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曲马多是一种具有阿片受体激动剂性质的合成镇痛药，一般用于急、慢性疼痛，中、轻度癌症疼痛，骨折或各种术后疼痛、牙痛等[1]，长期使用曲马多可导致成瘾。由于曲马多的缓释制剂、复方制剂在中度及以上疼痛的老年患者中应用范围和使用剂量不断扩大，曲马多引起的不良反应、药物相互作用等潜在不合理用药（PIM）案例报道呈现上升趋势[2]。2023年7月1日起，中国将曲马多复方制剂列入第二类精神药品目录。建立快速测量患者体液中曲马多的方法，有助于减少该类药物滥用和潜在不合理用药。
口服盐酸曲马多约60%的剂量由肾脏代谢，29%的剂量以原型经尿液排出体外[3]。目前检测体液中曲马多的方法一般是采用高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）法[4-5]，但这些方法灵敏度低，且相对耗时、费力，检测成本较高，很难在基层的临床药品检测中大规模推广。分子光谱技术由于其快速、无损、高效、简单的特点，犹如拉曼光谱技术，近几年在临床药品检测中逐渐被推广应用[6-9]，如用于快速监测血清中卡马西平[8]以及尿液中氯氮平的监测[9]。2015年，Alharbi等[10]利用表面增强拉曼光谱（SERS）检测模拟人工尿液中曲马多的含量，其检测限（LOD）可以达到657.5 ng/ml，这已经非常接近临床使用曲马多需要检测的药物浓度。
为了尽量减少尿液中成分对SERS信号影响，本研究提出用液-液萃取（LLE）来改进基于SERS的尿液中待测成分检测[11-12]。LLE-SERS法测定患者服用曲马多后的真实尿液样品，能够快速确认患者是否服用曲马多以及监测尿药浓度，有助于确定曲马多在缓解老年患者疼痛时的个体化合理剂量，最大程度降低因曲马多药物相互作用带来的药物不良反应和不良事件，提高患者的依从性。此外，本研究还测定了老年患者服用包含曲马多在内多种药物后的尿液，并观察同时服用的其他药物是否干扰曲马多的SERS检测。
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BWS415-785H便携式拉曼光谱仪（美国B& W Tek Inc.）；KQ-250DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Vortex-Genie2多功能旋涡混合器（美国 Scientific Industries 公司）；TG16-WS 离心机（上海卢湘仪离心机有限公司）；电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；TU-1902 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Zeiss EVO MA-10 扫描电子显微镜（德国 Carl-Zeiss 公司）。
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盐酸曲马多（99.0%，中国食品药品检定研究院）；柠檬酸三钠（C6H5NaO7·H2O，国药集团化学试剂有限公司）；硼酸钠（Na2B4O7）、氢氧化钾（KOH）、硝酸银（AgNO3）、碘化钾（KI）、硫酸镁（MgSO4）、异丙醇（iPrOH）、氯仿（CHCl3）、甲苯（C7H8）和乙醚（C4H10O） （分析纯， 购自上海试剂公司）。
本研究使用了空白尿液及医院患者的真实尿液，取样后立即冷冻并储存于−80℃低温冰箱。医疗期间盐酸曲马多收集时间和使用情况的信息，以及从健康志愿者和患者获得的人尿液样本的分析得到了当地伦理委员会的批准。
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精密称量盐酸曲马多对照品100 mg，配制成浓度为100 μg/ml的储备液。再利用去离子水按照浓度梯度稀释，依次得到浓度为 10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45 μg/ml的曲马多溶液。
