下载:
下载:
-
阿霉素（DOX）是一种蒽环类化疗抗生素，尽管其能有效治疗多种实体肿瘤和血液恶性肿瘤，但对肿瘤细胞和正常细胞的无差别攻击导致的毒副作用，使其临床应用受到限制[1-3]。特别是剂量依赖性心脏毒性最为突出，研究认为氧化应激是诱导心脏毒性的重要机制。其他常见的毒副作用还包括急性恶心呕吐、口腔炎、胃肠道紊乱、脱发、神经障碍和骨髓发育不全等[4-6]。同时，多药耐药的出现是DOX使用的附加问题[2]。因此，需要寻求DOX新的剂型结构来降低药物毒副作用带来的风险。
金纳米粒（AuNPs）具有毒副作用小、生物相容性良好的特性，且其具有粒径大小可调控、表面易修饰、高效的光热转化等优势，常被用于肿瘤的诊断和治疗[7-8]。AuNPs表面可修饰连接抗肿瘤药物、靶向肽、荧光物质或功能化基团等，实现精准治疗和实时监测[9]。常用的修饰配体为巯基（-SH），以形成Au-S键的方式连接在AuNPs表面，也可利用氨基与AuNPs的静电作用构建载体，但有研究表明，巯基比氨基作用更强，不易断裂[10]。
本研究制备了一种载DOX的mPEG修饰金纳米粒AuNPs-mPEG@DOX，验证了该纳米载体在保持对乳腺肿瘤细胞杀伤活性的同时，降低了DOX对正常乳腺细胞的毒副作用，为后续AuNPs连接DOX用于肿瘤治疗提供参考。
-
ZD-85A型气浴恒温震荡培养箱（上海启前电子科技有限公司）；十万分之一电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；超纯水系统、数显pH计（均为德国Sartorius公司）；HDC-15K型离心机（上海泰坦科技股份有限公司）；Zetasizer nano ZS型激光粒度分析仪（英国Malvern公司）；1260 Infinity II型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；UV1800型紫外可见分光光度仪（中国TECHCOMP公司）。
-
金纳米粒（20 nm，南京东纳生物科技公司）；HS-mPEG5K（上海芃硕生物科技有限公司）；HS-DOX（西安瑞禧生物科技有限公司）；乙腈、三乙胺、磷酸，均为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）。
-
人乳腺细胞（MCF-10A）、人乳腺癌细胞（MCF-7），均由海军军医大学药学系药剂学教研室提供。
-
用纯水溶解HS-mPEG5K得到浓度为1 mg/ml的HS-mPEG5K溶液，向1 ml AuNPs（50 μg/ml）中加入5 μl HS-mPEG5K溶液，4 ℃孵育8 h，孵育结束后于4 ℃、以12000 g离心10 min，弃去含未反应HS-mPEG5K的上清液，纯水重悬。
-
用纯水溶解HS-DOX得到浓度为44.7 μg/ml的HS-DOX溶液，取上步1 ml AuNPs-mPEG重悬液离心，弃去上清液，用0.75 ml纯水重悬后，加入0.25 ml HS-DOX溶液， 4 ℃孵育8 h，离心弃去含未反应HS-DOX的上清液，纯水重悬。
-
取1 ml AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX溶液于马尔文Zeta电位样品池，使用激光粒度分析仪测定粒径和Zeta电位，每个样品测量3次。
-
取1 ml AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX溶液于石英皿中，扫描波长400 nm～700 nm，以纯水作为各样品的纯溶剂参比进行光谱分析。
-
向1 ml 50 μg/ml AuNPs中加入5 μl HS-mPEG5K溶液，4 ℃孵育8 h后离心去上清，分别用0.9375、0.875、0.75、0.5 ml 纯水重悬AuNPs-mPEG，再分别加入0.0625、0.125、0.25、0.5 ml HS-DOX溶液，得到投药浓度分别为2.79、5.59、11.18、22.35 μg/ml的反应体系，4 ℃孵育8 h，离心取上清液，通过高效液相色谱法（HPLC）对上清液进行定量检测，考察HS-DOX投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响。具体检测方法见“2.3”项。
-
色谱柱：Extend-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 µm）；流动相：水（0.1%三乙胺，磷酸调节pH 3.0）∶乙腈=75∶25；流速：1.0 ml/min；进样量：10 µl；柱温：室温；检测波长：254 nm。
-
对照品溶液：精密称取HS-DOX 4.47 mg，加纯水在100 ml量瓶中定容，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，得到浓度为44.7 μg/ml的HS-DOX对照品溶液。
供试品溶液：1 ml AuNPs-mPEG离心沉淀用0.75 ml纯水重悬，加入0.25 ml HS-DOX（44.7 μg/ml），4 ℃孵育8 h，离心取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
-
配制以下溶液：A：5.59 μg/ml HS-DOX对照品溶液；B：1 ml AuNPs-mPEG离心沉淀用0.75 ml纯水重悬，加入0.25 ml纯水混合，4 ℃孵育8 h，离心取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，为空白基质溶液；C：供试品溶液。
-
用纯水稀释HS-DOX对照品溶液，制得HS-DOX浓度为1.40、2.79、5.59、11.18、22.35 μg/ml的标准工作液。以峰面积（A）为纵坐标，质量浓度（μg/ml）为横坐标进行线性回归。
-
分别选取低、中、高3个质量浓度（1.40、5.59、22.35 μg/ml）的HS-DOX标准工作液，1 d内进样3次，每次每个浓度连续进样5次，计算峰面积的相对标准偏差（RSD），考察日内精密度；连续进样3 d，每次每个浓度连续进样5次，考察日间精密度。
-
取对照品溶液和供试品溶液于室温下储存，分别于0、4、8、12、16、24 h测定HS-DOX的含量，计算RSD。
-
