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鸡骨草(Abri Herba)来源于豆科相思子属植物广州相思子(Abrus cantoniensis Hance),野生资源主要集中分布于岭南地区以及中南半岛等地,《中华人民共和国药典》(2020年版)[1]及部分地方中药材标准[2]、中药饮片炮制规范[3]等均有收录,药用具有利湿退黄、清热解毒、疏肝止痛之功,常用于湿热黄疸、胁肋不舒、胃脘胀痛、乳痈肿痛、急慢性肝炎、胆囊炎等。鸡骨草含有多种活性物质,包括皂苷类[4]、黄酮类、生物碱类[5]、多糖[6]、氨基酸[7]、挥发油及脂肪酸[8]等,如相思子皂苷Ⅰ、大豆皂苷、槐花皂苷、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、相思子碱、刺桐碱等。文献研究发现,鸡骨草具有促进伤口愈合[9]、抗菌[10]、抗病毒[11]、抗氧化[12]、抗肿瘤、免疫调节[13]、抗肝炎病毒[14]、降脂保肝[15-16]等作用,民间也常用鸡骨草制作药膳、凉茶,具有较高的食用价值。目前鸡骨草法定质量标准主要对鸡骨草性状、显微、薄层色谱法(TLC)鉴别相思子碱等项做了初步的质量控制,相思子碱能够较好地反应鸡骨草正品的特性,但是相思子碱在相思子属其他植物中亦有发现,专属性不强,目前市场上常见有相思子属毛相思子(Abrus mollis Hance)与其混淆应用。通过网络药理学[17]及分子对接技术[18]寻找适合鸡骨草质量控制的质量标志物(Q-marker)[19-20],建立符合鸡骨草药用活性特征的质量标准,能够更好地鉴定鸡骨草的质量及药用食用价值。
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赛默飞Vanquish Core型液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司);岛津LC-20A型液相色谱仪(日本岛津株式会社);SK7200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);RH-600A高速多功能粉碎机(浙江荣洁工资有限公司);XS105DU电子天平(梅特勒-托利多公司);鼓风式干燥箱(上海般诺生物科技有限公司);色谱柱:Thermo AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,120Å,赛默飞世尔科技有限公司)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,安捷伦科技公司)、Diamonsil® C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,北京迪马科技有限公司)。
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鸡骨草(经海军军医大学药学系黄宝康教授鉴定为豆科植物广州相思子Abrus cantoniensis Hance的干燥全草),药材市场采购或产地采集,根据采集地不同分别设置批号为JGC-xx(采集序号)-xxx(样品序号),共13个批次;相思子碱对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111808-202003)、刺桐碱对照品(中国食品药品检定研究院,批号:112058-202001)、夏佛塔苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111912-202204,纯度:94.9%)、异夏佛塔苷对照品(四川维克奇生物科技有限公司,纯度:98%);乙腈、甲醇(色谱纯,Merck公司);甲酸(分析级,国药集团);蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。
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检索中药网络药理学常用数据库与分析平台TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)、ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)等,结合鸡骨草主要活性化合物文献检索,根据OB值、OD值以及类药5原则等,获取鸡骨草中活性明确且具有成药性的化合物,再通过 Pubchem查询相关化合物Canonical SMILES 编号,输入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)获取化合物所对应的靶标蛋白的Uniprot ID。共选取Soyasaponin Bb、Kaikasaponin Ⅲ、Abrisapogenol A、Abrisapogenol D、Sophoradiol、Kudzusapogenol A、 Abrisaponin I、Abrine、Hypaphorine、Schaftoside、Isoschaftoside、butin等12种不同结构的化合物,筛选其药理活性作用靶点,筛去重复靶标,最终获得237个靶标,通过Cytoscape3.8.2软件构建“鸡骨草-成分-潜在靶点”可视化网络图(图1)。网络中包括250个节点和440条边,平均节点度值3.520。
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将“2.1.1”项下筛选所得靶标导入STRING 11.0 在线数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)进行PPI 网络分析。选择物种为“Homo sapiens”,蛋白交互参数评分值为“high confidence>0.9”,隐藏网络中无联系的节点,其余参数设置不变,获得化合物靶点PPI网络图(图2)。结果共获得237个节点,360条边,平均节点度为3.04,预期边数135,PPI富集P值<1.0e-16。再将PPI结果以TSV文本格式导入Cytoscape 3.8.2软件中,进行拓扑属性分析,选取亲密度、间隔度、自由度3个重要参数,共计筛选21个网络参数大于均值(0.322、9.662、5.180)的核心靶标(图3)。包括信号传导与转录激活因子3(STAT3)、基质金属蛋白酶2、9(MMP2、9)、蛋白激酶(AKT1)、表面活性蛋白C(SRC)、淋巴细胞特异蛋白酪氨酸激酶(LCK)、雌激素受体alpha(ESRα)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARγ)、一氧化氮合酶2(NOS2)、缺氧诱导因子-1alpha(HIF1A)、生长因子受体结合蛋白2(GRB2)、双微体2蛋白(MDM2)、糖原合酶激酶3Β(GSK3B)、酪氨酸蛋白激酶受体B2(EPHB2)、α-突触核蛋白(SNCA)等靶标。
