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烧伤通常指热力造成的的组织损伤，以皮肤和黏膜损伤为主，严重时甚至会伤及皮下或黏膜下组织[1,2]。皮肤是身体中最大的器官，当患者处于深Ⅱ度烧伤时，其需要足够的皮肤移植来治疗创面，但当前所用的表皮替代品和上皮移植因存在排异反应而疗效有限[3]。
制痂酊是由黄柏、黄芩、儿茶、冰片组成的临床用于烫伤（Ⅱ度烧伤及以下）、外伤、收敛消炎、抗菌、结痂的特色院内专用复方制剂，收载于《安徽省医院制剂规范》。烧伤的愈合过程与修复机制是现代医学研究的一大难题。在制痂酊中，黄柏、黄芩起清热解毒、泻火燥湿的作用；儿茶能够协助在伤口处形成一层膜，充分发挥防治细菌感染的功效；冰片清凉止痛，通过溶媒乙醇，可增强其穿透力和杀菌作用[4,5]。但有关制痂酊的作用机制尚不明确。
网络药理学是探索药物潜在疗效的新兴学科，基于网络药理学对制痂酊进行分析，找寻制痂酊的活性成分以及潜在的治疗靶点通路，以期从宏观上阐释制痂酊对Ⅱ度烧伤的疗机制。
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在TCMSP（https://tcmsp-e.com/）上以“黄柏”、“黄芩”、“儿茶”、“冰片”为关键词进行检索，以类药性（DL）≥ 0.18，口服生物利用度（OB）≥30%作为筛选标准，得到制痂酊的有效活性成分。
以Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）对有效成分名称进行统一规范[6]。
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以“burn”为关键词，分别在OMMI数据库（https://omim.org）、GeneCards数据库（https://www.genecar ds.or/）和DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org）中进行检索，在此基础上将获得的疾病相关靶点整合并去重复，然后通过Uniprot数据库对其名称进行标准统一化[7]。利用网站Jvenn（http://bioinfo.genotoul. fr/jvenn.）绘制VENN图，获得制痂酊治疗烧伤的潜在干预靶点[8,9]。
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将“1.2”项中的潜在干预靶点和药物、疾病相关信息一起导入Cytoscape中，构建出制痂酊有效成分-靶点-疾病信息网络[10]。
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将“1.2”项中的潜在干预靶点导入STRING11.5数据库（https://www.stringdb.org/），得到交集靶点蛋白互作（PPI）网络关系，然后将数据导入Cytoscape软件进行可视化分析[11]，利用“Network Analyzer”功能获得PPI拓扑学参数，筛选潜在核心靶点[12]。
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利用Metascape数据库（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）进行GO和KEGG通路富集分析。将获取的GO功能富集分析（前10条）和KEGG通路分析（前20条）信息分别绘制出富集气泡图和柱状图[13]。
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将KEGG富集得到的前20条通路与“1.2”项中得到的潜在干预靶点和药物、疾病相关信息一起导入Cytoscape中，构建出制痂酊的“有效成分-靶点-疾病”通路信息网络[14]。
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分别选取Cytoscape软件分析结果中度值前5位的有效成分与潜在作用靶点，先在TCMSP数据库和PCSD PDB数据库（https://www.rcsb.org/）搜索下载小分子化合物和蛋白质的3D结构，再通过AutoDock软件为小分子加氢、加ROOT，为蛋白剔除水分子、加氢等，然后选中所有活性位点,通过AutoDockTools设置对接盒子进行分子对接，最后利用Pymol软件渲染图片并输出结果[15]。
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在筛选条件下，黄柏6个有效成分，黄芩5个有效成分，儿茶5个有效成分，冰片3个有效成分。删除重复项后纳入制痂酊有效成分共19个（表1）。
表 1 “制痂酊”潜在有效化合物
药物 分子ID 活性成分 OB（%） DL 黄柏 MOL001454 小檗碱 36.86 0.78 黄柏 MOL001458 黄连碱 30.67 0.86 黄柏 MOL002636 Kihadalactone A 34.21 0.82 黄柏 MOL013352 黄柏酮 43.29 0.77 黄柏 MOL002641 异黄柏苷 35.86 0.44 黄柏 MOL000358 β-谷甾醇 36.91 0.75 黄芩 MOL001689 刺槐素 34.97 0.24 黄芩 MOL000173 汉黄芩素 30.68 0.23 黄芩 MOL000228 （2R）-7-羟基-5-甲氧基-2-
苯基色满-4-酮55.23 0.2 黄芩 MOL002714 黄芩素 33.52 0.21 黄芩 MOL002908 5,8,2'-三羟基-7-甲氧基黄酮 37.01 0.27 儿茶 MOL002914 黄烷酮 41.35 0.24 儿茶 MOL000422 山柰酚 41.88 0.24 儿茶 MOL000492 （+）-儿茶素 54.83 0.24 儿茶 MOL000073 表儿茶素 48.96 0.24 儿茶 MOL000098 槲皮素 46.43 0.28 冰片 MOL006861 积雪草酸 41.38 0.71 冰片 MOL006862 乙酸龙脑酯 59.3 0.51 冰片 MOL006865 龙脑香醇酮 41.71 0.76 -
