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心衰（HF）是一种复杂的临床综合征，因心脏结构或功能性疾病导致心室充盈或射血功能降低，并伴有全身健康受损和高病死率。全球有超过3 770万HF患者，近50%的HF患者在确诊5年内死亡，病死率超过了多种癌症。据美国心脏病协会（AHA）最新发布的数据显示，预计到2030年，HF发病率将进一步增加到46%[1]。
长期以来，天然中草药一直用于治疗HF且效果显著。天然药物及其活性化合物的多通路、多靶点的优势可避免当前西药疗法靶点单一引起的多种代偿性不良反应，以及药物代谢导致的药理作用减弱等问题[2]，特别是副作用也明显减少。中药治疗的副作用为4.08%，西药治疗的副作用为9.81%[3]。然而，由于中药成分复杂多样，其临床作用机制、药动学和治疗靶点尚未得到充分研究，且目前探索天然药物单一生物活性成分来治疗心血管疾病并验证其药理作用和治疗靶点也是一大研究热点。因此，本文对数据挖掘的前5名抗HF天然药物及其活性成分进行综述，旨在为进一步研究开发抗HF天然药物提供参考依据。
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为选出临床常用中药，我们对国家专利数据库中治疗HF的中药复方专利进行挖掘分析。登录国家知识产权局中国专利公布公告网站（中国专利公布公告 cnipa.gov.cn），在“中国专利公布公告”的“高级查询”界面勾选“发明公布”与“发明授权”，分别将“心力衰竭和中药”作为“名称”项目进行检索，检索时间为2023年2月。本研究纳入的116项中药复方专利中，中药复方组成的药物最多有50味中药，最少有2味中药，共有418味中药。运用频次统计分析发现，出现频次最高的药物是黄芪（55次）。频次≥10的中药见表1。
表 1 中国专利数据库中治疗HF的高频次中药
药名 频次 药名 频次 药名 频次 黄芪 55 白术 21 三七 12 丹参 40 当归 21 干姜 11 茯苓 40 麦冬 21 鸡血藤 11 附子 38 甘草 20 桃仁 11 人参 31 泽泻 19 猪苓 11 葶苈子 28 红参 16 红花 10 桂枝 28 党参 15 肉桂 10 川芎 23 五味子 15 益母草 10 -
黄芪作为常用中药,记载具有滋补、保肝、利尿和祛痰的特性。截至2023年，已从黄芪中分离鉴定出100多种化合物，包括皂苷、黄酮、多糖和氨基酸等[4, 5]，其中的皂苷、黄酮和多糖被认为是黄芪的主要生物活性成分。目前市场中流行的含黄芪类药物主要有黄芪生脉颗粒、益心通脉颗粒、脑心通脉胶囊等，黄芪注射液在临床上已被用于治疗病毒性心肌炎和心功能不全。现代药理学研究表明，黄芪具有改善心脏功能、促进血管生成[6]、降血糖、抗炎、调节免疫活性[7]等药理作用。
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心肌缺血再灌注损伤（MI/R）是心肌损伤（尤其是心肌梗死）中常见的病理生理学特征，在缺氧心脏组织中发生细胞损伤，并在恢复供氧后加重[8]。预给药黄芪甲苷（AS-Ⅳ）可显著降低MI/R大鼠模型中心肌梗死大小、肌酸激酶-MB（CK-MB）产生、血清心肌肌钙蛋白（cTnI）水平和心肌细胞凋亡。该机制涉及钙敏感受体（CaSR）表达的下调和ERK1/2磷酸化的上调[9]。血管生成涉及到细胞外基质重塑、内皮细胞增殖、迁移和组装成毛细血管结构的过程[10]。研究发现，在结扎左冠状动脉以诱导HF大鼠模型中，AS-Ⅳ显著增加了缺血性心脏中的血管密度、CD31和血管内皮生长因子（VEGF）表达，表明AS-Ⅳ可以通过促进血管生成来缓解HF，这可能是通过JAK-STAT信号通路发挥心脏保护作用的[11]。NF-κB是多种炎性细胞因子的常见转录因子，有研究报道，AS-Ⅳ对炎症有很强的拮抗作用。在脂多糖（LPS）诱导的HF小鼠中，AS-Ⅳ可使NF-кB信号传导失活并激活PI3K/AKT通路，导致血清炎症介质TNF-α、单核细胞化学引诱蛋白-1（MCP-1）、IL-6、IL-1β等显著降低，最终改善心脏功能[12]。
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环黄芪醇（CAG）是AS-Ⅳ经历肠道细菌生物转化后的主要代谢物，并且比AS-Ⅳ更容易吸收以达到体循环[13]。研究表明，其具有抗炎、抗菌和抑制纤维化的作用[14, 15]。心脏纤维化是许多心血管疾病的共同特征，NLRP3炎症小体信号传导及其下游细胞因子反应在心脏纤维化中起重要作用[16]。有研究表明，在异丙肾上腺素（ISO）诱导的HF中，CAG通过抑制NLRP3炎症小体表达，降低NLRP3、IL-1和IL-18的分泌，有效改善心脏纤维化[12]，从而发挥对心脏的保护作用。同时，在ISO诱导的大鼠HF模型中，环黄芪醇可通过下调AKT1-RPS6KB1信号通路，增强心肌细胞自噬，抑制基质金属蛋白酶（MMPs）表达，改善心脏重塑[17]。以上研究表明，环黄芪醇可能成为充血性心力衰竭患者的候选药物。