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应用metascape 数据库(https://metascape.org/gp/index.html)对21个主要潜在的靶点进行基因本体(GO)功能和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。其中,靶点经生物过程(BP)相关条目463 条,主要涉及细胞凋亡正调控(positive regulation of cell death)、蛋白质水解调控(regulation of proteolysis)、细胞对有机氮化合物的反应(cellular response to organonitrogen compound)、TGF-β响应(response to transforming growth factor-beta)等;细胞组分(CC)有34个条目,主要涉及复合物转录调节(transcription regulator complex)、谷氨酸突触(glutamatergic synapse)、细胞质核周区(perinuclear region of cytoplasm)等;分子功能(MF)有42个条目,主要涉及DNA-结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、转录因子结合(transcription factor binding)、蛋白质结构域特异性结合(protein domain specific binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、分子适配器活性(molecular adaptor activity)等,各选取显著性前10 条目展示(图4)。KEGG通路富集分析得到79个通路条目,选取显著性前20的条目通过桑基图呈现(图5)。Y轴为信号通路,X轴为该通路靶向基因占总基因的比率,气泡颜色表示该通路基因富集的显著性,气泡大小表示该通路的基因数量。其中AKT1、STAT3、HIF1A、GRB2、MMP9等主要靶点蛋白与松弛素信号通路(relaxin signaling pathway)、甲状腺激素信号通路(thyroid hormone signaling pathway)、B细胞受体信号通路(B cell receptor signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、ErbB信号途径(ErbB signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、JAK-STAT 信号通路(JAK-STAT signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)等具有较强的关联性。
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通过PubChem获取相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等化合物3D结构,根据自由度选取“成分-靶点-通路”网络中靠前的靶标,检索PDB数据库(http://www.rcsb.org/)获得靶标蛋白结构,再将蛋白与化合物结构文件导入 pymol 软件进行去水、加氢、删除重复链等预处理,模拟化合物与靶标作用模式,计算结合能,结合能小于0表明可以自由结合,结果如表1、图6所示。
表 1 成分-靶标分子对接结果
靶标 PDB ID 活性成分 结合能(kcal/mol) AKT1 4GAH 相思子碱 −4.67 刺桐碱 −4.34 夏佛塔苷 −2.98 STAT3 5AX3 相思子碱 −4.72 刺桐碱 −4.56 夏佛塔苷 −2.82 HIF1A 3OUI 相思子碱 −4.02 刺桐碱 −3.93 夏佛塔苷 −2.36 大豆皂苷Bb −0.27 GRB2 3IMD 相思子碱 −5.0 刺桐碱 −5.66 夏佛塔苷 −4.68 大豆皂苷Bb −2.46 MMP2 8H78 相思子碱 −7.21 刺桐碱 −7.02 夏佛塔苷 −5.83 大豆皂苷Bb −4.28 -
成分分析采用C18色谱柱(Thermo、Agilent、Diamonsil);流动相采用梯度洗脱,A相为乙腈,B相为0.2%甲酸溶液,梯度洗脱程序:0~10 min(5%~10%B);10~20 min(10%~12%B);20~30 min(12%~13%B);30~35 min(13%~14%B);35~40 min(14%~16%B);40~55 min(16%~18%B);55~60 min(18%~20%B);60~65 min(20%~22%B);65~70 min(22%~30%B);70~75 min(30%~40%B);75~80 min(40%~60%B);80~85 min(60%~75%B);85~95 min(75%~75%B)。柱温设置为25℃、30℃、35℃。流速:0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min。检测波长278 nm。进样量:10 μl。
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①对照品储备液的制备:精密称取相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品5~10 mg,分别置10 ml容量瓶中,加甲醇定容,摇匀,制备对照品储备液。②供试品溶液的制备:精密称取样品粉末1 g置锥形瓶中,加甲醇50 ml,称定重量,加热回流提取2 h,取出,称定,补足损失的量,滤过,回收溶剂,残渣加甲醇5 ml使溶解,微孔滤膜过滤,制得供试品溶液。
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精密量取混合对照品溶液10 μl注入液相色谱仪,测定对照品保留时间及峰面积,平行测定5次,计算相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷保留时间及峰面积RSD,保留时间RSD分别为0.6%、0.7%、0.4%、0.3%,峰面积RSD均为0.3%(图7、表2)。
表 2 对照品色谱峰相对保留时间
峰 名称 保留时间
(t/min)相对保留
时间精密度