在OMMI数据库（https://omim.org）、GeneCards数据库（https://www.genecar ds.or/）和DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org）中进行检索，将先前从数据库所获得的疾病相关靶点进行去重处理，最终得到烧伤靶点3 280个。将制痂酊中活性成分相对应靶点基因与疾病靶点基因结合，得到交集，得到179个关键蛋白，并绘制韦恩图（图1）。
图 1 制痂酊-烧伤VEEN图
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凭借STRING数据库进行PPI网络分析，共得到179个节点、3 602条边，平均节点度40.2（图2）。利用“Cytoscape”软件中“CytoNCA”功能得到其介数中心性、接近中心性、度值[16]，通过筛选得到潜在核心靶点（表2）。
图 2 PPI网络图
表 2 核心靶点及其拓扑参数
序号 核心靶点 度值 介数中心性 接近中心性 1 AKT1 123 1862.290054 0.004366812 2 GAPDH 116 946.1875691 0.004149378 3 TP53 116 840.5996422 0.004132231 4 IL-6 115 1497.996279 0.004219409 5 TNF 114 1024.117839 0.004166667 6 VEGFA 110 658.4220238 0.004032258 7 CASP3 103 644.9615495 0.003968254 8 IL-1B 101 693.7919839 0.003984064 9 MYC 100 764.1003404 0.003891051 10 PTGS2 99 633.2163159 0.00390625 11 EGFR 99 614.1334934 0.003875969 12 ESR1 99 863.6549212 0.003937008 13 HIF1A 95 434.0180719 0.003787879 14 MMP9 94 600.3164537 0.003787879 15 EGF 93 394.6177813 0.003773585 16 FOS 90 1323.795938 0.003816794 17 PTEN 90 499.5157302 0.003787879 18 CCND1 89 327.1005061 0.003703704 19 PPARG 86 440.0419589 0.003676471 20 FN1 83 283.1020522 0.003676471 -
GO功能富集分析主要涉及无机物质反应、细胞对氮化合物反应以及对异种刺激的响应等生物学过程。对GO-BP、GO-MF、GO-CC前10条信息利用网络平台绘制出柱状图（图3）[17]。KEGG通路分析得到154条通路，筛选得到前20条通路进行气泡图绘制（图4）。
图 3 GO富集分析
图 4 KEGG富集分析气泡图
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将信息导入Cytoscape，构建出制痂酊有效成分-靶点-疾病通路信息网络（图5）。该网络说明制痂酊通过多组分、多靶点、多环节发挥对烧伤的治疗作用。
图 5 制痂酊有效成分-靶点-疾病通路信息网络
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以分子对接技术进行验证，通过Cytoscape筛选出制痂酊中活性化合物度值最大的前5个成分，按照度值选择其中5个与PPI网络中度值排名前5的基因（AKT1、GAPDH、TP53、TNF、IL-6）进行分子对接试验，验证其相互作用活性，若结合能<−20.92 kJ/mol，表示具有较好的结合活性，若结合能<−29.30 kJ/mol，表示具有强烈的结合活性[18]。结果显示，β-谷甾醇与AKT1、TNF、GAPDH有强烈的结合活性；槲皮素、山柰酚与AKT1、TP53具有较好的结合活性；汉黄芩素和黄芩素与5个基因都具有较好的结合活性（表3）。化合物的结构如下（图6），将结合活性高的利用Pymol软件绘制并输出对接图片（图7）。
表 3 制痂酊关键化合物-核心靶点分子对接（单位：kJ/mol）
核心靶点 槲皮素 山柰酚 汉黄芩素 黄芩素 β−谷甾醇 AKT1 −25.10 −25.15 −25.86 −25.48 −31.88 TNF −20.92 −20.92 −21.13 −23.26 −32.30 IL−6 −18.99 −23.14 −21.13 −23.60 −28.66 GAPDH −22.68 −21.01 −26.28 −24.43 −33.60 TP53 −22.05 −26.36 −32.01 −27.99 −28.24 
图 6 化合物结构示意图
图 7 部分化学成分与靶点的分子对接图
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本研究通过网络药理学手段，构建制痂酊生物信息学网络，初步探究其对烧伤创面愈合的功效机理。制痂酊治疗烧伤的成分主要有槲皮素、山柰酚、汉黄芩素以及β-谷甾醇等。槲皮素能抑制TGF-β1和TGF-βRI蛋白表达，抗机体纤维化，在角膜碱烧伤后抑制瘢痕形成方面有积极的作用[19]。同时，槲皮素可以减少炎性因子（IL-1、IL-6、IL-10）的表达[20]，其抗氧化作用对烧伤后的黏膜也具有一定的保护作用[21]。山柰酚也具有优异的抗炎抗氧化作用，同时还能有效抑菌，防止外伤感染[22]。汉黄芩素有显著的抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤等多种作用[23]。β-谷甾醇在抗氧化、抗血脂、抗炎、免疫调节等方面表现出良好的药理作用，可使创面去腐生肌并快速愈合[24]。此外，β-谷甾醇可以治疗多种疾病，如高脂血症、类风湿性关节炎、免疫抑制、前列腺增生、脱发、烧伤等[25]。