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按照Lee等[13]的方法制备银胶。在300 ml去离子水中加入54 mg AgNO3并不断加热至微沸，然后加入6 ml质量分数为1%的C6H5NaO7· H2O溶液，继续加热并充分搅拌约1 h，直到溶液变为灰绿色，停止加热，自然冷却至室温，置于棕色玻璃瓶中，避光保存。
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银胶中加入5 μl KI溶液（1 mol/L），孵育20 min去除银胶表面杂质信号，然后取10 μl胶体与5 μl样品混合，并加入2 μl MgSO4（0.01 mol/L，加入Mg2+目的是团聚银胶颗粒以增强检测信号），最后将混合物加入石英玻璃管中，立即置于拉曼光谱仪中采集光谱。真实尿液实验步骤同空白尿液。
将盐酸曲马多溶解在水中，浓度范围为0.5～100 μg/ml。此外，对掺入空白尿液中的盐酸曲马多使用相同的浓度范围。
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光谱检测参数如下：激光波长785 nm，分辨率5 cm−1，积分时间3 s，扫描次数为1次，激光功率为 7 mW。
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将1 ml尿样与0.05 ml一定浓度的药物溶液混合在4 ml EP管中。然后，用Na2B4O7/KOH缓冲溶液调节pH至7。添加1 ml萃取剂氯仿∶异丙醇（9∶1，V/V）以从尿样中提取曲马多。在室温下剧烈震荡后，以
6000 r/min 离心5 min。弃去上层清液，取下层液0.5 ml至试管里，用氮气仪吹干下层液，加入与下层液等量的去离子水，用于进一步实验。 -
采用BWSpec软件对采集到的光谱原始数据进行初步处理，主要为光谱平滑和基线校正，然后利用 Matlab 软件对数据进行光谱波段的截取，选取300～
1800 cm−1 处的光谱数据进行分析，再采用Origin 8软件对处理好的数据进行绘图。 -
紫外图谱表征：使用紫外分光光度计在 300～700 nm 波长范围内对银胶进行紫外光谱扫描，并观察物质的紫外特征吸收峰。银纳米颗粒的紫外吸收光谱如图1所示。银纳米颗粒的紫外可见吸收光谱仅在419 nm处有一个吸收峰，半峰宽较窄，这反映出银纳米颗粒大小较均匀，具有良好的分散性。
图 1 银胶的紫外可见光吸收光谱图
扫描电镜表征：使用扫描电子显微镜（SEM）扫描纳米银胶颗粒，观察纳米银胶颗粒的形态。银胶颗粒形似球状，大小均匀，直径约为50 nm。
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将盐酸曲马多对照品溶于去离子水中，改变溶液的pH值，并评估了其对SERS的影响。使用Na2B4O7/KOH缓冲液将溶液pH值调整在4.5～8之间变化，立即获取SERS数据。由图2可知，样本pH 为7.0时，盐酸曲马多SERS信号最强。
图 2 盐酸曲马多水溶液在pH值4.5～8的SERS光谱
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Borong等研究发现氯仿∶异丙醇（9∶1）比氯仿或正丁醇能更有效提取尿液中吗啡[6]。本文评估了氯仿、氯仿∶异丙醇（9∶1）以及甲苯和乙醚提取空白尿液加标和真实尿液的效果，以993.8 cm−1的相对峰强度为指标。SERS检测结果显示空白尿液加标和真实尿液中曲马多993.8 cm−1信号均以氯仿∶异丙醇（9∶1）作为萃取剂时最强，乙醚作为萃取剂时最弱，故选定氯仿∶异丙醇（9∶1）作为曲马多的萃取溶剂（图3）。