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毛蕊异黄酮（Calycosin）是黄芪中黄酮类化合物成分之一。研究证实，毛蕊异黄酮具有多种生物学效应，如抗氧化、抗凋亡、抗炎、促血管生成等[18]。毛蕊异黄酮能通过多种机制对不同原因造成的心肌细胞损伤发挥抗损伤作用。例如，毛蕊异黄酮及其衍生物可以显著降低丙二醛的水平，同时增加超氧化物歧化酶的水平，以保护心肌细胞免受氧化应激。在另一项研究中，首次证明毛蕊异黄酮通过调节自噬和抗NLRP3介导的焦亡抑制多柔比星诱导的心脏毒性来保护小鼠心肌细胞，从而减轻斑马鱼模型中阿霉素诱导的心脏毒性[19]。最近的研究表明，毛蕊异黄酮可以有效减轻异丙肾上腺素诱导的小鼠和大鼠心功能障碍，并通过抑制转化生长因子-β受体信号通路（TGFBR1）抑制TGF-β1诱导的心脏成纤维（CFs）增殖和胶原蛋白沉积, 减轻小鼠体内MI后的心肌纤维化和心功能障碍[20]。虽然目前针对毛蕊异黄酮对心血管的作用研究较多，但其作用机制还需要进一步系统研究。
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茯苓最早记载于中国古代医学杰作《神农本草经》中[21]，具有渗湿利水,益脾和胃,宁心安神的功效。在临床中，茯苓四逆汤、真武汤、桂枝茯苓丸常用于治疗慢性HF。茯苓的化学成分主要为萜类、甾醇类、多糖类以及其他类化合物，其中研究最多的是三萜和多糖类化合物[22]。现代药理学研究表明，茯苓可有效提高心肌收缩力，具有利尿、抗氧化、抗炎等多种功效[23]。
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茯苓多糖（PCP）占干菌核重量的70%～90%，具有抗炎、降血脂、抗肿瘤、抗衰老和抗氧化特性[21]。活性氧（ROS）在细胞稳态中起着关键作用。在心脏中，过量的ROS可导致适应不良心肌重塑和心力衰竭的发生[24]。研究表明，在补充茯苓多糖7周后，小鼠的血清抗氧化酶（SOD、CAT、GPx）活性差异有统计学意义，显示茯苓多糖可显著增强血清抗氧化酶活性[25]，从而发挥对心脏的保护作用。同时，用茯苓多糖处理小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，可发现细胞中的NO释放和细胞因子分泌增加，提示茯苓多糖可通过诱导iNOS基因表达刺激巨噬细胞产生NO发挥血管扩张和抗炎作用[26]，其机制与NF-κB/Rel通路有关。在与其他药物合用时，可发挥对HF的防治作用。
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茯苓酸（PA）是一种羊毛甾烷型三萜类化合物，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等多种药理作用[27]。炎症是心血管疾病的病理基础，已有学者证明，茯苓酸可降低LPS诱导的炎症反应，减少LPS刺激下H9C2细胞中IL-1、IL-6和TNF-α等炎症因子的表达，并通过H9C2细胞中的ERK1/2和p38途径抑制LPS诱导的心肌细胞炎症和细胞凋亡，从而发挥心脏的保护作用[28]。血脂异常会导致多种心血管疾病，研究表明，茯苓酸可诱导葡萄糖转运蛋白4型（GLUT4）表达，通过上调胰岛素非依赖性AMPK和胰岛素受体底物-1-PI3K-AKT途径，刺激GLUT4从细胞内囊泡重新分布到质膜，并诱导甘油三酯积累[29]，从而发挥对血脂的正向调节作用。
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附子在分类学上属于毛茛科乌头属，《中华人民共国药典》2020年版（以下简称《中国药典》）收载的乌头类药材有川乌、制川乌、附子、草乌、制草乌、草乌叶等。目前上市的含附子类药物主要有参附注射液、芪苈强心胶囊等。其主要生物活性成分为总生物碱和多糖，但因多糖结构复杂、难以纯化，目前仅对粗多糖有相关药理研究。现代药理学研究表明，附子具有抑制心肌纤维化、细胞凋亡和自噬、改善线粒体能量代谢等功能，涉及RAAS系统、PI3K/AKT、JAK/STAT、AMPK/mTOR等多条信号通路[30]。此外，乌头碱是附子的主要生物活性部分，具有治疗和毒性双重作用。
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附子多糖（FPS）是一种水溶性多糖，具有抗氧化、抑制细胞凋亡和增强自噬活性的作用。在一项早期研究中，发现FPS不仅可以通过其抗氧化作用减少肝缺血再灌注损伤，而且在心肌细胞中也显示出相同的保护作用[31]。在体外心肌缺血再灌注损伤细胞模型中，FPS通过增强锰超氧化物歧化酶（Mn SOD）活性和基因表达来抑制细胞凋亡，促进抗凋亡基因Bcl-2的表达，并清除线粒体产生的过量氧自由基[32]。深入研究表明，FPS的抗氧化自由基生成作用可以拮抗钙过载，降低细胞内钙离子浓度，减少心肌细胞凋亡[31]。在其抗凋亡机制的研究中，发现FPS可以诱导信号转导器和转录因子-3（STAT3）激活剂的磷酸化，STAT3是JAK-STAT通路的底物，可以促进Bcl-2表达，发挥心脏保护作用[33]。尽管FPS具有心脏保护作用，但有研究结果显示，FPS和附子提取物的总生物碱相比，FPS的治疗效果最弱，这表明生物碱成分在心脏保护作用中更为重要[34]。但这并不意味着FPS没有研究价值，与具有毒性作用的生物碱相比，FPS没有明显的心脏和胚胎毒性，优于其他成分，更具有研发价值。