取9份供试品各1 ml，分别加入1 ml的含8.12、10.15、12.18 μg的HS-DOX对照品溶液混合，每组平行制备3份，得到80%、100%、120%加样量的加样供试品溶液。根据以下公式计算HS-DOX的加样回收率。
$$ \text{加样回收率}=\frac{{\mathrm{m}}_{\text{测得量}}-{\mathrm{m}}_{\text{原有量}}}{{\mathrm{m}}_{\text{加入量}}}\times 100{\%} $$ -
测定离心后的上清液，根据以下公式计算吸附率和载药量。
$$\begin{array}{c} \text{吸附率}=\displaystyle\frac{{\mathrm{m}}_{\text{投药}}-{\mathrm{m}}_{\text{上清}}}{{\mathrm{m}}_{\text{投药}}}\times 100{\%}\text{；}\\\text{载药量}=\displaystyle\frac{{\mathrm{m}}_{\text{吸附}}}{{\mathrm{m}}_{\text{吸附}}+{\mathrm{m}}_{\text{金纳米粒}}}\times 100 \% \end{array} $$ -
分别取MCF-10A和MCF-7细胞，用DMEM混合培养基调整细胞密度为5×104 cells/ml，以每孔0.1 ml的体积铺板于96孔板，37 ℃下孵育24 h。分别用相同摩尔浓度的AuNPs-mPEG@DOX和游离DOX（0.02、0.06、0.18、0.53、1.58、4.75、14.25 μmol/L）处理24 h和48 h，每种药物浓度重复3个孔。用10%的CCK8溶液染色30 min。
-
实验结果用(
$\bar x $ ±s)表示。采用GraphPad Prism v9 （San Diego, USA）软件进行统计分析。两组间比较采用Two-Way ANOVA ，P≤0.05认为差异有统计学意义。 -
AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的粒径分布和Zeta电位如表1所示，3种纳米颗粒的粒径逐渐增大，Zeta电位由负电荷转为正电荷，最终得到水动力直径为（46.12±0.49） nm，电位为（18.60±1.51） mV的AuNPs-mPEG@DOX。AuNPs与HS-mPEG5K孵育后，部分柠檬酸根被甲氧基聚乙二醇取代，连接了PEG长链的AuNPs-mPEG更稳定不易聚集，粒径增大，负电荷减少；连接HS-DOX后，由于阿霉素含有氨基带正电，因而制备得到带正电荷的纳米颗粒。
表 1 AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的平均粒径和Zeta电位（n=3）
纳米颗粒 平均粒径（nm） 多分散系数 Zeta电位（mV） AuNPs 28.31±0.37 0.38±0.02 −25.30±0.99 AuNPs-mPEG 43.32±1.40 0.38±0.07 −22.20±0.49 AuNPs-mPEG@DOX 46.12±0.49 0.38±0.04 18.60±1.51 -
如图1所示，AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的最大吸收波长分别为524、526、530 nm，随着HS-mPEG5K和HS-DOX被修饰到AuNPs上，最大吸收波长依次出现红移，表明mPEG5K和DOX通过HS键成功连接在AuNPs上。
图 1 AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的UV-Vis光谱图
-
为提高纳米载体的吸附率和载药量，考察了HS-DOX投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响。如表2所示，随着HS-DOX的投药浓度增加，载体的吸附率和载药量都逐渐升高，当投药浓度为11.18 μg/ml时，纳米载体的吸附率和载药量达到最大值，继续提高HS-DOX的投药浓度，载药量不再上升，吸附率降低。表明HS-DOX投药浓度在11.18 μg/ml时，AuNPs表面吸附可能达到饱和，因而选择11.18 μg/ml投药浓度用于制备AuNPs-mPEG@DOX。
表 2 HS-DOX投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响（n=3）
HS-DOX投药浓度
（μg/ml）吸附浓度
（μg/ml）吸附率
（%）载药量
（%）2.79 0.11±0.02 3.96±0.57 0.22±0.03 5.59 0.51±0.16 9.20±2.89 1.02±0.32 11.18 1.03±0.32 9.21±2.88 2.01±0.62 22.35 0.92±0.02 4.13±0.09 1.81±0.04 -
首先考察方法专属性，实验表明，制备过程未对HS-DOX的测定产生影响（图2）。进一步考察HS-DOX的线性，得线性回归方程为y=17.884 x−5.3651，r=0.9999，证明该液相色谱方法在1.40～22.35 μg/ml浓度范围内线性良好。分别考察了1.40、5.59、22.35 μg/ml 3个低、中、高浓度的精密度，见表3，日内精密度和日间精密度均<2.0%，符合精密度要求。对照品溶液和供试品溶液在24 h内基本稳定，其RSD分别为0.78%和1.01%。HS-DOX平均加样回收率为99.06%，RSD为0.83%，回收率符合要求（表4）。结果表明，该液相方法准确可靠，可用于HS-DOX的定量检测。
图 2 HS-DOX的液相色谱图
表 3 HS-DOX 3种浓度的日内和日间精密度（n=5）
浓度
（μg/ml）日内精密度 日间精密度 $\bar x $±s RSD（%） $\bar x $±s RSD（%） 1.40 1.41±0.02 1.70 1.41±0.03 1.79 5.59 5.52±0.08 1.40 5.55±0.10 1.83 22.35 22.37±0.19 0.84 22.36±0.17 0.77 表 4 HS-DOX的加样回收率（n=3）