图 3 基于LLE法采用不同溶剂所得的SERS光谱
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由图4A可见，未经前处理尿样直接进行拉曼光谱仪测定，结果显示空白尿液中尿素分子信号与空白尿液加标的704 cm−1和800～850 cm−1处的拉曼信号部分重叠。该干扰峰是由尿素分子中的肌氨酸酐干扰引起的，因此不应把704 cm−1和800～850 cm−1处作为特征峰。而993.8 cm−1处受尿素分子的拉曼信号干扰较弱，可初步选作快速鉴定尿液中存在曲马多的定性依据。此外，经LLE尿液中曲马多的前处理方法，993.8 cm−1处目标分子的特征峰信号受尿液干扰进一步变弱，信号明确增强。
图 4 空白尿液加标与真实尿液的基质成分对曲马多测定的干扰
图4B可见，由于真实尿液与空白尿液的澄清度不如去离子水，影响了检测器对拉曼散射光的感应，其特征峰较水溶液中信号相对较弱。同时空白尿液与真实尿液中其他杂质与曲马多形成竞争关系，共同吸附在银胶金属粒子表面，产生一定抑制作用，对特征峰峰形也有一定的影响。因此经LLE尿液中曲马多的前处理方法，真实尿液中993.8 cm−1特征峰信号最强。
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Kimani等[14]研究显示曲马多的 SERS 以 452、660、704、804、836、993.8、
1172、 1253、 1288、 1448 和1603 cm−1 处的峰为主。由图5可得，研究发现804、836与993.8 cm−1在低浓度情况下SERS信号较强，但银胶基底SERS的峰与曲马多804、836 cm−1处峰重合，故本研究以993.8 cm−1 处尿液中曲马多峰为特征峰。
图 5 空白尿液加标与银胶的SERS光谱图
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经查阅文献，头孢拉定与阿托品均以原形药物形式从尿液排出，且他们的特征峰也在993.8cm−1附近[15-16]，这可能会影响曲马多的检测。为了进一步验证以上药物同时服用时对尿液中曲马多的检测是否有干扰，本研究采用LLE 预处理并使用SERS检测空白尿液加头孢拉定、阿托品及曲马多的样本。由图6可知，空白尿液加头孢拉定、阿托品未检测到993.8 cm−1处特征峰，而检测空白尿液加头孢拉定、阿托品及曲马多仍可以清晰地识别出曲马多993.8 cm−1处的特征峰。因此，SERS结合LLE可以实现对同时服用头孢拉定与阿托品的老年患者尿液中曲马多的测定。
图 6 SERS检测空白尿液中含曲马多等多种药物及空白尿液中头孢拉定、阿托品
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配制不同浓度空白尿液中盐酸曲马多溶液（1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/ml），将这些溶液置于拉曼光谱仪下的石英玻璃管中进行拉曼光谱测定，以波峰993.8 cm−1的相对强度（Y）为纵坐标，盐酸曲马多对照品溶液浓度（X）为横坐标，拟合线性回归方程为Y=204.35 X−465.62，回归系数r=
0.9952 ，盐酸曲马多的浓度在1～100 μg/ml范围内与特征峰993.8 cm−1的相对强度呈良好线性关系。取上述盐酸曲马多对照品溶液逐级稀释测定，测得盐酸曲马多的定量限（S/N=10）和检测限（S/N=3）分别为 1.54 μg/ml和0.53 μg/ml。
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取“3.4.2”项下曲马多分别为 5、50、80 μg/ml的加标溶液，分别于1 d和1周内重复测定6次，测得日内精密度和日间精密度（RSD）及准确度（RE）见表1。结果表明，低、中、高含量的日内精密度、日间精密度及准确度均良好。