PPI分析结果显示，制痂酊可能是通过AKT1、GAPDH、IL-6、TNF等关键蛋白质靶点来辅助缓解烧伤，这可能是烧伤创面愈合的重要作用靶点。蛋白激酶1（AKT1）是3种蛋白激酶之一，其在肿瘤血管成熟、细胞外基质组成和血管的生成等方面起到关键调节作用，同时可促进创面愈合过程中血管的生成和成熟[26,27]。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）具有DNA修复、调节蛋白质的表达、参与细胞凋亡的功能[28]。IL-6能够参与炎症反应，用以激活机体免疫，尤其是烧伤导致的炎症。TNF会抑制转化生长因子-β（TGF-β）诱导p38/MAPK通络激活，导致神经生长因子表达的降低，从而延缓伤口的愈合，促进皮肤细胞去腐生肌，进而缓解疼痛[29]。
通过KEGG信号通路分析可知，AGE-RAGE、PI3K-Akt、TNF等信号通路与烧烫伤创面愈合密切相关。糖基化终末产物（AGEs）积存于皮肤和创面，对创面愈合有抑制作用。制痂酊能抑制AGE-RAGE信号通路介导的炎症反应，改良创面局部微环境[30]。PI3K-AKT参与控制细胞生长和增殖，具有抑制细胞凋亡、促进血管生成有作用[31]。
综上所述，制痂酊可以通过槲皮素等核心活性成分，作用于AKT1、GAPDH、IL-6、TNF等靶点，调节AGE-RAGE、PI3K-Akt、TNF等信号通路来辅助缓解烧伤。本研究通过网络药理学及分子对接技术对制痂酊治疗烧伤进行了系统分析，发现了其潜在的作用靶点，阐明了制痂酊的活性成分、靶点和通路之间相互作用的关系，可为下一步验证制痂酊对以上预测的关键靶点及信号通路的影响提供理论依据，为明确其临床作用机制奠定基础。
Study on the mechanism of Medicoscab tincture in treating second-degree burns based on network pharmacology and molecular docking technology
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摘要:
目的 运用网络药理学和分子对接探讨制痂酊治疗Ⅱ度烧伤的作用机制。 方法 从中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、GeneCards数据库和OMIM数据库筛选制痂酊的有效成分及烧伤的相关靶点；通过Cytoscape软件绘制相关靶点图以及疾病网络；用Metascape平台进行潜在靶点进行基因功能（GO）富集分析和基因百科全书（KEGG）通路分析；用AutoDockTools进行分子对接。 结果 筛出有效成分19个，靶点交集179个。主要涉及无机物质反应、细胞对氮化合物反应以及对外来异种刺激的响应，膜筏、囊泡腔和内质网腔等生物学过程。包括AGE-RAGE，PI3K-Akt，IL-17及TNF信号通路等。核心靶点为AKT1、TNF、IL-6、GAPDH、TP53等。制痂酊活性成分与多个靶点对接，其中β-谷甾醇与AKT1、GAPDH、TP53有强烈的结合活性。 结论 制痂酊中槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、β-谷甾醇等核心活性成分可能通过作用于AKT1、GAPDH、TP53、IL-6等靶点调控AGE-RAGE、PI3K-Akt、IL-17、TNF等信号通路，辅助缓解烧伤。本研究为明确制痂酊治疗烧伤类疾病作用机制奠定理论基础。 Abstract:Objective To explore the mechanism of Medicoscab tincture in the treatment of second-degree burns based on network pharmacology and molecular docking technology. Methods The effective components of the tincture were screened by the TCMSP; the effective components of the tincture and burn related targets were screened by GeneCards and OMIM database; Cytoscape 3.7.2 software was used to draw "Chinese medicine-disease-effective components-targets" network diagram; the related gene ontology （GO） functions and pathways of the tincture were obtained through GO enrichment analysis and Kyoto encyclo-pedia of genes and geomes（KEGG）pathway analysis on the targets through Metascape platform; the pathway bubble diagram was constructed by the pathways enriched in the KEGG database, and finally verified by AutoDockTools for molecular alignment. Results 19 effective components and 179 target intersections of Medicoscab tincture were selected. GO analysis showed the intervention burns process mainly involved the reaction