加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 原有量（m/μg） 回收率（%） 8.12 18.13 10.03 99.75 18.11 10.10 98.65 17.97 9.98 98.40 10.15 20.42 10.21 100.59 20.33 10.30 98.82 20.00 10.02 98.33 12.18 21.95 9.95 98.52 22.18 10.20 98.36 22.19 9.99 100.16 平均回收率（%） 99.06 RSD（%） 0.83 -
AuNPs-mPEG@DOX和DOX对MCF-10A和MCF-7细胞的24 h和48 h毒性作用如图3所示，随着DOX浓度的增加以及药物作用时间延长，MCF-10A和MCF-7细胞的存活率皆降低。在相同DOX浓度下，AuNPs-mPEG@DOX比游离DOX对正常乳腺细胞MCF-10A的毒性作用明显降低，可起到减小DOX毒副作用的目的。当DOX浓度<4.75 μmol/L作用于乳腺癌细胞MCF-7时，游离DOX表现出比AuNPs-mPEG@DOX明显的细胞毒性作用；在DOX浓度≥4.75 μmol/L的情况下，AuNPs-mPEG@DOX与游离DOX表现出无差异的细胞毒性作用。结果表明将DOX修饰于AuNPs上，由于Au-S键稳定存在，以及PEG的长链保护作用，DOX与细胞的直接接触面积减小，可降低对正常细胞的毒副作用。由于肿瘤细胞的高间质液压大，尺寸较大的AuNPs-mPEG@DOX较游离DOX不易被泵回血液和细胞胞吐，在高浓度时，与DOX肿瘤细胞杀伤作用相当。
图 3 AuNPs-mPEG@DOX和游离DOX分别对MCF-10A和MCF-7细胞的24 h和48 h细胞毒性
-
DOX在杀伤肿瘤细胞的同时也会损害机体的正常细胞，其随剂量增加会对心脏、大脑、肝脏和肾脏等器官产生不良反应。同时，它还会损害免疫系统，增加病人对病原体的易感性，削弱他们的愈合能力。本文制备了载DOX的mPEG修饰金纳米粒AuNPs-mPEG@DOX，粒径为（46.12±0.49） nm，电位为（18.60±1.51） mV，最大吸收波长为530 nm。成功建立了可用于检测AuNPs-mPEG@DOX未吸附HS-DOX含量的HPLC方法，在HS-DOX投药浓度为11.18 μg/ml时有最大吸附率和载药量。该纳米载体能明显降低DOX对正常乳腺细胞的毒副作用，且当浓度达到一定值时，具有与游离DOX相同的肿瘤细胞杀伤作用，为后续开发AuNPs连接DOX的肿瘤治疗方案奠定了良好的基础。
纳米颗粒被认为是选择性增加肿瘤细胞内药物积累从而减少毒副作用的重要途径。AuNPs作为无机纳米颗粒的一种，因其独特性质被广泛应用于药物递送、肿瘤诊断和治疗领域。除AuNPs本身结构可降低DOX毒副作用，也可通过在AuNPs表面修饰核酸适配体[11-12]、肿瘤穿透肽[13]等有效靶向和进入肿瘤细胞，减少DOX对正常细胞的损害；或利用肿瘤部位的特殊环境，通过响应型功能键将DOX连接于AuNPs上，如低pH[14]、过表达酶[15]和高水平的GSH[16]等来调控载体尺寸大小和DOX释放，提高载药纳米颗粒在肿瘤部位蓄积量，继而提高抗肿瘤作用。此外，也可以通过将DOX和Varlitinib与PEGAuNPs结合[17]，来增强DOX对肿瘤细胞的抑制作用，降低对正常细胞的毒性。虽然利用AuNPs载DOX同时降低其毒性的策略目前已被广泛研究，但其粒径大小、表面电荷和各类形状等因素对生物分布和细胞摄取的影响，AuNPs表面有限吸附能力带来的载体量过大，以及进入细胞后的代谢途径等问题还需要进行更多的探索。
Preparation and cytotoxicity of doxorubicin-containing gold nanoparticles
-
摘要:
目的 构建载阿霉素（DOX）的甲氧基聚乙二醇（mPEG）修饰的金纳米粒AuNPs-mPEG@DOX，以降低DOX的毒副作用。 方法 制备AuNPs-mPEG@DOX，通过粒径、电位和紫外可见光吸收光谱（UV-Vis）进行表征。考察连接巯基的DOX（HS-DOX）投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响。建立未吸附HS-DOX含量测定的高效液相色谱法（HPLC），对专属性、线性、精密度、稳定性和加样回收率进行考察。采用CCK-8法检测AuNPs-mPEG@DOX对MCF-10A和MCF-7细胞的毒性作用。 结果 成功制备了AuNPs-mPEG@DOX，粒径为（46.12±0.49） nm，电位为（18.60±1.51） mV，最大吸收波长为530 nm。建立了可用于检测AuNPs-mPEG@DOX未吸附HS-DOX含量的HPLC方法，测定最佳投药浓度11.18 μg/ml，HS-DOX条件下的吸附率为（9.21±2.88）%，载药量为（2.01±0.62）%。细胞毒性实验表明AuNPs-mPEG@DOX可明显降低DOX对正常乳腺细胞的毒副作用；DOX在≥4.75 μmol/L时，AuNPs-mPEG@DOX与游离DOX对乳腺肿瘤细胞的细胞毒性作用一致。 结论 AuNPs-mPEG@DOX可有效降低DOX的毒副作用，为后续AuNPs连接药物降低其毒副作用的研究提供参考。 Abstract:Objective To construct methoxy polyethylene glycol (mPEG) modified gold nanoparticles (AuNPs) loaded with doxorubicin (DOX) AuNPs-mPEG@DOX in order to reduce the toxicity and side effects of DOX. Methods AuNPs-mPEG@DOX was prepared and characterized by Z-Average, Zeta potential and UV-Vis spectroscopy. The impact of thiol-linked DOX (HS-DOX) at various dosage concentrations on the drug adsorption rate and drug loading of AuNPs-mPEG@DOX was investigated. Furthermore, a HPLC method was developed to accurately determine the content of unadsorbed HS-DOX in AuNPs-mPEG@DOX. The specificity, linearity, precision, stability