4 除杂、洗脱条件的确定
如表3所示，以HAS、HBS总得率为指标时，影响三菱HP-20型大孔树脂纯化花椒总生物碱的除杂因素依次为除杂溶剂（A）>除杂流速（C）>除杂体积（B）。除杂的最佳条件为20%乙醇、流速为5 BV/h。除杂体积由2 BV提升到3 BV，结果差异并不明显，为节约溶剂、提高效率，优选2 BV为除杂体积。
表 3 除杂条件L9（33）正交设计及结果编号 因素 总得率（%） 除杂溶剂（A） 除杂体积（B） 除杂流速（C） 1 1 1 1 7.87 2 1 2 2 9.09 3 1 3 3 9.31 4 2 1 2 10.33 5 2 2 3 10.42 6 2 3 1 10.67 7 3 1 3 11.82 8 3 2 1 10.73 9 3 3 2 11.66 k1 8.75 10.06 9.71 − k2 10.44 10.07 10.34 − k3 11.37 10.48 10.52 − R 2.62 0.64 0.81 − 由表4可知，洗脱因素对HAS、HBS总得率的影响次序依次为洗脱溶剂（A）>洗脱流速（C）>洗脱体积（B）；最佳组合条件为洗脱溶剂80%乙醇，洗脱体积为5 BV，洗脱流速5 BV/h。
表 4 洗脱条件L9（33）正交设计及结果编号 因素 总得率
（%）洗脱溶剂（A） 洗脱体积（B） 洗脱流速（C） 1 1 1 1 2.55 2 1 2 2 5.38 3 1 3 3 7.15 4 2 1 2 5.75 5 2 2 3 8.11 6 2 3 1 9.57 7 3 1 3 9.20 8 3 2 1 8.28 9 3 3 2 6.36 k1 5.03 5.83 6.80 − k2 7.81 7.26 5.83 − k3 7.95 7.69 8.15 − R 2.92 1.86 2.32 − 3.2.5 花椒生物碱富集纯化最佳工艺及验证
实验确立花椒生物碱制备的最佳工艺为料液比1∶10，溶剂为50%乙醇，95℃水浴加热，每次回流提取1 h，提取3次，过滤后合并滤液；45℃减压浓缩至无醇味，纱布过滤，加水分散至生药浓度相当于0.2 g/ml的上样液；按上样生药量与大孔吸附树脂的体积比1 g∶2.5 ml，上样于三菱HP-20型大孔树脂，树脂柱径高比1∶7，动态吸附流速4 BV/h，静置1 h后，2 BV、20%乙醇以5 BV/h除杂；80%乙醇洗脱，体积5 BV，流速5 BV/h。收集洗脱液，45℃减压浓缩并干燥，即得花椒生物碱提取物。
由表5可知，三次重复实验花椒生物碱得膏率相近，富集纯化后HAS、HBS总含量的RSD为0.87%，证明本方法确定的大孔树脂富集纯化花椒生物碱的工艺稳定可靠，重复性高。此外，经纯化后花椒生物碱中HAS、HBS的含量分别为4.71%、1.02%，与富集纯化前相比，花椒生物碱的含量得到明显升高。
表 5 最佳工艺验证结果编号 得膏率
（%）富集前
总含量（%）富集后
总含量（%）富集后
总含量RSD（%）1 6.88 0.82 5.73 0.87 2 6.91 0.81 5.72 0.87 3 6.95 0.82 5.64 0.87 3.3 生物碱类化合物的鉴定
通过中药系统药理学数据库与分析平台、PubChem、Web of science等数据库和国内外文献，收集花椒的化学成分信息，包括绘制化学结构、整理化合物名称与分子式、利用MasslynxV4.1计算化合物精确质量等，建立共包含95种生物碱的花椒化学成分数据库。
由图4可知，在正离子模式下，生物碱类化合物得到了较好的分离。结合质谱数据、相关文献对照品的裂解规律和紫外吸收，并与自建的花椒化学成分数据库进行对比分析，共识别鉴定或推导出20种生物碱类化合物，包括木兰花碱、茵芋碱、HAS、HBS等（见表6）。
表 6 正离子模式下花椒生物碱类成分碎片离子及鉴定结果峰号 保留时
间（t/min）化合物 分子式 离子模式 理论值
（m/z）实测值
（m/z）误差
（ppm）碎片离子
（m/z）参考
文献1 4.716 木兰花碱 C20H24NO4+ [M]+ 342.170 5 342.169 0 −4.38 342.169 0[M]+, 297.110 6[M-C2H7N]+, 282.088 2[M-C2H7N-CH3]+, 265.085 2[C17H13O3]+, 222.065 3[C15H10O2]+, 191.084 6[C15H11]+, 194.071 4[C14H10O]+, 165.069 3[C13H9]+ [17] 2 5.483 ZP-amide D C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 3 5.877 ZP-amide E C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 320.182 5[M+Na]+ [18] 4 6.043 ZP-amide A C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19] 5 6.724 ZP-amide B C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19] 6 6.793 ZP-amide C