表 1 回收率、精密度及准确度
浓度
（μg/ml）平均
回收率
（n=3）RSD
（n=5）日内精密度（n=6） 日间精密度（n=6） RSD（%） RE（%） RSD（%） RE（%） 5 93.01 3.92 3.38 −1.47 4.61 −4.03 50 96.5 4.27 3.33 −2.64 4.68 4.67 80 94.9 4.68 3.54 −2.92 4.65 −4.91 -
取“3.4.2”项下标准品液配制低、中、高（ 5、50、80 μg/ml）3个浓度的加标溶液，每个浓度3份供试样品，按“2.3”项下处理并用SERS测定，测得结果与实际浓度比值计算回收率，见表1。
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同回收率试验，配制3个浓度的盐酸曲马多加标溶液，于−25 ℃冷冻后，按“2.3”项下处理并用SERS测定，每个样本重复冻融5次，计算RSD，见表1。
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通过检测3位服用曲马多患者的尿液样本，SERS分析结果可以清楚地识别出患者尿液中曲马多的特征峰。根据标准曲线可得患者A、B、C尿液中曲马多浓度分别为39.55、33.74、27.57 μg/ml。因此，SERS结合LLE可以实现对服用曲马多者尿液中曲马多的快速、灵敏的测定。
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对比Alharbi等[10]的研究使用人工尿液做模拟试验，本研究进一步对临床上服用曲马多患者的真实尿液进行检测，采用LLE前处理方法降低尿液中成分对背景 SERS 信号的影响，曲马多的检测限与之前的研究相当（530 ng/ml），证明了本方法检测真实尿液中曲马多的有效性，且方法简单、高效、经济，可以用于曲马多个性化用药的定性和定量分析，并进一步扩展至其他潜在不适当药物的监测。
Rapid determination of tramadol in urine by surface-enhanced Raman spectroscopy
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摘要:
目的 应用液-液萃取（LLE）-表面增强拉曼光谱（SERS），建立快速检测尿液中曲马多的方法。 方法 以氯仿∶异丙醇（9∶1）萃取剂从尿液中提取曲马多，采用增强拉曼光谱（波长为785 nm）检测尿液样品中的曲马多。 结果 曲马多的定量曲线Y=204.35 X−465.62，r= 0.9952 ，线性范围为1～100 μg/ml，该方法曲马多的检测限（S/N=3）为0.53 μg/ml；与常规方法相比，SERS具有高灵敏度及合理的重现性。结论 此方法简单、高效、经济，可以用于曲马多个性化用药的定性和定量分析。 Abstract:Objective To establish a method for rapid detection of tramadol in urine by liquid-liquid extraction（LLE）-surface-enhanced Raman spectroscopy （SERS）. Methods Tramadol was extracted from urine with chloroform∶isopropyl alcohol （9∶1） extractant and detected in urine samples by enhanced Raman spectroscopy （wavelength 785 nm）. Results The quantitative curve of tramadol was Y=204.35 