of inorganic substances, the reaction of cells to nitrogen compounds, and the response to xenobiotic stimuli, as well as biological processes such as membrane rafts, vesicular cavities, transcriptional regulatory factor complexes, receptor complexes, and endoplasmic reticulum cavities. KEGG analysis showed the function mainly includes AGE-RAGE signal pathway, PI3K-Akt signal pathway, IL-17 signal pathway, TNF signal pathway, etc. Analysis of cytoscape software showed the core targets were AKT1, TNF, IL-6, GAPDH, TP53, etc. Molecular docking showed that the active components of Medicoscab tincture were docking with multiple targets, among which β- sitosterol had strong binding activity with AKT1, GAPDH and TP53. Conclusion Quercetin, kaempferol, baicalein, β-sitosterol and other core active ingredients in the tincture of making scabs, which could assist in the relief of burns, regulate the signalling pathways such as AGE-RAGE, PI3K-Akt, IL-17, TNF and so on by acting on the targets of AKT1, GAPDH, TP53, IL-6 and so on. This study lays a theoretical foundation for clarifying the mechanism of action of tincture of scab making for the treatment of burn-like diseases. -
Key words:
- Medicoscab tincture /
- burn /
- network pharmacology /
- molecular docking
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花椒为芸香科植物红花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.或青花椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.的干燥成熟果皮，味辛，性温，具有温中止痛、杀虫止痒的功效，主治脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛[1]。生物碱是花椒的主要特征性成分，组成丰富、结构多样，具有抗炎、镇痛、抗菌、抗氧化、降脂和抗肿瘤等多种药理活性[2-8]。其中，不饱和脂肪酰胺类生物碱如羟基-α-山椒素（HAS）、羟基-β-山椒素（HBS）已经被证实能够调节脂质代谢，对非酒精性脂肪肝病等代谢性疾病的预防具有潜在效果[9]。然而，对花椒生物碱的制备、富集纯化工艺优化的研究较少。花椒生物碱高效提取与纯化是其后续活性评价和产品开发的基础，有利于花椒药用价值的深度开发，因此优化花椒生物碱的富集纯化工艺具有重要意义。
大孔吸附树脂法是最常用的富集纯化手段，具有选择性好、吸附能力强、富集效果好、环保绿色等优点，在中药材、中药制剂方面应用广泛[10-11]。因此，本实验以HAS、HBS的得率为指标，筛选适宜纯化花椒生物碱的大孔树脂类型，采用单因素实验和正交试验确定树脂的最佳吸附、除杂、洗脱条件，建立大孔树脂富集纯化花椒生物碱的最佳工艺。采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MSE）技术鉴定成分，以期为花椒生物碱的物质基础研究和进一步的综合开发利用提供科学依据。
1. 材料
1.1 样品
花椒药材（批号：20220705-2，购于陕西省渭南韩城市），经海军军医大学张成中副教授鉴定为芸香科花椒属红花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）的干燥果皮。
1.2 仪器与试剂
1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Acquity I-CLASSTM UPLC 超高效液相色谱系统、Xevo G2-XS 四级杆串联飞行时间质谱（美国沃特世科技有限公司）；R-100型旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；XS205DU电子分析天平（梅特勒托利多科技公司）。
HAS对照品（纯度≥98%，批号：P2834270，源叶）；HBS对照品（纯度≥98%，批号：P2832664，诗丹德）；95%乙醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技公司）；APS-17型、NKA-9型、HP-20型、AB-8型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；HPD-400型大孔吸附树脂（上海一飞生物科技有限公司）；HP-20型大孔吸附树脂（日本三菱化学株式会社）。