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乌头碱是乌头属植物的主要毒性成分，也是一种重要的活性物质，具有强心作用，可用于治疗充血性心力衰竭、心源性休克等心血管疾病。在服用高浓度乌头碱类药物时，会导致严重的心脏和中枢系统的不良反应，其中，室性快速心律失常和心脏骤停是主要致死原因[35]。但是，在大鼠静脉注射极低剂量（0.01 mg/kg）的乌头碱时，可通过增加LVSP、MBP和LVEDP显著改善心功能[36]。一些学者认为，乌头碱可能与强心苷类似，是通过延长动作电位中Na+内流而引起正性肌力作用。HF患者口服乌头碱后，被血液吸收较少，与心肌细胞膜的亲和力较低，在心脏组织中的剂量远小于治疗窗口[37]。而乌头碱的强心作用也仅在相对较低的水平上被观察到，可能正是由于这一原因，高浓度乌头碱诱发的心律失常掩盖了低浓度的正性肌力作用。虽然乌头碱具有很强的毒性，但低剂量的乌头碱也常在医疗紧急情况下被用作强心药物，这些发现提示了虽然乌头碱存在毒性，但在强心和治疗心律失常方面依然具有很高的利用价值。
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去甲乌药碱是提取于附子的增强心脏功能的水溶性生物碱中主要生物活性成分，其强心作用主要表现为抗心脏肥大、抗纤维化、改善血流动力学和减少细胞凋亡。早期研究发现，在大鼠经历缺血再灌注损伤之前给予去甲乌药碱显著降低了细胞色素C的释放和半胱天冬酶-3（caspase-3）活性和Bax表达，并上调了Bcl-2表达。进一步的深入研究表明，去甲乌药碱通过激活β2-肾上腺素能受体（β2-AR）来拮抗大鼠心肌细胞的细胞凋亡并防止缺血/再灌注诱导的心肌梗死，并发现β2-AR/PI3K/AKT级联的激活是其抗凋亡作用的关键途径[38]。线粒体功能异常和细胞代谢紊乱影响心肌收缩功能障碍和左心室重塑[39]。LKB1/AMPK/Sirt1是阿霉素诱导的心肌损伤的重要靶标。据报道，去甲乌药碱和6-姜辣素的组合可促进LKB1、AMPKα1和Sirt1的mRNA和蛋白质的表达，从而减轻心肌线粒体能量代谢的紊乱[40]。这提示去甲乌药碱作为一种低毒的化学成分可以进一步对其开发利用。
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丹参为唇形科的丹参属，根据中医理论，丹参味苦、性微寒，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效。目前，含丹参制剂已广泛应用于临床治疗。如复方丹参片用于治疗心绞痛引起的胸痛，冠心丹参胶囊、复方丹参滴丸对气滞血瘀型胸痹证有较好疗效。丹参的化学成分主要可分为二萜类和酚酸类两大类。现代药理学研究表明，丹参具有改善微循环、舒张冠状动脉血管、抑制血栓素形成、抑制血小板黏附和聚集、防止心肌缺血等作用[41]。
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丹参酮Ⅱa是在心血管领域中研究最充分的生物活性成分之一，可以通过多种机制控制心血管疾病的发展，包括抗炎、抗氧化应激、抗细胞凋亡、抗血管生成[42]等。研究表明，丹参酮Ⅱa通过抑制ERK的活化来抑制血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖和迁移，同时激活BKCa、AMPK和Nrf2途径来减少斑块形成，降低心梗发病概率[43]。心肌的缺血/再灌注（I/R）时触发ROS的突然增加，丹参酮Ⅱa抑制NF-κB的活化，最终减弱炎症介质MCP1、TGF-β1和TNFα的表达，并阻止巨噬细胞浸润到梗死的心肌中[44]。此外，丹参酮Ⅱa可减弱NOD样受体（NLR）家族的形成，该家族含有NOD样受体热蛋白结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体的pyrin结构域，该结构已被确定为MI炎症反应的介质[45]，并随后预防下游炎症级联和脂质代谢紊乱。
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隐丹参酮已被报道在体外和体内各种神经退行性疾病模型中均有神经保护作用，近来，在心血管疾病中的作用也得到了较高的认可。有研究表明，在主动脉结扎诱导的急性心肌梗死实验模型中，隐丹参酮剂量依赖性地改善了心肌组织排列紊乱和炎症细胞积聚[46]。在闭塞冠状动脉左前降支所致大鼠心肌I/R损伤模型中，隐丹参酮预处理可以抑制TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中黏附分子的表达，显著缩小梗死面积，改善心肌收缩功能障碍[47]。最近的一项研究表明，隐丹参酮通过促进线粒体生物发生和ATP生成以及抑制自由基的产生来改善心肌细胞线粒体功能[48]，同时有学者研究了隐丹参酮抗心肌纤维化的作用。其机制主要与抑制MMP-2产生和NADPH氧化依赖的ROS产生有关[49]。这些观察可以部分解释隐丹参酮对心肌梗死和心肌I/R损伤的保护作用，但其治疗心脏病的机制还有待进一步阐明。