X−465.62, r= 0.9952 , and the linear range was 1-100 μg/ml. The detection limit of tramadol by this method （S/N=3）was 0.53 μg/ml. The sensitivity of SERS was higher than that of conventional methods, and it had reasonable reproducibility.Conclusion This method is simple, efficient and economical, and can be used for qualitative and quantitative analysis of tramadol personalized medicine. -
源于药用蓝草类植物的药材统称为蓝草类药材，具有清热解毒、凉血消斑的功效。《中国药典》（2020版）中收载的蓝草类药材有大青叶、蓼大青叶、板蓝根、南板蓝根、青黛5种，其中大青叶和板蓝根基原为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica，蓼大青叶为蓼科植物蓼蓝Polygonum tinctorium，南板蓝根为马蓝Baphicacanthus cusia，而青黛为多基原药材，包括爵床科植物马蓝、蓼科植物蓼蓝或十字花科植物菘蓝[1]。
尽管药典目前明确给出了蓝草类药材确切的基原，然而在历史时期，该类药材的基原却经历了复杂的演变历程[2-4]。蓝类药材中最早入药的蓝实主流基原为蓼科植物蓼蓝，汉代后又出现了十字花科菘蓝，唐代后基原扩展至爵床科马蓝、豆科木蓝Indigofera tinctoria、菊科植物吴蓝等，宋代出现“板蓝根”，其主流基原为马蓝，并自清代逐步被菘蓝替代，而马蓝则成为了南板蓝根的基原；大青叶历代主流基原为马鞭草科大青Clerodendrum cyrtophyllum，而自清代以来，逐步被菘蓝、蓼蓝等蓝草替代；早期青黛为外国传入的贝壳类蓝色染料，后将制作蓝淀时的染缸上浮沫称为青黛[5]；之后，不同版本的《中国药典》记载了青黛的不同基原，如1963版药典记载青黛的基原为马蓝、菘蓝、木蓝、蓼蓝，1977版药典将青黛基原改为马蓝、菘蓝、蓼蓝和豆科植物野青树Indigofera suffruticosa，自1990版的药典开始，仅包括马蓝、菘蓝、蓼蓝三种。
复杂的药材基原往往导致药材市场混伪品的出现，影响临床用药的准确性。尽管蓝草类药材的药效相似，但是临床应用的侧重点却略有差异，比如大青叶长于凉血消斑，对瘟病毒盛发斑者较为适宜[6]；蓼大青叶在抗病毒、抗炎作用上优于大青叶[7]；板蓝根长于解毒利咽，对感冒而致咽喉肿痛、头面红肿者更为适宜；青黛长于泻肝定惊，擅长于治疗肝火犯肺咳嗽及温病抽搐[8-9]。因此，建立一套针对这类药材的鉴定标准，有助于确保临床用药的准确性。
叶片是蓝草类药材的主要入药部位。叶形、叶脉、叶表皮显微结构是开展叶片类药材分类鉴定的主要依据。然而，在药材炮制后，叶片被切段或打碎，丧失了叶形和叶脉特征，这使得叶表皮显微特征成为了鉴定上述叶类药材的主要依据。这些显微特征包括表皮细胞的形状、气孔器的类型、表皮附属物分布等特征，可为鉴定叶类药材的基原提供重要参考。
前人基于叶表皮显微特征开展了大青属内物种的叶片鉴定研究[10-11]，结果显示不同物种植物叶片的显微结构具有明显差异，但蓝草类药材涉及到多个科属，只有尽量涵盖历史文献中所涉及的物种，才可为药材的准确鉴别提供更加全面的参考标准。本文系统整理了蓝草类所涉及的物种及其近缘种（隶属于3科4属，共10个物种），基于光学显微镜和扫描电子显微镜，开展上述物种叶片显微特征的观察分析，该研究将为以叶片入药的蓝草类药材准确的物种鉴定提供参考依据。
1. 材料和方法