RSD(%)峰1 相思子碱 18.058 1.00 0.6 峰2 刺桐碱 21.658 1.20 0.7 峰3 夏佛塔苷 42.865 2.37 0.4 峰4 异夏佛塔苷 47.433 2.63 0.3 -
取供试品JGC01-010按照2.3.2项下供试品溶液制备法制备供试品溶液,分别在0、2、4、12、24 h测定相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品保留时间,计算RSD,分别为0.09%、0.10%、0.05%、0.05%(表3)。
表 3 稳定性实验色谱峰保留时间(t/min)
时间(t/h) 相思子碱 刺桐碱 夏佛塔苷 异夏佛塔苷 0 16.892 20.783 42.283 46.967 2 16.892 20.783 42.283 46.967 4 16.900 20.808 42.308 47.000 8 16.867 20.758 42.258 46.950 12 16.858 20.742 42.242 46.942 24 16.875 20.775 42.300 47.000 RSD(%) 0.09 0.10 0.05 0.05 -
测定13批样品,记录样品中相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷等色谱峰的保留时间及峰面积,并计算其相对保留时间及偏差(表4 )。根据出峰时间及样品化合物峰型特征分析,部分供试品中异夏佛塔苷未检测到或含量较低超出仪器检出范围,不具有共有峰特征。因此选择相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等3种化合物的色谱峰作为特征峰,相对保留时间为1.00、1.21、2.39,可控制偏差范围±5%。参考《中华人民共和国药典》(2020年版)通则指导原则的有关规定,拟定供试品色谱中应呈现相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷3种化合物的特征峰,并应与对照品色谱峰保留时间相对应(图8)。
表 4 样品特征峰相对保留时间(n=13)
样品 相思子碱峰 刺桐碱峰 夏佛塔苷峰 异夏佛塔苷峰 保留时间
(t/min)相对保
留时间保留时间
(t/min)相对保
留时间保留时间
(t/min)相对保
留时间保留时间
(t/min)相对保
留时间对照品 18.058 1.00 21.658 1.20 42.865 2.37 47.433 2.63 JGC-01-001 17.717 1.00 21.175 1.20 42.400 2.39 46.767 2.64 JGC-01-002 17.733 1.00 21.183 1.19 42.200 2.38 46.917 2.65 JGC-01-003 18.025 1.00 21.658 1.20 42.900 2.38 − − JGC-01-004 18.033 1.00 21.683 1.20 43.950 2.44 47.483 2.63 JGC-01-006 18.183 1.00 21.408 1.18 42.700 2.35 47.542 2.61 JGC-01-007 17.967 1.00 21.675 1.21 42.933 2.39 − − JGC-01-010 16.881 1.00 20.775 1.22 42.279 2.49 47.000 2.78 JGC-03-004 17.650 1.00 21.225 1.20 42.475 2.41 − − JGC-03-012 17.833 1.00 21.350 1.20 42.325 2.37 48.392 2.71 JGC-04-003 17.000 1.00 21.575 1.27 42.175 2.48 47.083 2.77 JGC-04-004 17.475 1.00 21.500 1.23 42.417 2.43 45.683 2.61 JGC-04-006 17.975 1.00 22.650 1.26 42.417 2.36 − − JGC-04-007 17.892 1.00 21.400 1.20 42.708 2.39 47.067 2.63 平均值 17.720 1.00 21.481 1.21 42.606 2.40 47.104 2.67 RSD(%) 2.1 0.0 1.9 2.1 1.1 1.7 1.4 2.3 注:“-”为样品中未检测到相关色谱峰。 -
分别采用Thermo、Agilent、Diamonsil色谱柱考察色谱柱的影响;柱温在20℃、25℃、30℃考察柱温的影响;流速为0.8、1.0、1.2 ml/min考察流速的影响。根据测定数据分析,色谱柱、柱温、流速均对特征峰相对保留时间具有一定的影响,其中流速及色谱柱型号对峰3、峰4影响较大,各色谱峰的影响RSD小于5.0%,属于可接受的范围(表5)。
表 5 不同色谱条件对相对保留时间的影响(n=3)
色谱条件 相对保留时间 峰1 峰2 峰3 峰4 色谱柱 Thermo 1.00 1.20 2.37 2.63 Agilent 1.00 1.22 2.54 2.93 Diamonsil 1.00 1.24 2.51 2.82 平均値 1.00 1.22 2.47 2.79 RSD(%) 0.00 1.30 3.00 4.40 柱温(℃) 25 1.00 1.20 2.34 2.60 30 1.00 1.20 2.37 2.63 35 1.00 1.19 2.34 2.64 平均値 1.00 1.20 2.35 2.62 RSD(%) 0.00 1.40 1.10 0.70 流速(ml/min) 0.8 1.00 1.20 2.37 2.63 1.0 1.00 1.20 2.53 2.85 1.2 1.00 1.19 2.66 3.08 平均値 1.00 1.20 2.52 2.85 RSD(%) 0.00 0.40 4.70 6.40 -
运用网络药理学的方法对中药成分进行研究,然后预测其药理活性作用测靶点、分析通路,再通过实验验证,探索中药的作用机制[21],进而预测中药作用的物质基础,寻找中药质量标志物,能够较好地结合中药的药效建立质量控制标准[22]。通过网络药理学预测发现,鸡骨草主要成分相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等药理活性与STAT3、MMP2、AR、AKT1、SPC、LCK、ESR1、CTNNB1、PPARγ、NOS2、HIF1A等靶标有关,可能作用于松弛素信号通路、HIF-1信号通路、ErbB信号途径、PI3K-Akt信号通路、JAK-STAT 信号通路等多种信号通路。实验研究发现,相思子碱可以通过抑制NOS、VEGF的表达,促进IL-1β刺激的人软骨细胞C28/I2进行细胞增殖并抑制细胞凋亡,进而起到治疗骨性关节炎的作用[23]。刺桐碱可以通过PI3K-Akt信号通路调控PPARγ起到抗炎的作用[24]。夏佛塔苷及异夏佛塔苷等能够通过调控PPARα及其下游蛋白,减少促炎性细胞因子生成,产生抗炎、抗氧化等作用,具有潜在的非酒精性脂肪肝治疗作用[25]。异夏佛塔苷可有效抑制脂多糖诱导的iNOS生成和促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β和COX2)的表达,能够显著降低脂多糖诱导的HIF1A、HK2和PFKFB3蛋白的表达[26]。文献报道的实验研究结果进一步验证了网络药理学的预测结果。因此,网络药理学在基于药理活性的鸡骨草质量标志物预测上具有一定价值,能够为鸡骨草质量标准的建立提供药效预测及研究基础。