2. 方法
2.1 花椒中生物碱成分含量测定方法的建立
2.1.1 溶液的配制
称取50 g花椒于圆底烧瓶中，加入500 ml的50%乙醇，95℃水浴加热，回流提取1 h，共提取3次。过滤后合并滤液，45℃减压浓缩至无醇味，过滤，加水分散至250 ml，即得上样液。
取216 ml上样液，上样于直径为2.7 cm、高度为18.9 cm的三菱HP-20型大孔树脂柱，动态吸附30 min，静置1 h后，取216 ml 20%乙醇除杂24 min；540 ml 80%乙醇洗脱1 h。收集洗脱液，45℃减压浓缩并干燥，即得提取物粉末。
对照品溶液：精密称定HAS、HBS对照品适量，加50%乙醇定容，分别制成0.61 mg/ml、0.11 mg/ml的对照品溶液。
供试品溶液：精密称定适量提取物粉末，加50%乙醇定容后，0.45 μm微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。
2.1.2 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）；流速：0.3 ml/min；检测波长：270 nm；柱温：30℃；进样量：5 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%三乙胺（B）；洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~30 min，35%→50%A；30~36 min，50%→90%A，36~39 min，90%A，39~40 min，90%→10%A。
2.1.3 线性关系
取HAS对照品溶液、HBS对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ml置于5个5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，摇匀后得到系列梯度浓度的标准工作溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.2”项下色谱条件下进样。
2.1.4 精密度
取“2.1.1”项下对照品溶液2.0 ml置于5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，混匀后0.45 μm微孔滤膜过滤，连续进样6次。
2.1.5 稳定性
取“2.1.1”项下的供试品溶液，于0、1、2、4、8、24 h分别进样。
2.1.6 重复性
按照“2.1.1”项方法平行制备供试品溶液 6 份，在“2.1.2”项下色谱条件进样测定。
2.1.7 加样回收率
精密称取已知HAS、HBS含量的花椒生物碱粉末适量, 共取9份，分别准确加入HAS、HBS对照品适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，进样分析并计算加样回收率。
2.2 大孔树脂纯化富集工艺优化
2.2.1 树脂类型
95%乙醇浸泡树脂24 h，充分溶胀后湿法装柱，95%乙醇淋至洗脱液澄清透明，水洗至洗脱液无醇味，备用。取预处理后的不同类型的大孔树脂，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液并进样，计算HAS、HBS的总得率。
2.2.2 上样量
湿法装柱，取“2.1.1”项下制备的上样液450 ml，以2 BV/h上样，流出液每30 ml收集1份。按“2.1.2”项下色谱条件进样，以累计上样体积（V/ml）为横坐标（X），以HAS、HBS的总泄漏率（%）为纵坐标（Y），绘制泄漏曲线。
2.2.3 单因素实验考察上样条件
除变量外固定其他工艺条件（树脂类型、上样量与树脂体积比、除杂溶剂、除杂体积、除杂流速、洗脱溶剂、洗脱体积及洗脱流速分别为三菱HP-20型、1 g∶2.5 ml、10%乙醇，2 BV、5 BV/h、70%乙醇、5 BV及5 BV/h）不变的情况下，分别考察上样液浓度（0.1、0.2、0.4 g生药/ml）、树脂柱径高比（1∶5、1∶7、1∶9）及吸附流速（1、2、4 BV/h）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响。
2.2.4 正交试验考察除杂、洗脱条件
在单因素实验的基础上，采用L9（33）正交试验进一步分析除杂条件（除杂溶剂、体积、流速）、洗脱条件（洗脱溶剂、体积、流速）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响（表1），总结最佳工艺并进行验证。统计分析使用SPSS 26.0 软件。
表 1 除杂、洗脱条件正交试验因素水平表条件 水平 因素 A因素溶剂 B因素体积（BV） C因素流速（BV/h） 除杂 1 蒸馏水 1 2 2 10%乙醇 2 3 3 20%乙醇 3 5 洗脱 1 55%乙醇 3 2 2 70%乙醇 5 3 3 80%乙醇 8 5 2.3 花椒生物碱的化学成分分析
2.3.1 样品制备
精密称定“2.2.4”项下以最佳工艺制备的花椒生物碱粉末5.0 mg，50%甲醇定容至25 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤备用。
2.3.2 色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY HSS T3柱（2.1×100 mm, 1.7 μm）；检测波长：270 nm；流速：0.3 ml/min；柱温：30℃；进样量：3 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~24 min，35%→46%A；24~30 min，46%→90%A；30~32 min，90%A；32~33 min，90%~10%A；33~36 min，10%A。
2.3.3 质谱条件