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丹酚酸B为丹参提取物中主要的亲水成分，目前已有丹参多酚酸盐应用于临床。其可对心肌缺血损伤和病理性心脏重塑产生保护作用,主要包括减少相关炎症因子的表达，抑制细胞凋亡和减轻氧化应激。据报道，丹酚酸B通过缓解氧化应激、减少钙过载、改善内皮功能、稳定线粒体膜电位和上调 microRNA-30a发挥对心肌I/R损伤的保护作用[50]。同时，丹酚酸B参与PI3K/Akt信号通路的激活并抑制HMGB1表达，从而改善心功能不全，减少心肌酶释放，减小梗死面积[51]。细胞间黏附减少会增加内皮通透性，一项研究表明，在TNF-α减弱细胞连接蛋白（如VE-cadherin 和 β-catenin）的酪氨酸磷酸化时，丹酚酸B可减少TNF-α介导的内皮细胞连接紊乱[52]。以上研究表明，丹酚酸B在心脏保护方面具有极大潜力。
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人参是五加科植物人参属的干燥根及根茎，应用历史悠久，具有回阳救逆、益气生津、补肾养血、安神明目之功效。在衰老、癌症、心血管系统疾病、糖尿病、免疫缺陷等方面都有广泛应用。其中含有的化学成分主要包括人参皂苷、多糖、多肽、糖缀合化合物和其他化合物等，在心血管疾病中发挥重要作用 [53]。
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人参皂苷Rb1是从人参的根部提取的活性成分之一，具有广泛的心脏保护作用，其在减少心肌梗死面积、缓解心肌细胞水肿和抑制心脏毒性方面具有明显效果。人参皂苷Rb1对I/R诱导的心肌细胞损伤导致的细胞凋亡、氧化应激、炎症和能量代谢均有调节作用。采用小鼠HF模型对Rb1的心脏保护作用进行评价，结果显示，人参皂苷Rb1处理可显著降低乳酸脱氢酶（LDH）和CK水平，显著减少心脏梗死面积，这与激活Akt，磷酸化GSK-3β和抑制mPTP开放有关[54]。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信号通路相关蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡、葡萄糖转运和其他细胞功能的调节。人参皂苷Rb1可以通过增加磷酸化蛋白激酶B（Akt）的表达来激活PI3Ks信号通路，以减少细胞凋亡[55]。先前的一项研究表明，人参皂苷Rb1可以下调细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的比例，以及裂解的caspase-3的表达。从而减少I/R引起的细胞凋亡，降低小鼠心肌损伤[54]。上述研究表明，人参皂苷Rb1在预防和治疗心肌I/R中的作用主要涉及通过增加PI3K/Akt信号传导和减少caspase家族等细胞凋亡相关因子来减少细胞凋亡，是一种潜在的能改善心肌微环境，发挥心肌保护作用的天然活性化合物。
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人参多糖是人参的主要成分之一，由人参淀粉和人参果胶两部分组成，药理活性部分主要是人参果胶[56]，具有提高免疫力、抗肿瘤和降血糖[57-59]等药理作用，能有效减轻心室重构，对心肌的基本结构进行保护。已有实验证明，利用结扎大鼠腹主动脉ACC制备心肌肥厚模型，给予人参多糖可有效减轻AAC所致的心肌肥厚，显著降低模型组大鼠LAC和FFA生成量，改善心肌肥厚所致的MMP改变，减少线粒体能量代谢紊乱。人参多糖可能通过改善心肌能量FFA和LAC代谢和提高线粒体的活力抑制AAC所致的心肌肥厚。目前，人参多糖多关注于抗癌、肠道菌群和高血压等疾病，在心血管领域研究较少，亟待科研工作者的进一步研究。
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天然药物是新药研究的源泉，全球天然药物市场处于蓬勃发展阶段，拥有巨大增长潜力。本文主要总结了从国家专利数据库中挖掘出的前5名抗HF天然药物及其活性成分，介绍了其功效、活性成分、药理作用等。相比于西药治疗效果单一、不良反应大、价格昂贵等缺点，天然药物具有治疗途径多样、不良反应小、价格便宜的优势。通过针对开发基于天然药物的新型抗HF药物，有望从根本上减少HF的发病率和病死率，提高HF患者的生活质量。但是基于天然产物研发的抗HF药物用于临床仍然面临很多挑战，例如，药物活性成分的筛选和分离困难，治疗HF时相关作用机制不明确，临床研究样本少等问题。综上，天然药物应用于HF的相关研究仍需加大力度，争取开发出更多的抗HF天然药物，以满足日益增长的HF患者的需求。