鸡骨草药用为全草,但市场上鸡骨草药材叶损失严重,这是否会造成药材成分及其含量的变化进而影响药材质量?该实验分别取鸡骨草(JGC-003-012)供试品根、茎、叶等不同部位粉末1 g,参照2.3.2项下制备供试品溶液,测定药材不同部位相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等化合物的含量,记录保留时间及峰面积。计算含量发现根、茎、叶等不同部位所含3种成分含量分别为根:0.12%、0.08%、未检出;茎:0.02%、0.01%、0.06%;叶:未检出、0.01%、0.20%,相思子碱及刺桐碱主要存在于根、茎中,夏佛塔苷主要存在于叶和茎中,与文献报道[27]一致。因此保证根、茎、叶的相对存量是保障鸡骨草药材质量的重要因素。另外该实验同时测定了13批次鸡骨草药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物的量,对鸡骨草质量标准的研究具有一定意义。
鸡骨草除药用外,岭南多地常用于食疗保健中。由于相思子属鸡骨草、毛鸡骨草等基源相近、形态相似、民间及中医临床上常同功效应用,市场上常有毛鸡骨草等混淆或掺伪为鸡骨草药材,而现行版《中华人民共和国药典》(一部)2020年版及部分收载鸡骨草的中药标准等对鸡骨草质量的控制主要集中在性状和相思子碱的薄层鉴别上,而相思子碱在相思子属相思子、毛鸡骨草、美丽相思子等植物中均有发现,仅以此为指标化合物专属性不强。目前基于化学成分与药理活性的关联为依据制定中药质量仍然是中药质量标准研究的主要方向。本实验通过网络药理学与分子对接预测鸡骨草主要活性成分,筛选出药理活性较强的成分,并以此为基础,建立鸡骨草质量控制的HPLC特征图谱,最终选择相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等作为鸡骨草特征图谱的质量标志物。
Prediction of characteristic chromatogram for Abri Herba based on network pharmacology and molecular docking
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摘要:
目的 基于网络药理学与分子对接预测鸡骨草潜在质量标志物,并以此建立质量控制特征图谱。 方法 运用多种数据库通过网络药理学的方法构建“鸡骨草-成分-靶点-通路”网络关系结合分子对接,预测鸡骨草潜在的质量标志物,在此基础上采用高效液相色谱法建立鸡骨草特征图谱。 结果 通过网络药理学预测发现,鸡骨草中相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等成分与AKT1、STAT3、HIF1A、GRB2、MMP9等主要靶点蛋白关联密切,可作用HIF-1、PI3K-Akt、JAK-STAT 等信号通路,是鸡骨草潜在的质量标志物,以此为依据通过HPLC检测,根据保留时间建立鸡骨草特征图谱。 结论 通过网络药理学与分子对接预测结合HPLC检测,建立以相思子碱、刺桐碱及夏佛塔苷等成分为质量标志物的鸡骨草特征图谱,能够结合成分与药理活性控制鸡骨草的质量。 Abstract:Objective To predict the potential Q-markers of Abri Herba based on network pharmacology and molecular docking and establish a quality control characteristic. Methods The network relationship of “Abri Herba - component - target - pathway” was constructed by using a variety of databases and the method of network pharmacology. The potential Q-markers of Abri Herba were predicted and then the characteristic Chromatogram of Abri Herba was established by high performance liquid chromatography Results Through the network pharmacological prediction, it was found that the components of abrine hypaphorine, schaftoside in Abri Herba were closely associated with the main targets, such as AKT1, STAT3, HIF1A, GRB2, MMP9, which could act on HIF-1, PI3K-Akt, JAK-STAT and other signaling pathways and have good pharmacological activities to be potential Q-markers of Abri Herba. Then HPLC was used to establish the characteristic according to retention time. Conclusion Through network pharmacology and molecular dock-prediction combined with HPLC detection, the characteristic chromatogram was established with the components of abrine hypaphorine, schaftoside as Q-markers, which could control the quality of Abri Herba by combining the components and pharmacological activities. -