and average recovery of this method were thoroughly investigated. The cytotoxic effect of AuNPs-mPEG@DOX on MCF-10A and MCF-7 cells was evaluated using a CCK-8 assay. Results AuNPs-mPEG@DOX was successfully prepared with Z-Average of (46.12±0.49) nm, Zeta potential of (18.60±1.51) nm and the maximum absorption wavelength of 530 nm. An efficient HPLC method for the detection of unadsorbed HS-DOX in AuNPs-mPEG@DOX was devised. The optimal dosage concentration of HS-DOX for AuNPs-mPEG@DOX was determined to be 11.18 μg/ml, resulting in a drug adsorption rate of (9.21±2.88)% and a drug loading rate of (2.01±0.62)%. Cytotoxicity experiments demonstrated that AuNPs-mPEG@DOX significantly reduced the toxic and side effects of DOX on normal breast cells. Additionally, AuNPs-mPEG@DOX and free DOX exhibited comparable cytotoxic effects on breast tumor cells when DOX concentration was equal to or greater than 4.75 μmol/L. Conclusion AuNPs-mPEG@DOX effectively reduce the toxicity of DOX, providing a reference for future research on reducing the toxicity of AuNPs-linked drugs. -
Key words:
- gold nanoparticles /
- doxorubicin /
- breast tumor /
- toxicity
-
子宫内膜异位症（endometriosis，EM）是临床上最为常见的慢性妇科疾病之一，以慢性盆腔疼痛、月经紊乱和不孕为主要的临床表现。EM本质是血瘀证，临床治疗时以活血化瘀为主，常用的药物有桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行等，能够有效缓解患者痛经、非经期盆腔痛等症状[1]。
目前活血化瘀类中药对EM治疗的具体机制不是很清晰，其针对的靶点也不是很明了。网络药理学将生物网络作为研究对象，探究药物、靶点、疾病之间的联系，系统完整地研究药物的机制，可展现出药物对于多个靶点、多个通路不同影响。因为和中医整体观念天然契合，网络药理学现已广泛应用于中药研究中[2-3] 。在本研究中，笔者采用网络药理学的方法探究活血化瘀类中药治疗EM的作用机制，构建“化合物-靶标-通路-疾病”网络，并初步探析何种活血化瘀药在EM治疗中更具优势，为临床用药以及进一步实验研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 活血化瘀类中药确认
根据卫生部“十一五”规划教材《中药学》分类，确认桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行七味活血化瘀药为本次主要研究对象。
1.2 中药有效成分以及相关靶点的获取
利用中药化学成分数据库TCMSP平台（http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），检索七味中药所含活性成分。依据数据库指南要求，将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%以及类药性（drug-like，DL）≥0.18作为筛选条件，对活性成分进行筛选[4]。OB值是评价药物能否发挥药效的重要药动学参数，DL值是指化合物与所有已知药物之间的相似程度。上述2个参数是评价中药化学成分吸收、分布、代谢、排泄的关键参数。获得符合OB、DL参数有效活性成分后，利用TCMSP数据库查询各有效活性成分对应相关靶点。利用Venn图工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对药物化学成分以及相关靶点进行共同点分析，寻找活血化瘀中药共有成分和作用靶点。
1.3 EM相关靶点基因确认
利用美国国立生物技术信息中心Gene数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）将所获靶点信息转换成基因名称。查询GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，获得与EM相关基因靶点。最后将每种中药的作用靶点对应的Gene Symbol与EM基因进行比对，获得每种中药可能影响EM的相关基因，利用Cytoscape 3.6.0软件构建化合物－靶点网络[5]。
1.4 构建蛋白互作网络
为进一步研究靶点之间的相互关系，将活血化瘀药共同靶点上传至线上软件 STRING(http://string db.org)，构建蛋白互作网络。物种选择为Homosapiens，minimum required interaction score调整为highest confidence，隐藏网络图中游离节点，获取PPI网络。
1.5 KGEE通路分析
利用KEGG数据库（https://www.keg g.jp/）查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。筛选各中药KEGG通路中相关基因富集情况，并利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图。