电喷雾离子源（ESI），正离子模式扫描。离子源温度120℃，雾化气流速为800 L/h，毛细管电压为3.0 kV。锥孔电压40 V，补偿电压80 V。低能量扫描电压6 eV，高能量扫描电压30~60 eV；喷雾器压力为6.5×105 Pa，气帘气体积流量为50 L/h，扫描范围m/z为50~
1500 。亮氨酸-脑啡肽（m/z∶ 554.261 5 [M-H]−）和（m/z∶ 556.277 1[M+H]+）作为外标进行质量实时校正，体积流量设为5 μl/min。MassLynx V4.1工作站使用MSE模式采集质谱数据。
3. 结果与分析
3.1 HPLC图与方法学实验结果
3.1.1 花椒生物碱的HPLC图
供试品HPLC图如图1所示，该色谱条件下，HAS与HBS色谱峰分离度大于1.5、理论塔板数均大于
30000 、峰形稳定、无干扰，能够满足样品分析检测要求。3.1.2 线性关系考察结果
以对照品溶液的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得到HAS的回归方程Y=
3312.7 X−8.887，r=0.999；HBS的回归方程Y=33030 X+12.061，r=0.999。即HAS、HBS分别在进样浓度为24.4~488 μg/ml、4.4~88 μg/ml范围内呈良好的线性关系。3.1.3 精密度实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.94%、0.34%，仪器精密度良好，符合定量测定要求。
3.1.4 稳定性实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.20%、0.43%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。
3.1.5 重复性实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.26% 和0.26%，表明方法重复性良好。
3.1.6 加样回收率实验结果
计算得到HAS低、中、高浓度的加样回收率分别为（103.66±0.62）%、（100.22±3.10）%、（102.47±1.24）%；HBS的低、中、高浓度的加样回收率分别为（101.35±0.89）%、（98.58±2.48）%、（98.86±1.02）%。结果表明该测定方法准确性好，可用于样品中HAS、HBS的含量测定。
3.2 大孔树脂纯化富集工艺
3.2.1 树脂类型的确定
使用三菱HP-20型树脂富集花椒生物碱类成分时，HAS、HBS两成分的总含量（X）最高且结果稳定，结果见表2。因此，优选三菱HP-20型大孔吸附树脂进行后续实验。
表 2 不同类型树脂对HAS、HBS总得率的影响（n=3）树脂类型 HAS、HBS
总浓度（mg/ml）HAS、HBS
总含量（%）$ \bar{X} $±SD（%） APS-17 2.42 4.06 4.06±2.17 NKA-9 2.08 3.50 3.50±1.76 宝恩HP-20 3.68 6.19 6.19±1.09 AB-8 3.58 6.02 6.02±1.28 HPD-400 3.59 6.03 6.03±0.98 三菱HP-20 4.10 6.89 6.89±0.62 3.2.2 上样量的确定
由图2可知，当上样液体积为90 ml时，花椒生物碱开始少量泄漏；随着上样体积增加，流出液中生物碱浓度呈现上升趋势；当上样液为210 ml时，累计泄漏率为9.61%，接近上样液中HAS、HBS总浓度的10%[12]。因此确定最大上样量为210 ml，即上样生药量与树脂体积比约为1 g∶2.5 ml。
3.2.3 上样条件的确定
由图3可知，当上样液浓度为0.2 g生药/ml时，HAS和HBS的得率最高；随着浓度升高，杂质增多，与生物碱竞争吸附活性位点，得率下降；此外高浓度上样液在静置吸附过程中较容易发生絮凝和沉淀现象[13-14]。故优选上样液浓度为0.2 g生药/ml。树脂径高比为1∶7、吸附流速为4 BV/h时，HAS和HBS的总得率最高。故选用树脂径高比为1∶7的三菱HP-20型树脂柱，动态吸附流速为4 BV/h。
3.2.4 除杂、洗脱条件的确定
如表3所示，以HAS、HBS总得率为指标时，影响三菱HP-20型大孔树脂纯化花椒总生物碱的除杂因素依次为除杂溶剂（A）>除杂流速（C）>除杂体积（B）。除杂的最佳条件为20%乙醇、流速为5 BV/h。除杂体积由2 BV提升到3 BV，结果差异并不明显，为节约溶剂、提高效率，优选2 BV为除杂体积。
表 3 除杂条件L9（33）正交设计及结果编号 因素 总得率（%） 除杂溶剂（A） 除杂体积（B） 除杂流速（C） 1 1 1 1 7.87 2 1 2 2 9.09 3 1 3 3 9.31 4 2 1 2 10.33 5 2 2 3 10.42 6 2 3 1 10.67 7 3 1 3 11.82 8 3 2 1 10.73 9 3 3 2 11.66 k1 8.75 10.06 9.71 − k2 10.44 10.07 10.34 − k3 11.37 10.48 10.52 − R 2.62 0.64 0.81 − 由表4可知，洗脱因素对HAS、HBS总得率的影响次序依次为洗脱溶剂（A）>洗脱流速（C）>洗脱体积（B）；最佳组合条件为洗脱溶剂80%乙醇，洗脱体积为5 BV，洗脱流速5 BV/h。
表 4 洗脱条件L9（33）正交设计及结果编号 因素 总得率
（%）洗脱溶剂（A） 洗脱体积（B） 洗脱流速（C） 1 1 1 1 2.55 2 1 2 2 5.38 3 1 3 3 7.15 4 2 1 2 5.75 5 2 2 3 8.11 6 2 3 1 9.57 7 3 1 3 9.20 8 3 2 1 8.28 9 3 3 2 6.36 k1 5.03 5.83 6.80 − k2 7.81 7.26 5.83 − k3 7.95 7.69 8.15 − R 2.92 1.86 2.32 − 3.2.5 花椒生物碱富集纯化最佳工艺及验证