Key words:
- Abri Herba /
- network pharmacology /
- Q-markers /
- characteristic chromatogram
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玉米(Zea mays L.)属于禾本科玉蜀黍属一年生草本植物。玉米须(corn silk, maydis stigma)是玉米的干燥花柱及柱头,是我国传统中药材,《滇南本草》最早记载其入药,1985年版《中华人民共和国卫生部药材标准》将玉米须列为常用药材品种,并在1977年版《中国药典》中收录。
玉米须, 别名蜀黍须、玉蜀黍须、包谷须, 秋季玉米收获时采收,烘干或晒干。玉米须性平, 味甘、淡,具有利尿消肿、平肝利胆的功效,《黄帝内经》中记载,玉米须在治疗前列腺疾病方面具有良好的效果。玉米须还被广泛用作茶[1]、功能食品及食品添加剂[2-3]。现代研究表明,玉米须黄酮类化合物是玉米须治疗肥胖、高血糖、肾炎、膀胱炎、痛风、前列腺炎等疾病的重要药效成分[4-5]。本文通过对近10年文献的查阅, 综述了玉米须黄酮在提取工艺、成分表征、含量测定、药理作用及安全性方面的研究进展, 为玉米须黄酮的进一步开发应用提供参考。
1. 提取工艺研究
1.1 总黄酮的提取
热回流提取法是提取中药有效成分和有效部位最常用的方法。虽然热回流提取法的提取效率非常高,但样品在持续的受热过程中不稳定,导致有效成分分解,得到的产品品质也会降低。近年来,具有低温、高效、时间短等优点的超声波提取法、微波提取法被广泛用于中药有效部位的提取,提取效率要远高于普通浸提法和热回流提取法。近几年有多篇文献对玉米须总黄酮的提取工艺进行了研究,详细总结见表1。
表 1 玉米须总黄酮提取工艺编号 提取方法 优化工艺条件 总黄酮提取率
(mg/g)参考
文献1 回流提取法
(单因素试验结合响应面法)温度80℃、时间2.5 h、pH值 2.0、乙醇体积分数72%、
液料比70 ml/g3.89 [6] 2 真空减压提取法
(单因素试验和正交试验)真空度 0.07 Mpa、时间35 min、乙醇体积分数 50%、
液料比 40 ml/g1.35 [7] 3 超声波提取法
(正交试验)超声功率 500 W、超声温度70℃、超声提取时间10 min、
乙醇体积分数60%、料液比70 ml/g34.58 [8] 4 超声波提取法
(响应面优化法)超声功率 500 W、超声温度57℃、超声时间45 min、
乙醇体积分数70%、液料比26 ml/g23.37 [9] 5 超声波-双酶协同提取法
(Box-Behnken 响应面设计法)超声功率 173 W、超声时间35 min、乙醇体积分数60%、
液料比 31 ml/g、酶解时间 42 min、加酶比(果胶酶∶纤维素酶)1.9∶17.2 [10] 6 超声波辅助提取法 超声功率 260 W、超声温度63℃、超声时间 l7 min、
乙醇体积分数60%5.63 [11] 7 微波辅助提取法(正交试验优化) 提取时间 8 min、乙醇体积分数 60%、液料比50 ml/g 7.87 [11] 1.2 总黄酮的纯化
采用溶剂法提取获得的玉米须黄酮提取物总黄酮含量比较低,一般要经过色谱方法进行纯化才能获得高含量的总黄酮。包京姗等[12]考察了D101大孔吸附树脂对超声提取的玉米须总黄酮的纯化效果,5 g大孔吸附树脂、总黄酮上样液质量浓度7 mg/ml、上样液体积1 ml、盐酸调pH值为3、60%乙醇洗脱、洗脱体积为5 倍柱体积、流速1.0 ml/min,纯化后总黄酮的纯度质量分数由41.35%提高到69.20%。刘杰等[13]比较了5种大孔吸附树脂的静态吸附-解吸总黄酮的效果,发现AB-8型大孔吸附树脂纯化玉米须总黄酮效果最佳。单因素试验结合响应面法确定了AB-8大孔吸附树脂柱色谱的最佳参数为:总黄酮上样液质量浓度1.41 mg/ml、洗脱液流速2.00 ml/min、乙醇体积分数为70%、总黄酮的平均解吸率为96.52%。上述研究为玉米须总黄酮的纯化提供了理论参考。
2. 黄酮成分分离与表征
目前,已从玉米须中分离得到的黄酮类成分类型众多,包括黄酮及其苷类、黄酮醇及其苷类、二氢黄酮及其苷类、异黄酮及其苷类、黄烷类、花青素类等,且苷类成分既有氧苷也有碳苷。由于黄酮类成分极性适中,容易分离得到,所以前期已经分离获得了大量的玉米须黄酮类化合物。近几年从玉米须中分离得到的新黄酮类化合物并不多,仅检索到3个新黄酮碳苷。Sarfare等[14]运用多种色谱分离技术及光谱鉴定技术,从玉米须中分离得到2个为新黄酮碳苷:chrysoeriol 6-C-β-oliopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranoside, 3'-methoxycassiaoccidentalin A,以及2个已知的黄酮类成分chrysoeriol 6-C-β-boivinopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranoside和ax-4"- hydroxy-3'-methoxymaysin。宋少江课题组[15]从玉米须中分离得到1个新黄酮碳苷silkone A,以及3个已知的黄酮类成分莲子草素 (alternanthin), [(2S)-7,4'-二羟基-3'-异戊烯基-黄烷]和 [(2S)-7,3'-二羟基-4'-甲氧基黄烷]。新黄酮碳苷及玉米须中主要黄酮类化合物的结构如图1所示。
与传统的色谱分离方法相比,液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)越来越多地应用于复杂体系化学成分全面表征的研究中。高分辨率质谱法提供了精确的分子质量信息,从而有助于识别未知化合物;生物信息学的发展提升了化学分析和质谱数据处理的能力;各种工具和成倍增加的网络平台有助于代谢产物的鉴定研究。例如,Fougère等[16]采用超高效液相色谱/高分辨二级串联质谱(UHPLC/HRMS2)方法共表征了玉米须中的104个化合物,并进一步结合全球天然产物社会分子网络(GNPS)平台和Cytoscape软件以及文献对照等方法鉴定了其中的19个黄酮类化合物,但由于缺乏对照品,最终并没有全部确定这些化合物的结构。