本文共收集10个物种（表1），菘蓝采集于北京延庆艾药园菘蓝种植基地，其余9种来自于中国科学院植物研究所国家标本馆（PE），遵守标本馆的取样规定，所有材料取自蜡叶标本台纸上粘附的小包内的叶片碎片，未对标本造成破坏。
表 1 蓝草类相关药材的取样信息（PE馆）中文名 拉丁文 采集人 采集号 采集地 采集时间 大青 Clerodendrum cyrtophyllum 武陵队 1482 中国湖南 1988-09-29 蓼蓝 Polygonum tinctorium - 津武161 中国天津 1972-08-23 宽翅菘蓝 I. violascens N. Androssow s.n. 俄罗斯 1902-04-09 三肋菘蓝 I. costata 关克俭 582 中国新疆 1957-06-02 小果菘蓝 I. minima - F253 中国甘肃 1964-05-13 翅柄马蓝 Strobilanthes wallichii 湘西考察队 698 中国湖南 1984-09-02 曲枝假蓝 S. dalzielii K.Y. Chan 1263 中国香港 1973-10-10 球花马蓝 S. pentstemonoides 姜恕，赵从福 0351 中国西藏 1967-11-04 板蓝 S. cusia 236-6队 1419 中国福建 1974-09-12 将冰醋酸和双氧水1∶1混合，然后在50 ℃水浴中对获取的叶片碎片进行加热，在体视显微镜（Nikon SMZ1000）下分离叶片上下表皮，进而用甘油封装成临时制片，最终于光学显微镜（Leica DM4 M）和扫描电子显微镜（Hitachi S–3400N）下观察分析。表皮结构的描述采用Dilcher提出的术语体系[12]。
利用下列公式计算气孔指数（SI）：SI（%）=100×SD/（ED+SD）[13]，其中SD为气孔密度，即单位面积内气孔数目，ED为表皮细胞密度，即单位面积内除气孔外的其他表皮细胞数目。
2. 结果
本文从表皮细胞形状、细胞垂周壁形态、气孔器类型、表皮附属物等指标对10个物种进行详细分析（表2，图1、2）。光镜下观察有利于开展植物气孔和表皮细胞分布式样以及气孔密度的分析；电镜下观察有利于进行表皮细胞附属物以及气孔副卫细胞式样的分析，分析结果表明，10个物种表皮结构特征具有显著差异。
表 2 蓝草类药材叶表皮显微特征物种 表皮细胞 气孔器 表皮附属物 形状 垂周壁 分布位置 副卫细胞 刚毛 非腺毛/腺毛 大青 上下表皮细胞均呈不规则多边形 强烈弯曲，下表皮细胞比上表皮细胞弯曲更明显，形成“拼图状”图案 下表皮 无规则型 上下表皮均有分布，非叶脉处为圆形刚毛，叶脉上刚毛常为倒钩形 腺毛在上下表皮均有，稀疏分布 菘蓝 上下表皮细胞均呈不规则多边形 上下表皮弯曲程度一致，相对平直 上下表皮均有分布 无规则型 未发现 未发现 蓼蓝 上下表皮细胞均呈不规则多边形 上表皮细胞较平直，下表皮细胞较弯曲，形成“拼图状”图案 上下表皮均有分布 平列型 未发现 上下表皮四细胞腺毛，三细胞非腺毛 宽翅菘蓝 上下表皮细胞均呈不规则多边形 上表皮细胞比下表皮细胞弯曲程度更明显 上下表皮均有分布 无规则型 未发现 未发现 三肋菘蓝 上下表皮细胞均呈不规则多边形 上表皮细胞比下表皮细胞弯曲程度更明显 上下表皮均有分布 无规则型 未发现 未发现 小果菘蓝 上下表皮细胞均呈不规则多边形 上表皮和下表皮细胞均强烈弯曲，呈“拼图状”图案 上下表皮均有分布 无规则型 未发现 未发现 翅柄马蓝 上下表皮细胞均呈不规则多边形 上表皮和下表皮细胞均强烈弯曲，呈“拼图状”图案 下表皮 环细胞型 未发现 多细胞非腺毛主要分布在上下表皮的叶脉处 曲枝假蓝 上下表皮细胞均呈不规则多边形 上表皮和下表皮细胞弯曲程度基本一致 下表皮 聚环细胞型 未发现 上下表皮均有非腺毛分布 球花马蓝 上下表皮细胞均呈不规则多边形 上表皮和下表皮细胞弯曲程度基本一致 下表皮 环细胞型 未发现 上下表皮均有腺毛和非腺毛分布 板蓝 上下表皮细胞均呈不规则多边形 上表皮和下表皮细胞弯曲程度基本一致 下表皮 环细胞型/