实验确立花椒生物碱制备的最佳工艺为料液比1∶10，溶剂为50%乙醇，95℃水浴加热，每次回流提取1 h，提取3次，过滤后合并滤液；45℃减压浓缩至无醇味，纱布过滤，加水分散至生药浓度相当于0.2 g/ml的上样液；按上样生药量与大孔吸附树脂的体积比1 g∶2.5 ml，上样于三菱HP-20型大孔树脂，树脂柱径高比1∶7，动态吸附流速4 BV/h，静置1 h后，2 BV、20%乙醇以5 BV/h除杂；80%乙醇洗脱，体积5 BV，流速5 BV/h。收集洗脱液，45℃减压浓缩并干燥，即得花椒生物碱提取物。
由表5可知，三次重复实验花椒生物碱得膏率相近，富集纯化后HAS、HBS总含量的RSD为0.87%，证明本方法确定的大孔树脂富集纯化花椒生物碱的工艺稳定可靠，重复性高。此外，经纯化后花椒生物碱中HAS、HBS的含量分别为4.71%、1.02%，与富集纯化前相比，花椒生物碱的含量得到明显升高。
表 5 最佳工艺验证结果编号 得膏率
（%）富集前
总含量（%）富集后
总含量（%）富集后
总含量RSD（%）1 6.88 0.82 5.73 0.87 2 6.91 0.81 5.72 0.87 3 6.95 0.82 5.64 0.87 3.3 生物碱类化合物的鉴定
通过中药系统药理学数据库与分析平台、PubChem、Web of science等数据库和国内外文献，收集花椒的化学成分信息，包括绘制化学结构、整理化合物名称与分子式、利用MasslynxV4.1计算化合物精确质量等，建立共包含95种生物碱的花椒化学成分数据库。
由图4可知，在正离子模式下，生物碱类化合物得到了较好的分离。结合质谱数据、相关文献对照品的裂解规律和紫外吸收，并与自建的花椒化学成分数据库进行对比分析，共识别鉴定或推导出20种生物碱类化合物，包括木兰花碱、茵芋碱、HAS、HBS等（见表6）。
表 6 正离子模式下花椒生物碱类成分碎片离子及鉴定结果峰号 保留时
间（t/min）化合物 分子式 离子模式 理论值
（m/z）实测值
（m/z）误差
（ppm）碎片离子
（m/z）参考
文献1 4.716 木兰花碱 C20H24NO4+ [M]+ 342.170 5 342.169 0 −4.38 342.169 0[M]+, 297.110 6[M-C2H7N]+, 282.088 2[M-C2H7N-CH3]+, 265.085 2[C17H13O3]+, 222.065 3[C15H10O2]+, 191.084 6[C15H11]+, 194.071 4[C14H10O]+, 165.069 3[C13H9]+ [17] 2 5.483 ZP-amide D C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 3 5.877 ZP-amide E C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 320.182 5[M+Na]+ [18] 4 6.043 ZP-amide A C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19] 5 6.724 ZP-amide B C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19] 6 6.793 ZP-amide C C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18, 20] 7 7.222 ZP-amide L C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 8 7.902 ZP-amide K C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 9 12.427 ZP-amide N C18H31NO4 [M+Na]+ 348.215 1 348.213 0 −6.03 349.217 7[M+H+Na]+, 348.213 0[M+Na]+ [18] 10 16.168 茵芋碱 C14H13NO4 [M+H]+ 260.092 3 260.092 3 0.00 229.037 0[M-2CH3]+, 227.056 6[C13H9NO3]+, 202.046 8[C11H8NO3]+, 199.062 5[C12H9NO2], 184.037 9[C11H6NO2]+, 156.043 4[C10H6NO]+, 77.037 7[C6H5]+ [21] 11 22.312 羟基-ε-山椒素 C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 302.171 4[M+K]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [22] 12* 22.701 羟基-α−
山椒素C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [23] 13* 23.113 羟基-β−
山椒素C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.187 5[M-OH]+ [23] 14 23.605 Zanthoamides A C18H27NO4 [M-OH]+ 304.191 3 304.191 3 0.00 345.184 4[M+H+Na]+, 344.181 6[M+Na]+ [24] 15 26.156 羟基-γ−山椒素 C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22] 16 26.379 羟基-γ−