Research progress on natural medicines and active compounds in the treatment of heart failure
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摘要: 心衰是各种心血管疾病的终末阶段，也是导致患者死亡的主要原因。长期以来，天然药物一直用于治疗心衰，且效果显著。对国家专利数据库中的中药复方专利数据进行数据挖掘，选出临床治疗心衰的常见中药，并对其含有的经典单一活性成分进行分析，为开发治疗心衰的天然药物提供理论依据。Abstract: Heart failure is the terminal stage of various cardiovascular diseases and a leading cause of death. For a long time, natural medicines have been used to treat heart failure（HF） with remarkable effects. In this paper, the Traditional Chinese Medicine compound patents in the national patent database were mined, common Traditional Chinese Medicines for the clinical treatment of HF were selected, and the single active ingredient contained in them was analyzed, which provided some valuable tips for the development of drugs for the treatment of heart failure.
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Key words:
- heart failure /
- natural medicine /
- monomer compounds /
- pharmacological action
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高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品与试剂
姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
2. 方法与结果
2.1 姜黄素纳米乳的制备
姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立
2.2.1 色谱质谱条件[8]
色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
2.2.2 方法学考察
取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究
2.3.1 给药方案
18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
2.3.2 药动学参数计算
药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 2.4 药效学研究
2.4.1 动物分组、造模及给药
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
2.4.2 统计学处理
实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。2.4.3 肝脏指数
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片
取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平
第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
3. 讨论
姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
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表 1 中国专利数据库中治疗HF的高频次中药
药名 频次 药名 频次 药名 频次 黄芪 55 白术 21 三七 12 丹参 40 当归 21 干姜 11 茯苓 40 麦冬 21 鸡血藤 11 附子 38 甘草 20 桃仁 11 人参 31 泽泻 19 猪苓 11 葶苈子 28 红参 16 红花 10 桂枝 28 党参 15 肉桂 10 川芎 23 五味子 15 益母草 10 
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