2. 结果
2.1 活血化瘀类中药有效成分及对应靶点的获取
按照要求从TCMSP数据库中筛选出各中药有效成分，删除重复项，共有94种有效成分（supplementary materials table S1）。其中丹参有效活性成分达到65个，而泽兰有效活性成分只有2个。未能发现七味活血化瘀药共同有效成分，但β-谷固醇为川牛膝、红花、桃仁、泽兰所共有，槲皮素为川牛膝、红花、王不留行、益母草所共有，是涉及活血化瘀类中药最多的2种有效成分（supplementary materials table S2）。与此同时，我们找到了七味中药所共有的19个作用靶点（表1），包括孕酮受体（progesterone receptor）、前列腺素G/H合成酶1（prostaglandin G/H synthase 1）、前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2）、凋亡调节剂Bcl-2（apoptosis regulator Bcl-2）、核受体共激活剂（nuclear receptor coactivator 2）等。
表 1 七种活血化瘀中药共有的19个靶点序号 蛋白名称 基因名称 靶点标识码 1 钠通道蛋白5型亚基 SCN5A TAR00070 2 前列腺素G/H合成酶1 PTGS1 TAR00006 3 Beta-2型肾上腺素受体 ADRB2 TAR00261 4 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3 CHRM3 TAR00016 5 孕酮受体 PGR TAR00209 6 半胱天冬酶3 CASP3 TAR04087 7 热休克蛋白HSP 90 HSP90 TAR00444 8 钾电压门控通道亚家族H成员2 KCNH2 TAR00037 9 凋亡调节剂Bcl-2 BCL2 TAR00086 10 PKA催化亚基C-alpha PRKACA TAR00699 11 半胱天冬酶9 CASP9 TAR04090 12 γ-氨基丁酸受体亚基α-1 GABRA1 TAR00309 13 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1 CHRM1 TAR00038 14 前列腺素G/H合酶2 PTGS2 TAR00094 15 转录因子AP-1 JUN,FOS TAR00414 16 磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基，γ亚型 PIK3CG TAR00491 17 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2 CHRM2 TAR00210 18 核受体共激活剂2 NCOA2 TAR03276 19 维甲酸受体RXR-alpha RARA TAR00158 2.2 EM相关靶点确认
利用人类基因数据库查找EM作用靶点，与七味中药有效成分对应靶点进行比对，发现红花所含相关靶点数量最多，达到103个；而桃仁、泽兰所含相关靶点数量最少，为14个（图1A）；王不留行所含相关靶点占有效成分作用靶点比例最高，为54.7%；而桃仁最低，为29.8%（图1B）。经过去重处理后，七味中药所含EM相关靶点共119个（supplementary materials table S3）。利用Cytoscape3.6.0软件进行成分－靶点网络分析，获得图2，其中共计216个节点，其中黄色节点为活血化瘀药有效活性成分，而蓝色节点代表EM相关靶点。利用软件自带分析功能，对于网络各节点度值进行分析，网络中某些节点度值较高，提示该节点为网络中的关键节点（supplementary materials table S4）。在各中药所含有效成分中，槲皮素展现出极高的连接度（度值=87），远超其他有效成分，而其余较高连接度值依次是木犀草素（度值=43）、山柰酚（度值=33）、黄芩素（度值=23）、丹参酮A（度值=20）、花生四烯酸（度值=20）、β-谷固醇（度值=18）。中药是一个多有效成分的复杂系统，一个有效成分可作用于多个靶点，协同作用于某种疾病的治疗。而在靶点的分析中，较高连接度的靶点可能在EM的治疗作用中起着重要的作用。前列腺素G/H合酶2(PTGS2，度值=82）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1，度值=39）两者拥有最高的度值，是临床上炎性疾病治疗的主要靶点；核受体辅活化子2（NCOA2，度值=35）、核受体辅活化子1（NCOA1，度值=34)紧跟其后，同样在各炎症通路中作用显著；凝血酶(度值=31）是临床上治疗出血的重要靶点，直接作用于血液凝固过程的最后一环；Mu-type阿片受体（OPRM1，度值=30）则涉及到中枢镇痛功能。上述靶点均和EM症状及病机之间有着密切的关系。
图 1 七味活血化瘀中药EM相关靶点数量及所占比例A.基于OB≥30%和DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点个数；B.基于OB≥30%、DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点的比例2.3 PPI网络的构建与分析
利用STRING软件构建靶点PPI网络，图中包含119个节点，505条边，所有节点平均度值为8.49，具体见图3。根据“度值>均值”筛选出PPI网络中关键节点56个（supplementary materials table S6），前9位关键节点，平均度值为88，见表2，与PPI网络74%节点存在相互作用关系，提示它们在网络调控中起着关键作用，可能是活血化瘀药物治疗EM的关键所在。
表 2 PPI网络中关键节点节点名称 度值 节点名称 度值 节点名称 度值 ALB 97 IL6 92 PTGS2 83 AKT1 95 TNF 86 CASP3 80 VEGFA 94 MAPK8 83 MAPK1 80 2.4 KEGG通路分析