目前已报道从玉米须中鉴定的黄酮类化合物有:5,7,4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮-6-C-α-L-(鼠李糖-α-L-1,2-鼠李糖苷)[17]、ax-5"-甲烷-3′-甲氧基玉米素(ax-5"-methane-3′-methoxy maysin)[17]、5,7,4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮-3-C-β-D-阿拉伯糖苷-6-C-α-L-鼠李糖苷[17]、香叶木素(Diosmetin)[18]、夏佛塔苷(Schaftoside)[18]、异荭草素(Isoorientin)[18]、大豆苷(Daidzin)[18]、当药黄素(Swertisin)[18]、红车轴草素-7-O-β-D-吡喃葡糖苷(Pratensein 7-O-β-glucopyranoside)[18]、芹糖葛根素苷(Mirificin)[18]、漆黄素(Butin)[18]、牡荆素(Vitexin)[18]、野漆树苷(Rhoifolin)[18-19]、皂草苷(Saponarin)[18] 、李属异黄酮苷(Prunetrin)[19]、木犀草素(Luteolin)[19]、2"-O-α-L-鼠李糖基-6-C-(3-脱氧葡萄糖基)-3'-甲氧基木犀草素(2"-O-α-L-rhamnosyl-6-C-3-deoxyglucosyl-3′-methoxyluteolin)[20]、6,4'-二羟基-3'-甲氧基黄酮-7-O-β-葡萄糖苷(6,4′-dihydroxy-3′-methoxyflavone-7-O-β-glucoside)[20]、锦葵素(Malvidin)[20]、芍药素(Peonidin)[20]。
3. 含量测定
总黄酮是玉米须的主要有效部位之一。玉米须及其相关产品的质控也多以总黄酮为指标,其含量也将直接影响玉米须的品质及相关产品的功效。徐建霞等[21]对比分析了贵州常用的8种骨干玉米在3个不同生长时期(吐丝未授粉期、灌浆期和成熟期)的玉米须总黄酮的含量。研究结果显示,未授粉期6号(1703)材料总黄酮含量最高,品质最优。研究结果为筛选玉米须原料和选择采收期提供了科学依据。彭磊等[22]建立了紫外分光光度法测定玉米须黄酮含量的方法,测定波长为 400 nm,共测定了15 批样品,总黄酮的含量范围是3.896 ~ 9.512 mg/g。侯少平等[23] 以芦丁为对照品,利用紫外-可见分光光度法对陕西兴平种植的3种玉米须的乙醇提取物总黄酮含量进行测定,郑单958含量最高达10.739 mg/g,申单9号含量为8.174 mg/g,武科 2号含量最低为 4.684 mg/g。
彭磊等[22]采用HPLC方法对购于河南河北的15批玉米须中芹菜素的含量进行了测定,芹菜素的含量范围为0.047~0.246 mg/g,含量差异可达5倍以上。张晓明等[24] 测定了山西原平、定襄、五台、忻州4个不同产地的玉米须样品中芦丁的含量,其中忻州样品的芦丁含量最高为0.623 mg/g。研究结果显示不同产地不同品种所含有效成分的含量也具有较大的差异,这也进一步说明了优质品种筛选的重要性。上述2篇文献分别以芹菜素和芦丁作为指标成分对玉米须的品质评价进行了研究。芹菜素和芦丁两个黄酮类化合物在植物中广泛存在,以此为标准评价玉米须的品质缺乏专属性和选择性。如能结合药理学研究结果,选用具有生物活性的黄酮类化合物为指标成分,可更好地评价玉米须的品质。
4. 药理作用
4.1 抗糖尿病
玉米须黄酮具有显著抗糖尿病作用。Zhang等[25]采用链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型评价玉米须粗黄酮(CSFs)的抗糖尿病活性。研究结果显示,CSFs给药4周后,可显著降低糖尿病小鼠的体重及耗水量,尤其是血糖浓度,且CSFs高剂量组(500 mg/kg)降低糖尿病小鼠体重的作用最强;与糖尿病模型对照组相比,CSFs高剂量组可显著降低糖尿病小鼠血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙二醛(MDA)和肝糖原水平,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和超氧化物歧化酶(SOD)水平略有升高。研究结果说明,CSFs可能是通过调节脂质代谢、清除氧自由基以保护机体的新陈代谢和修复机体的抗氧化能力等途径发挥抗糖尿病作用。
杨生辉等[26]研究发现,玉米须总黄酮对晚期糖基化终产物、乙酰胆碱酯酶和α-葡萄糖苷酶具有一定抑制活性,且呈现浓度依赖性。采用Pearson相关分析法对玉米须黄酮含量与抗糖基化、乙酰胆碱酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制能力进行相关性分析,发现抗糖基化、乙酰胆碱酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性与黄酮含量呈正相关(相关系数r分别为0.83、0.90和0.57,P<0.05)。
Li等[9]采用网络药理学方法计算发现,芦丁、木犀草素、高车前素是玉米须抑制高血糖活性的主要活性成分。Chaudhary等[27]采用分子对接的方法预测玉米须中生物活性物质对糖尿病相关靶点的结合亲和力。26种生物活性物质与5个不同的靶标(蛋白酪氨酸磷酸酶1-B、葡萄糖转运蛋白-1、二肽基肽酶-4、α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶)对接,发现儿茶素、槲皮素、芦丁、山柰酚等化合物对蛋白酪氨酸磷酸酶1-B(PTPN-1B)具有最高的结合亲和力,结合能最高为 −8.5 kcal/mol,可用于研究和开发新的抗糖尿病分子。
4.2 抗炎、镇痛作用
Jeong等[28]采用乙酸诱导的小鼠扭体反应和二甲苯诱导的美国癌症研究所(ICR)小鼠耳肿胀模型研究玉米须黄酮提取物(MSE)的体内镇痛和抗炎作用。ICR小鼠灌胃不同剂量的MSE(100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg),发现300 mg/kg的MSE可显著抑制乙酸注射引起的扭体反应(52.40%),并显著减少二甲苯诱导的小鼠耳肿胀度(77.61%)。组化分析结果显示,MSE能以剂量依赖的方式减少水肿引起的小鼠耳组织细胞浸润或肿胀,其中300 mg/kg 玉米须黄酮提取物的抑制作用比阳性药吲哚美辛更显著。采用二甲苯致小鼠耳肿胀实验、热板实验和扭体实验等方法,律广富等[29]研究了玉米须总黄酮的抗炎、镇痛作用。小鼠以玉米须总黄酮(2.12 g/kg、1.06 g/kg、 0.53 g/kg)预灌胃给药7 d后,与模型对照组相比,药物中、高剂量组小鼠耳肿胀度显著降低(P<0.05),出现舔足时间显著延长(P<0.05);药物高剂量组出现扭体时间显著延长、扭体次数显著减少(P<0.05)。