异山椒素C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22] 17 26.786 bungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15] 18 26.957 isobungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15] 19 27.586 α−山椒素 C16H25NO [M+H]+ 248.201 4 248.201 2 −0.81 286.178 3[M+K]+ [23] 20 29.068 四氢花椒素 C18H33NO2 [M+H]+ 296.259 0 296.257 7 −4.39 318.237 8[M+Na]+, 279.137 4[M+H-OH]+ [25] *：为与对照品比对的化合物。 4. 讨论
实验前期，考察了酸提碱沉法与乙醇回流提取法，经比较发现两方法制备得到的花椒生物碱中HAS、HBS含量差别不显著。但以酸性溶液浸提生物碱时，耗时长、水溶性杂质较多，而且酸性溶液可能会使部分生物碱吸收氢离子导致质子化从而发生重排反应，破坏分子结构，综合考虑下本实验选择乙醇回流提取法。
HAS、HBS是花椒的代表性酰胺类生物碱，具有降脂、抗氧化、麻醉、神经营养等多种活性，受到研究者的广泛关注[15-16]。本实验确立的工艺能够有效富集花椒生物碱，显著提高HAS、HBS含量，为后续HAS、HBS单体化合物的制备提供了基础。实验过程中尝试通过优化除杂条件、分段收集乙醇洗脱液等方法分离黄酮与生物碱类成分，但UPLC-Q-TOF-MSE得到的BPI图中，8~11 min仍存在着部分响应较高的黄酮类物质无法完全分离，后续还需要探索其他有效的方法进一步去除黄酮类成分。
本实验在单因素实验基础上采用正交设计考察了花椒生物碱的最佳纯化工艺，利用UPLC-Q-TOF-MSE对生物碱成分进行分析鉴定，使用HPLC对制备得到的花椒生物碱中的HAS、HBS进行含量测定。本纯化工艺简单可行、稳定有效，可为花椒生物碱的综合开发利用及工业化生产提供科学依据，对提升花椒的综合经济价值具有深远意义。
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表 1 “制痂酊”潜在有效化合物
药物 分子ID 活性成分 OB（%） DL 黄柏 MOL001454 小檗碱 36.86 0.78 黄柏 MOL001458 黄连碱 30.67 0.86 黄柏 MOL002636 Kihadalactone A 34.21 0.82 黄柏 MOL013352 黄柏酮 43.29 0.77 黄柏 MOL002641 异黄柏苷 35.86 0.44 黄柏 MOL000358 β-谷甾醇 36.91 0.75 黄芩 MOL001689 刺槐素 34.97 0.24 黄芩 MOL000173 汉黄芩素 30.68 0.23 黄芩 MOL000228 （2R）-7-羟基-5-甲氧基-2-
苯基色满-4-酮55.23 0.2 黄芩 MOL002714 黄芩素 33.52 0.21 黄芩 MOL002908 5,8,2'-三羟基-7-甲氧基黄酮 37.01 0.27 儿茶 MOL002914 黄烷酮 41.35 0.24 儿茶 MOL000422 山柰酚 41.88 0.24 儿茶 MOL000492 （+）-儿茶素 54.83 0.24 儿茶 MOL000073 表儿茶素 48.96 0.24 儿茶 MOL000098 槲皮素 46.43 0.28 冰片 MOL006861 积雪草酸 41.38 0.71 冰片 MOL006862 乙酸龙脑酯 59.3 0.51 冰片 MOL006865 龙脑香醇酮 41.71 0.76 
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表 2 核心靶点及其拓扑参数
序号 核心靶点 度值 介数中心性 接近中心性 1 AKT1 123 1862.290054 0.004366812 2 GAPDH 116 946.1875691 0.004149378 3 TP53 116 840.5996422 0.004132231 4 IL-6 115 1497.996279 0.004219409 5 TNF 114 1024.117839 0.004166667 6 VEGFA 110 658.4220238 0.004032258 7 CASP3 103 644.9615495 0.003968254 8 IL-1B 101 693.7919839 0.003984064 9 MYC 100 764.1003404 0.003891051 10 PTGS2 99 633.2163159 0.00390625 11 EGFR 99 614.1334934 0.003875969 12 ESR1 99 863.6549212 0.003937008 13 HIF1A 95 434.0180719 0.003787879 14 MMP9 94 600.3164537 0.003787879 15 EGF 93 394.6177813 0.003773585 16 FOS 90 1323.795938 0.003816794 17 PTEN 90 499.5157302 0.003787879 18 CCND1 89 327.1005061 0.003703704 19 PPARG 86 440.0419589 0.003676471 20 FN1 83 283.1020522 0.003676471
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表 3 制痂酊关键化合物-核心靶点分子对接（单位：kJ/mol）
核心靶点 槲皮素 山柰酚 汉黄芩素 黄芩素 β−谷甾醇 AKT1 −25.10 −25.15 −25.86 −25.48 −31.88 TNF −20.92 −20.92 −21.13 −23.26 −32.30 IL−6 −18.99 −23.14 −21.13 −23.60 −28.66 GAPDH −22.68 −21.01 −26.28 −24.43 −33.60 TP53 −22.05 −26.36 −32.01 −27.99 −28.24
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