利用KEGG数据库查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。整理各中药KEGG通路相关基因富集情况，发现七味中药共有信号通路44条（supplementary materials table S5），筛选出与EM密切相关的19条通路（表3）。从表3中，不难发现，19条通路涉及性激素、炎症、细胞调亡以及血管生成等各个方面，其中炎症相关通路达到7条，为所有通路中最多。利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图，根据图4可知，在系列通路中，泽兰与桃仁作用均弱于其他五味中药。而在PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路中，多味中药靶点存在高度富集，红花在PI3K-Akt信号通路中显著富集，远超该药其他通路，值得注意。
表 3 七味活血化瘀中药的19条KEGG通路序号 标识码 信号通路名称 类别 1 hsa04151 PI3K-Akt信号通路 炎症相关 2 hsa04668 TNF信号通路 炎症相关 3 hsa04657 IL-17信号通路 炎症相关 4 hsa04625 C型凝集素受体信号通路 炎症相关 5 hsa04064 NF-κB信号通路 炎症相关 6 hsa04115 p53信号通路 炎症相关 7 hsa00590 花生四烯酸代谢 炎症相关 8 hsa01522 内分泌抵抗 激素相关 9 hsa04915 雌激素信号通路 激素相关 10 hsa04919 甲状腺激素信号通路 激素相关 11 hsa04921 催产素信号通路 激素相关 12 hsa04210 细胞凋亡 细胞凋亡 13 hsa04071 鞘脂信号通路 细胞凋亡 14 hsa01521 EGFR酪氨酸激酶抑制剂拮抗 血管相关 15 hsa04370 VEGF信号通路 血管相关 16 hsa01521 血小板活化 血管相关 17 hsa04722 神经营养蛋白信号通路 疼痛相关 18 hsa04725 胆碱能突触 疼痛相关 19 hsa04726 血清素能突触 疼痛相关 3. 讨论
本研究采用网络药理学的研究方法，从TCMSP数据库中提取出了94个符合标准的成分，通过VENE图去重以及分析网络图的拓扑特性后，发现槲皮素为四味活血化瘀药所共有，与83种EM相关靶点存在关联。现代研究表明，槲皮素具有抑制炎症、血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖的作用，通过抗氧化作用诱导细胞凋亡，还可通过雌激素受体，调控受体下游多种底物及信号通路而调节雌激素[6-7]。木犀草素与41种EM靶点相关联，具有抗炎、抗纤维化、抑制血管生成等作用[8]。EM发生发展过程中慢性炎症反应一直贯穿始终，且存在纤维化病变，木犀草素或在EM治疗中有一定作用[9-10]。
通过VENE图，发现七味中药共有作用靶点19个，部分共有靶点与Cytoscape网络图以及PPI网络中关键节点高度对应，进一步强调了该部分共有靶点在EM中的作用。如PTGS2，该靶点所调控环氧合酶（COX-2）的高表达会导致细胞的高增殖性、高侵袭性，诱导血管生成从而加重EM的疼痛和不孕症状[11]。NCOA2、NCOA1的水平异常与EM的进展关联密切。趋化因子参与子宫内膜异位种植过程中趋化、黏附、侵袭、血管形成及细胞生长分化等多个重要环节[12]。Xiu等发现，在分泌期，NCOA1和趋化因子CXCL12在异位子宫内膜中的表达明显高于正常子宫内膜；活化血小板对异位内膜具有促炎、促血管生成的作用，促使异位内膜细胞的侵袭和增殖[13-14]，子宫内膜基质细胞可分泌F2，以密集依赖的方式诱导血小板活化和聚集，从而影响EM的进展[15-16] 。VEGFA可促进新生血管形成并使血管通透性增加，陈晓莉等[17]研究表明，内异症组血清和腹腔液VEGF水平明显高于对照组，且重度患者腹腔液中VEGF水平高于轻度患者，VEGF在EMT患者血管生成中起促进性作用,在血清与腹腔液中的高表达与疾病发生发展相关。尉伟东等[18]发现CASP3蛋白在异位内膜和在位内膜中的评分明显低于正常对照组，caspase-3的水平下降提示内膜细胞活性下降，促使子宫内膜细胞自发性凋亡增加以及凋亡信号敏感性增强，诱导或加重EM。
利用KEGG数据库，找到了七味活血化瘀药共有EM相关通路19条，涉及性激素、炎症、细胞凋亡以及血管生成等方面。所有通路中，炎症通路达到36%。其中PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路是靶点富集最多的通路，提示活血化瘀药主要通过抗炎作用来对EM起治疗作用。与正常女性相比，EM患者的子宫内膜在位和异位内膜细胞的PI3K表达增加，AKT磷酸化水平升高，证实PI3K/AKT信号通路可影响EM进展[19]。EM是一种雌激素依赖性疾病，呈现出慢性炎症反应，多种炎性因子参与其病理过程，包括NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-17等[20]。许丽华等[21]通过实验发现，EM患者血清及腹腔液中TNF-α水平显著高于对照组。EM患者Ⅲ和Ⅳ期血清和腹腔液中TNF-α水平均高于Ⅰ和Ⅱ期，证实了TNF-α与子宫内膜异位症的发生发展密切相关,有助于子宫内膜异位症的诊断。IL-1家族在EM发生发展中作用显著，与正常女性相比，EM患者静脉血中IL-1β浓度显著增高。不仅仅是IL-1β，研究显示，IL-1β前体蛋白（proIL-1β）也可以加重炎症反应，EM患者腹腔液中IL-1β、proIL-1β水平均高于健康女性。IL-1家族细胞因子的损伤，导致EM患者腹腔免疫机制的紊乱，局部以及全身IL-1β、IL-18调控机制的缺陷，使得内膜组织的侵袭性以及生长性大幅增加，从而导致EM[22-24]。炎症相关通路的高富集也与之前网络图中TNF、IL-6等炎性相关靶点的高度值相对应，进一步强调了活血化瘀药物通过抗炎作用治疗EM的作用机制。细胞凋亡是一种独特的程序性细胞死亡，细胞的有效清除而不会引起炎症反应，EM特征为异位内膜细胞凋亡率下降。与健康女性子宫内膜相比，EM异位内膜抗凋亡因子表达增加，促凋亡因子表达减少，证实了细胞凋亡在EM的发病中确有作用，并和炎症反应存在一定关联[25]。EM发生发展过程中亦伴随着血管生成增多以及局部病灶周期性出血，EM患者异位内膜血管内皮生长因子(VEGF)表达量增高，抗血管生成因子(sFlt-1)表达量下降，证实VEGF信号通路、血小板激活通路均参与此过程，与前面靶点分析也形成呼应[26-27] 。脑源性神经营养因子是各种慢性疾病中慢性疼痛形成和维持的调节因子，EM伴有疼痛的患者血清和腹膜液中神经营养因子浓度明显高于无疼痛EM患者[28]。利用KEGG通路分析，可以发现活血化瘀药对于炎症、凋亡、疼痛、血管生成等相关通路均具备调控作用，进一步强调了临床上活血化瘀药对于EM的治疗价值。