聚环细胞型未发现 上下表皮均有腺毛和非腺毛分布 
图 1 光学显微镜下蓝草类药材的叶表皮显微特征A-B.大青；C-D.菘蓝；E-F.蓼蓝；G-H.宽翅菘蓝；I-J.三肋菘蓝；K-L.小果菘蓝；M-N.翅柄马蓝；O-P.曲枝假蓝；Q-R.球花马蓝；S-T.板蓝；A、C、E、G、I、K、M、O、Q、S.上表皮；B、D、F、H、J、L、N、P、R.下表皮
图 2 扫描电子显微镜下蓝草类药材的叶表皮显微特征A-D.大青；A.上表皮圆形刚毛；B.上表皮毛基；C.下表皮倒钩形刚毛；D.下表皮气孔器；E-F.菘蓝；E.上表皮气孔器；F.表皮腊质附属物；G-I. 蓼蓝；G.上表皮气孔器；H.下表皮三细胞非腺毛；I.下表皮四细胞腺毛；J.宽翅菘蓝上表皮气孔器；K.三肋菘蓝下表皮气孔器；L.小果菘蓝上表皮气孔器；M-O.翅柄马蓝；M.上表皮非腺毛；N.下表皮气孔器；O.下表皮腺毛；P-Q.曲枝假蓝下表皮；P.非腺毛；Q.气孔器；R-T.球花马蓝；R.上表皮非腺毛；S.下表皮腺毛；T.下表皮气孔器；U-X.板蓝；U.上表皮腺毛；V.上表皮非腺毛；W.下表皮气孔器；X.下表皮非腺毛10个物种表皮细胞形态基本一致，均为不规则多边形，但是垂周壁的形态存在显著差异，比如大青（图1A、1B）、蓼蓝（图1E、1F）、小果菘蓝（图1K、1L）、翅柄马蓝（图1M、1N）等物种的垂周壁明显弯曲，形成典型的“拼图”图案，其他物种则相对平直，如球花马蓝（图1Q、1R）、板蓝（图1S、1T）等物种。
根据气孔的分布位置，可将10个物种分为两类，第一类为仅在下表皮分布，包括大青（图1A、1B）、翅柄马蓝（图1M、1N）、曲枝假蓝（图1O、1P）、球花马蓝（图1Q、1R）、板蓝（图1S、1T）；第二类为在上下表皮均有分布，包括蓼蓝（图1E、1F）、菘蓝（图1C、1D）、宽翅菘蓝（图1G、1H）、三肋菘蓝（图1I、1J）、小果菘蓝（图1K、1L）。关于这5个物种上下表皮间气孔丰富度的差异，气孔密度和气孔指数指示了基本一致的趋势（表3），比如蓼蓝上表皮的气孔密度和气孔指数均小于下表皮。副卫细胞主要包含3种类型，平列型的物种为蓼蓝（图1E、1F、2G）；无规则型的物种包括大青（图1A、1B、2D）、菘蓝（图1C、1D、2E）、宽翅菘蓝（图1G、1H、2J）、三肋菘蓝（图1I、1J、2K）和小果菘蓝（图1K、1L、2L）；环细胞型或/和聚环细胞型的物种则包括翅柄马蓝（图1M、1N、2N）、曲枝假蓝（图1O、1P、2Q）、球花马蓝（图1Q、1R、2T）、板蓝（图1S、1T、2W）。
根据表皮附属物的有无，可将10个物种分为两类，第一类为具有刚毛、腺毛/非腺毛或者蜡质层等附属物的物种，包含大青（图2A-2C）、蓼蓝（图2H、2I）和马蓝属翅柄马蓝（图2M、2O）、曲枝假蓝（图2P）、球花马蓝（图2R、2S）、板蓝（图2U、2V、2X）4个物种；第二类为未观察到表皮附属物的类群，包括菘蓝属四个物种。
3. 讨论
表皮细胞特征是一种重要的植物分类学指标，在实际应用中主要基于表皮细胞的形态和垂周壁的弯曲程度[14]。在本研究的所有类群中，表皮细胞均为不规则多边形，但是垂周壁的弯曲程度呈现显著差异。其中大青和蓼蓝的下表皮细胞垂周壁的弯曲程度明显高于上表皮细胞，呈现类似“拼图状”图案，这种图案在小果菘蓝和翅柄马蓝的上下表皮细胞均有呈现。宽翅菘蓝和三肋菘蓝上表皮细胞垂周壁的弯曲程度高于下表皮细胞。相比于以上类群，菘蓝、曲枝假蓝、球花马蓝和板蓝的垂周壁却相对较平直。上述结果表明表皮细胞的形态和垂周壁的弯曲程度在同属内物种间呈现不同的特征，反而在不同属物种间呈现相似的特征。因此，为准确区分这些物种，还需要结合其他的植物学性状。
气孔器是开展植物不同属以及属内种间分类研究的重要指标，主要包括气孔器分布式样、气孔数目多少以及副卫细胞类型等性状[15]。在本研究类群中，大青属和马蓝属的气孔器仅分布在下表皮，但前者的副卫细胞为为无规则型，后者则以环细胞型和聚环细胞型为主；蓼属和菘蓝属的上下表皮均有气孔器的分布，前者副卫细胞为平列型，后者为无规则型，这表明气孔器的分布位置和副卫细胞类型可将四个属区分开。