采用脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎症模型,研究玉米须黄酮的体外抗炎特性及其分子机制[28],结果表明,玉米须黄酮(10 μg/ml、100 μg/ml、 200 μg/ml)可显著降低LPS诱导巨噬细胞的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶(COX-2)水平,剂量依赖性地抑制NO的分泌,且不会产生细胞毒性。深入研究发现,玉米须黄酮对LPS诱导的巨噬细胞的抗炎活性可能与急性期蛋白(AP-1)信号通路的抑制有关。
4.3 抗痛风
已有多项研究报道,玉米须黄酮对急性痛风性关节炎具有改善作用。律广富等[29]采用尿酸钠诱导家兔急性痛风性关节炎模型,研究了玉米须黄酮抗炎、镇痛活性,及其对家兔急性痛风关节炎的改善作用。玉米须黄酮(0.58 g/kg、0.29 g/kg、0.15 g/kg)预灌胃给药7 d后,与模型组比较,药物组滑膜组织炎症明显减轻,充血、水肿、滑膜增生不明显,并显著减少炎细胞浸润。林贺等[30]测试了玉米须黄酮提取物对尿酸钠诱导大鼠痛风性关节炎的影响。研究结果显示,玉米须黄酮提取物高、中剂量组(1 g/kg、0.5 g/kg) 可显著减轻踝关节肿胀度(P<0.01),降低血浆白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤生长因子-α(TNF-α)及血浆细胞间粘附分子1(ICAM-1)、基质金属蛋白酶-1 (MMP-1)水平(P<0.05),显著改善大鼠关节滑膜组织的病理变化。
李萍等[31]采用氧嗪酸钾和单钠尿酸盐(MSU)联合诱导的大鼠改良痛风模型,研究玉米须黄酮提取物对改良急性痛风模型大鼠的改善作用及可能的作用机制。结果表明,造模 24 h 后,黄酮提取物高、中剂量组及秋水仙碱组大鼠的踝关节肿胀度均显著减轻(P<0.05)。给药 7 d 后,与模型组相比,黄酮提取物高、中剂量组及秋水仙碱组大鼠血清 IL-1β水平均显著降低(P<0.05),黄酮提取物高、中剂量组及苯溴马隆组大鼠血清尿酸(UA)水平均显著减少(P<0.01)。研究结果表明,玉米须黄酮可能是通过抑制炎性细胞因子 IL-1β 的表达缓解急性痛风性关节炎的急性炎症反应。
4.4 神经保护作用
冯小童[32]研究了玉米须总黄酮(STF)对β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)所致阿尔兹海默症(AD)模型小鼠学习记忆能力的影响。玉米须总黄酮灌胃治疗3 周后,通过检测小鼠空间学习记忆能力、脑组织中ROS 和MDA 含量评价其药效。结果显示,STF 高剂量组较AD 模型组可显著增加空间学习记忆能力(P<0.01),明显降低脑组织中 ROS 和 MDA 含量(P<0.01)。玉米须总黄酮具有改善 Aβ25-35 所致 AD 小鼠学习记忆的能力,可能与抑制 AD 小鼠脑内氧化应激反应有关。
Ryuk等[33]则考察了玉米须黄酮水提取物(CSW)对缓解蒙古沙土鼠短暂性脑缺血再灌注(I/R)的缺血性卒中症状和卒中后高血糖的影响。在其 40% 能量脂肪饮食中给予0.05% CSW(I/R-L)和0.2% CSW(I/R-H)、0.02% 阿司匹林(I/R-阿司匹林)和纤维素(I/R-对照)3周后,对蒙古沙土鼠进行8 min的动脉闭塞和再灌注,并按照规定的饮食继续喂养3周。CSW的摄入减少了I/R损伤蒙古沙土鼠的神经元细胞死亡,并剂量依赖性地改善了神经症状,包括下垂的眼睛、蹲姿、屈肌反射和行走模式;减轻了短期记忆、自发变化和握力;对缺血性卒中症状的保护作用与TNF-α、IL-1β、超氧化物和脂质过氧化物水平降低有关,从而促进海马组织超氧化物歧化酶活性;改善血流等。此外,CSW可预防与降低胰腺β细胞质量相关的卒中后高血糖,并且与保护β细胞凋亡有关,恢复了与假手术组类似的β细胞质量。与I/R对照组相比,CSW摄入提高了乳酸杆菌、双歧杆菌、异杆菌和阿克曼菌的相对丰度。Picrust2分析表明,与I/R对照组相比,CSW增加了丙酸盐和丁酸盐的代谢以及淀粉和葡萄糖的代谢,但减少了脂多糖的合成。总之,CSW通过减少氧化应激和炎症、增加血流量和β细胞质量来预防神经元细胞死亡和高血糖症,这种缓解可能是通过改善肠-脑轴相关的肠道微生物组群落来实现的。
4.5 护肤作用
玉米须在美白保健护肤方面也具有很大潜在价值。Wang等[15]建立了微量2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)自由基清除法,评价从玉米须中分离得到的1个新黄酮化合物silkone A以及3个已知的黄酮类物质,莲子草素 (alternanthin),(2S)-7,4'-二羟基-3'-异戊烯基-黄烷和 (2S)-7,3'-二羟基-4'-甲氧基黄烷对自由基清除能力的大小。其半数抑制浓度 (IC50)值31.34~37.04 μmol/L,显示比阳性药Trolox具有更强的自由基清除活性。2个黄烷化合物 [(2S)-7,4'-二羟基-3'-异戊烯基-黄烷、(2S)-7,3'-二羟基-4'-甲氧基黄烷] 对酪氨酸酶表现出中等的抑制活性,IC50 值分别为0.49 mmol/L和0.21 mmol/L。通过分子对接计算进一步研究推测,2个黄酮配体与活性位点残基之间的氢键相互作用可能是其发挥抑制酪氨酸酶活性的关键。研究证实了玉米须黄酮类化合物在抗氧化和抑制酪氨酸酶活性方面的潜力,并为开发玉米须护肤产品提供依据。
紫外线B(UVB)照射会对皮肤产生不良影响。玉米须含有的黄酮类化合物可通过抗氧化和抗炎作用防止皮肤光老化。Kim等[34]研究了膳食玉米须对UVB诱导的小鼠皮肤损伤的潜在光保护作用以及作用机制。口服玉米须水提取物 (CS)2 g/(kg·d)或4 g/(kg·d)19周,显著降低了UVB照射的SKH-1无毛小鼠的表皮厚度、皱纹形成和增殖细胞核抗原 (PCNA)、Ki67和8-OHdG阳性染色,并增加了胶原染色。CS组的促炎核因子κB (NF-κB)靶基因 (IL-1β、iNOS和COX-2)和MMP-9的表达较低,转化生长因子β/Smad (TGF-β/Smad)信号传导增加。检测到皮肤脂质过氧化和血液DNA氧化水平较低,血液谷胱甘肽含量较高,抗氧化转录因子Nrf2相关的过氧化氢酶和人超氧化物歧化酶1 (SOD1)蛋白以及谷胱甘肽信使核糖核酸水平增加。CS提取物可以通过抗氧化和抗炎机制减少UVB诱导的皮肤损伤。
李浩楠等[35]在对玉米须总黄酮活性成分研究的基础上,通过正交设计对一款含玉米须总黄酮美容产品的基质进行优化,确定了最终制剂处方。优化后的制剂处方为,水相组分:氮酮 2%、尼泊金乙酯 0.1%、甘油 10%、单硬脂酸甘油酯 5%、乳化剂三乙醇胺 4%、玉米须总黄酮 5%;油相组分:液状石蜡 10%、白凡士林5%、硬脂酸 10%。该研究结果为进一步研制一款具有抗氧化作用的美容产品奠定基础。
4.6 细胞毒作用