C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18, 20] 7 7.222 ZP-amide L C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 8 7.902 ZP-amide K C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 9 12.427 ZP-amide N C18H31NO4 [M+Na]+ 348.215 1 348.213 0 −6.03 349.217 7[M+H+Na]+, 348.213 0[M+Na]+ [18] 10 16.168 茵芋碱 C14H13NO4 [M+H]+ 260.092 3 260.092 3 0.00 229.037 0[M-2CH3]+, 227.056 6[C13H9NO3]+, 202.046 8[C11H8NO3]+, 199.062 5[C12H9NO2], 184.037 9[C11H6NO2]+, 156.043 4[C10H6NO]+, 77.037 7[C6H5]+ [21] 11 22.312 羟基-ε-山椒素 C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 302.171 4[M+K]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [22] 12* 22.701 羟基-α−
山椒素C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [23] 13* 23.113 羟基-β−
山椒素C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.187 5[M-OH]+ [23] 14 23.605 Zanthoamides A C18H27NO4 [M-OH]+ 304.191 3 304.191 3 0.00 345.184 4[M+H+Na]+, 344.181 6[M+Na]+ [24] 15 26.156 羟基-γ−山椒素 C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22] 16 26.379 羟基-γ−
异山椒素C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22] 17 26.786 bungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15] 18 26.957 isobungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15] 19 27.586 α−山椒素 C16H25NO [M+H]+ 248.201 4 248.201 2 −0.81 286.178 3[M+K]+ [23] 20 29.068 四氢花椒素 C18H33NO2 [M+H]+ 296.259 0 296.257 7 −4.39 318.237 8[M+Na]+, 279.137 4[M+H-OH]+ [25] *：为与对照品比对的化合物。 4. 讨论
实验前期，考察了酸提碱沉法与乙醇回流提取法，经比较发现两方法制备得到的花椒生物碱中HAS、HBS含量差别不显著。但以酸性溶液浸提生物碱时，耗时长、水溶性杂质较多，而且酸性溶液可能会使部分生物碱吸收氢离子导致质子化从而发生重排反应，破坏分子结构，综合考虑下本实验选择乙醇回流提取法。
HAS、HBS是花椒的代表性酰胺类生物碱，具有降脂、抗氧化、麻醉、神经营养等多种活性，受到研究者的广泛关注[15-16]。本实验确立的工艺能够有效富集花椒生物碱，显著提高HAS、HBS含量，为后续HAS、HBS单体化合物的制备提供了基础。实验过程中尝试通过优化除杂条件、分段收集乙醇洗脱液等方法分离黄酮与生物碱类成分，但UPLC-Q-TOF-MSE得到的BPI图中，8~11 min仍存在着部分响应较高的黄酮类物质无法完全分离，后续还需要探索其他有效的方法进一步去除黄酮类成分。
本实验在单因素实验基础上采用正交设计考察了花椒生物碱的最佳纯化工艺，利用UPLC-Q-TOF-MSE对生物碱成分进行分析鉴定，使用HPLC对制备得到的花椒生物碱中的HAS、HBS进行含量测定。本纯化工艺简单可行、稳定有效，可为花椒生物碱的综合开发利用及工业化生产提供科学依据，对提升花椒的综合经济价值具有深远意义。
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表 1 回收率、精密度及准确度
浓度
（μg/ml）平均
回收率
（n=3）RSD
（n=5）日内精密度（n=6） 日间精密度（n=6） RSD（%） RE（%） RSD（%） RE（%） 5 93.01 3.92 3.38 −1.47 4.61 −4.03 50 96.5 4.27 3.33 −2.64 4.68 4.67 80 94.9 4.68 3.54 −2.92 4.65 −4.91 
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