气孔密度和气孔指数可反应单位面积气孔数目的相对多少，但是气孔密度容易受到环境因素（如温度、水分等）的影响，气孔指数受这些因素的影响较小，可以更加真实地反应气孔与表皮细胞的相对多少[16-17]。大气CO2浓度是影响气孔指数的主要因素，不同植物对大气CO2波动的响应方式不同，比如随着大气CO2浓度上升，有些植物气孔指数下降，而有些植物却上升[16]，所以直接对比不同植物的气孔指数的意义不大。计算上下表皮的气孔指数的比值可看出两者表皮气孔数目相对差异，具有一定的分类学价值。因此，本研究仅统计上下表皮均有气孔器分布的物种（表3）。通过计算比值，我们发现，在菘蓝属的四个物种中，宽翅菘蓝和三肋菘蓝的上表皮气孔密度低于下表皮，菘蓝上表皮气孔密度高于下表皮，而小果菘蓝上下表皮气孔参数基本一致。与菘蓝属物种明显不同的是，蓼属蓼蓝的上表皮的气孔密度和气孔指数均小于下表皮，表明了上表皮的气孔器丰富度低于下表皮的气孔器。这些数据表明不同物种上下表皮气孔对大气CO2的响应方式存在差异。
表 3 蓝草类药材叶表皮气孔参数统计*物种 上表皮 下表皮 比值** SD SI SD SI 范围 均值 SE 范围 均值 SE 范围 均值 SE 范围 均值 SE SD SI 蓼蓝 66-91 75 3.57 0.09-0.11 0.10 0.00 322-365 339 6.30 0.19-0.21 0.20 0.00 0.22 0.5 菘蓝 239-302 280 9.06 0.24-0.28 0.26 0.01 225-247 236 3.35 0.24-0.26 0.25 0.00 1.19 1.04 宽翅菘蓝 151-203 186 7.76 0.21-0.23 0.22 0.00 239-267 251 3.86 0.21-0.22 0.22 0.00 0.74 1 小果菘蓝 231-283 252 9.28 0.23-0.26 0.24 0.00 220-278 255 8.37 0.24-0.26 0.25 0.00 0.99 0.96 三肋菘蓝 146-165 152 2.74 0.17-0.19 0.18 0.00 179-212 194 5.53 0.21-0.23 0.22 0.00 0.78 0.82 注：SD：气孔密度（mm−2）；SI：气孔指数；SE：标准误差；*每个物种的气孔参数均统计了6个不同区域；**比值=上表气孔参数均值/下表皮气孔参数均值。 表皮附属物也具有一定的分类学价值[18]。在大青属中上下表皮发现有刚毛和腺毛分布，蓼属和马蓝属中上下表皮仅分布有腺毛/非腺毛，而在菘蓝属内，上下表皮均没有发现刚毛和腺毛/非腺毛的存在。
基于上述表皮细胞、气孔器及表皮附属物等分类学指标，我们发现仅靠单一指标无法将所有10个物种准确区分开，因此，在进行物种鉴定时，需要整合多个指标。在此我们建立了基于上述性状的物种分类检索表（图3），为蓝草类药材的物种鉴定提供参考依据。
该研究以蓝草类药材为例，为叶片类药材的分类鉴定提供了研究范例，尤其针对药材经过炮制后叶片为碎片的物种，这将促进临床用药的准确性。
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表 1 回收率、精密度及准确度
浓度
（μg/ml）平均
回收率
（n=3）RSD
（n=5）日内精密度（n=6） 日间精密度（n=6） RSD（%） RE（%） RSD（%） RE（%） 5 93.01 3.92 3.38 −1.47 4.61 −4.03 50 96.5 4.27 3.33 −2.64 4.68 4.67 80 94.9 4.68 3.54 −2.92 4.65 −4.91 
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