综上所述，活血化瘀中药可通过多靶点、多通路协同作用方式对EM进行治疗，体现了中医药治疗疾病特色。上述七味中药中，桃仁、泽兰对于EM的作用低于其余活血化瘀药，而红花、益母草在EM治疗体系中，EM相关靶点高于其余中药，可能会起到更好的疗效，在临床上可尝试推广使用。本研究从网络药理学角度出发，根据活血化瘀中药有效成分和作用靶点，在一定程度上对活血化瘀中药治疗EM进行了机制的解析，为指导临床用药提供了一定的依据。但本研究仅仅基于TCMSP数据库，利用计算机软件从理论上对活血化瘀中药治疗EM作用机制做了探析，还需要通过实验和临床实践来进一步证实，而且还需要扩大活血化瘀药物探究范围，结合临床实际，深入剖析活血化瘀药共同点与差异之处。
-
图 1 AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的UV-Vis光谱图
注：1. AuNPs-mPEG@DOX；2. AuNPs；3. AuNPs-mPEG。
图 3 AuNPs-mPEG@DOX和游离DOX分别对MCF-10A和MCF-7细胞的24 h和48 h细胞毒性
A.MCF-10A的24 h细胞毒性；B.MCF-10A的48 h细胞毒性；C.MCF-7的24 h细胞毒性；D.MCF-7的48 h细胞毒性*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与DOX组比较。
表 1 AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的平均粒径和Zeta电位（n=3）
纳米颗粒 平均粒径（nm） 多分散系数 Zeta电位（mV） AuNPs 28.31±0.37 0.38±0.02 −25.30±0.99 AuNPs-mPEG 43.32±1.40 0.38±0.07 −22.20±0.49 AuNPs-mPEG@DOX 46.12±0.49 0.38±0.04 18.60±1.51 
下载: 导出CSV
表 2 HS-DOX投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响（n=3）
HS-DOX投药浓度
（μg/ml）吸附浓度
（μg/ml）吸附率
（%）载药量
（%）2.79 0.11±0.02 3.96±0.57 0.22±0.03 5.59 0.51±0.16 9.20±2.89 1.02±0.32 11.18 1.03±0.32 9.21±2.88 2.01±0.62 22.35 0.92±0.02 4.13±0.09 1.81±0.04
下载: 导出CSV
表 3 HS-DOX 3种浓度的日内和日间精密度（n=5）
浓度
（μg/ml）日内精密度 日间精密度 $\bar x $ ±sRSD（%） $\bar x $ ±sRSD（%） 1.40 1.41±0.02 1.70 1.41±0.03 1.79 5.59 5.52±0.08 1.40 5.55±0.10 1.83 22.35 22.37±0.19 0.84 22.36±0.17 0.77
下载: 导出CSV
表 4 HS-DOX的加样回收率（n=3）
加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 原有量（m/μg） 回收率（%） 8.12 18.13 10.03 99.75 18.11 10.10 98.65 17.97 9.98 98.40 10.15 20.42 10.21 100.59 20.33 10.30 98.82 20.00 10.02 98.33 12.18 21.95 9.95 98.52 22.18 10.20 98.36 22.19 9.99 100.16 平均回收率（%） 99.06 RSD（%） 0.83
下载: 导出CSV
-
[1] FAID A H, SHOUMAN S A, BADR Y A, et al. Enhanced cytotoxic effect of doxorubicin conjugated gold nanoparticles on breast cancer model[J]. BMC Chem, 2022, 16(1):90. doi: 10.1186/s13065-022-00889-9 [2] SHAFEI A, EL-BAKLY W, SOBHY A, et al. A review on the efficacy and toxicity of different doxorubicin nanoparticles for targeted therapy in metastatic breast cancer[J]. Biomedecine Pharmacother, 2017, 95:1209-1218. doi: 10.1016/j.biopha.2017.09.059 [3] YANG S, SHIM M K, KIM W J, et al. Cancer-activated doxorubicin prodrug nanoparticles induce preferential immune response with minimal doxorubicin-related toxicity[J]. Biomaterials, 2021, 272:120791. doi: 10.1016/j.biomaterials.2021.120791 [4] CARVALHO C, SANTOS R X, CARDOSO S, et al. Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect[J]. Curr Med Chem, 2009, 16(25):3267-3285. doi: 10.2174/092986709788803312 [5] MEREDITH A M, DASS C R. Increasing role of the cancer chemotherapeutic doxorubicin in cellular metabolism[J]. J Pharm Pharmacol, 2016, 68(6):729-741. doi: 10.1111/jphp.12539 [6] PUGAZHENDHI A, EDISON T N J I, VELMURUGAN B K, et al. Toxicity of Doxorubicin (Dox) to different experimental organ systems[J]. Life Sci, 2018, 200:26-30. doi: 10.1016/j.lfs.2018.03.023 [7] LUAN S Y, XIE R, YANG Y S, et al. Acid-responsive aggregated gold nanoparticles for radiosensitization and synergistic chemoradiotherapy in the treatment of esophageal cancer[J]. Small, 2022, 18(19):e2200115. doi: 10.1002/smll.202200115 [8] 李廷廷, 张娜. 纳米金的表面修饰及其在抗肿瘤中的应用[J]. 药物生物技术, 2015, 22(2):160-164. [9] KIM H S, YOON S, SON Y J, et al. High-yield clicking and dissociation of doxorubicin nanoclusters exhibiting differential cellular uptakes and imaging[J]. J Control Release, 2015, 217:64-73. doi: 10.1016/j.jconrel.2015.08.037 [10] 胡瑞省, 刘善堂, 朱涛, 等. 金纳米粒子通过形成Au-S键的组装[J]. 物理化学学报, 1999, 15(11):961-965. [11] RUAN S B, YUAN M Q, ZHANG L, et al. Tumor microenvironment sensitive doxorubicin delivery and release to glioma using angiopep-2 decorated gold nanoparticles[J]. Biomaterials, 2015, 37:425-435. doi: 10.1016/j.biomaterials.2014.10.007 [12] SUN G Y, DU Y C, CUI Y X, et al. Terminal deoxynucleotidyl transferase-catalyzed preparation of pH-responsive DNA nanocarriers for tumor-targeted drug delivery and therapy[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2019, 11(16):14684-14692. doi: 10.1021/acsami.9b05358 [13] CUN X L, CHEN J T, RUAN S B, et al. A novel strategy through combining iRGD peptide with tumor-microenvironment-responsive and multistage nanoparticles for deep tumor penetration[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2015, 7(49):27458-27466. doi: 10.1021/acsami.5b09391 [14] SUARASAN S, CRACIUN A M, LICARETE E, et al. Intracellular dynamic disentangling of doxorubicin release from luminescent nanogold carriers by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) under two-photon excitation[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2019, 11(8):7812-7822. doi: 10.1021/acsami.8b21269 [15] ZHANG Z M, GAO P C, WANG Z F, et al. DNA-caged gold nanoparticles for controlled release of doxorubicin triggered by a DNA enzyme and pH[J]. Chem Commun, 2015, 51(65):12996-12999. doi: 10.1039/C5CC05164A [16] HE H, MENG S, LI H M, et al. Nanoplatform based on GSH-responsive mesoporous silica nanoparticles for cancer therapy and mitochondrial targeted imaging[J]. Mikrochim Acta, 2021, 188(5):154. doi: 10.1007/s00604-021-04810-4 [17] COELHO S C, REIS D P, PEREIRA M C, et al. Doxorubicin and varlitinib delivery by functionalized gold nanoparticles against human pancreatic adenocarcinoma[J]. Pharmaceutics, 2019, 11(11):551. doi: 10.3390/pharmaceutics11110551 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 3589
- HTML全文浏览量: 4076
- PDF下载量: 107
- 被引次数: 0