玉米须总黄酮提取物具有显著的抗肿瘤活性,已有报道玉米须提取物(SME)可显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长,显著延长S180 荷瘤鼠存活时间,并增强体外淋巴细胞转化功能[36]。Lee等[37]研究了玉米须提取物主要活性成分maysin 对雄激素依赖性人前列腺癌症细胞(PC-3)的细胞毒活性。结果表明,maysin可剂量依赖性地降低PC-3 细胞的活性,在200 μg/ml剂量时抑制了87%的PC-3细胞活性。Maysin可显著诱导凋亡细胞死亡、DNA断裂、MMP去极化,并降低B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)和半胱天冬酶-3酶原抗体(PRO-CASPASE-3)表达水平;显著减少蛋白激酶B(Akt)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化;与其他已知抗癌药物 [包括氟尿嘧啶(5-FU)、依托泊苷、顺铂或喜树碱] 联合,可协同增强PC-3细胞凋亡性死亡的作用。这些结果首次证实,maysin可通过线粒体依赖性通路诱导PC-3癌细胞株的细胞凋亡,并可能对化疗耐药或雄激素依赖性人类前列腺癌具有强大的治疗潜力。
4.7 降脂作用
长期以来,玉米须及其提取物作为一种传统的民间药物在世界许多地方被广泛应用,玉米须提取物作为茶和功能食品添加剂具有抗高脂血症和抗糖尿病的特性[38]。然而,这些研究大多是使用玉米须的粗提取物进行的,关于玉米须提取物中单个成分的生物和药理活性的研究一直很少。
Lee等[39]利用小鼠前脂肪细胞(3T3-L1)和C57BL/6小鼠模型,研究了玉米须中主要黄酮类化合物maysin 在体外和体内的潜在抗肥胖作用。Maysin能降低细胞内脂滴和TG的水平,并下调了3T3-L1细胞中转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBP-α)、转录因子CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBP-β)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)和急性期蛋白2(aP2)的蛋白质表达水平,抑制细胞内脂质积聚和脂肪细胞分化。Maysin通过激活胱天蛋白酶级联反应和线粒体功能障碍诱导3T3-L1细胞凋亡,最终导致脂肪组织质量减少。动物实验表明,maysin(25 mg/kg体重)可降低高脂饮食(HFD)喂养的C57BL/6小鼠的体重增重和附睾脂肪重量,降低了小鼠血清TG、总胆固醇、LDL胆固醇和葡萄糖的水平。这些结果首次表明maysin在体外和体内具有降脂活性,发挥抗肥胖作用,是玉米须提取物的主要有效成分。
5. 安全性研究
玉米须在中国和许多其他国家作为传统草药或功能性食品使用历史悠久,曾被1977版《中国药典》收载。因此,对玉米须的安全性评价具有重要意义。Peng等[40]评估了玉米须黄酮苷提取物(FMS)对小鼠的亚慢性毒性和遗传毒性。在亚慢性毒性研究中,小鼠口服FMS 2.50 g/(kg·d)、5.00 g/(kg·d)和10.00 g/(kg·d),连续28 d。实验结束时,检查一般临床症状、死亡率、血液学、生化和组织病理学参数。通过微核实验和精子畸形实验对FMS的遗传毒性进行评价。结果显示,实验期间所有动物均存活,与对照组相比,所有FMS治疗组均未观察到统计学显著差异或毒理学相关的差异;未观察到的不良反应水平(NOAEL)剂量确定为10 g/(kg·d)。根据微核实验和精子畸形实验的结果,即使在实验上限剂量10 g/(kg·d)时,也没有在体细胞或生殖细胞中发现遗传毒性的证据。
Ha等[41]报道了玉米须提取物对ICR小鼠的急性和亚急性毒性。小鼠口服灌胃玉米须提取物2 g/(kg·d),测试其急性毒性,记录14 d的临床症状、死亡率和体重变化。在实验期间,所有药物组均未观察到死亡或异常症状。与对照组相比,体重没有任何显著变化。玉米须提取物的致死剂量估计超过2 g/kg。小鼠口服灌胃玉米须提取物500 mg/(kg·d),连续4周,测定体重、水和食物消耗量以及器官重量。玉米须提取物对体重、水分摄入、食物消耗、尿液参数、临床化学或器官重量没有相关毒性影响。组织病理学检查显示没有异常,确定玉米须提取物的最大无毒剂量超过500 mg/kg。
Saheed等[42]评估了Wistar大鼠给予100、200、400 mg/kg体重的玉米须水提取物1、7、14、21和28 d后,对血液学指标的毒理学影响,并在实验结束后分析了其脂质参数。在所有测试剂量下,玉米须水提取物对红细胞、红细胞压积、血红蛋白、平均红细胞体积、平均红血球血红蛋白、平均白细胞血红蛋白浓度和平均血小板体积没有任何显著影响(P>0.05)。研究还表明,玉米须水提取物可显著升高血清白细胞、血小板、淋巴细胞、高密度脂蛋白胆固醇水平;显著降低总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和动脉硬化指数。研究结果显示,在实验剂量范围内,玉米须水提取物不具有血液毒性,并且可能是治疗冠心病的良好候选药物。以上研究结果表明,玉米须提取物作为功能性食品、食品添加剂和天然药物的使用是安全的。
6. 结论
近10年来,玉米须黄酮在食品、保健品及药品领域的应用越来越广泛,相关研究受到了国内外众多学者的关注。玉米须黄酮化学成分的研究发现了新的黄酮碳苷,丰富了玉米须黄酮类化合物的种类;多项药理学研究证实玉米须黄酮具有抗糖尿病、抗炎镇痛、细胞毒、护肤、神经保护、抗痛风以及降脂等作用,拓展了玉米须应用功效;安全性评价为玉米须黄酮的安全应用提供了理论依据。综上,玉米须黄酮的应用及市场仍具有很大的潜力,还需要深入系统的研究为玉米须黄酮的应用提供理论依据。
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表 1 成分-靶标分子对接结果
靶标 PDB ID 活性成分 结合能(kcal/mol) AKT1 4GAH 相思子碱 −4.67 刺桐碱 −4.34 夏佛塔苷 −2.98 STAT3 5AX3 相思子碱 −4.72 刺桐碱 −4.56 夏佛塔苷 −2.82 HIF1A 3OUI 相思子碱 −4.02 刺桐碱 −3.93 夏佛塔苷 −2.36 大豆皂苷Bb −0.27 GRB2 3IMD 相思子碱 −5.0 刺桐碱 −5.66 夏佛塔苷 −4.68 大豆皂苷Bb −2.46 MMP2 8H78 相思子碱 −7.21 刺桐碱 −7.02 夏佛塔苷 −5.83 大豆皂苷Bb −4.28 表 2 对照品色谱峰相对保留时间
峰 名称 保留时间
(t/min)相对保留
时间精密度
RSD(%)峰1 相思子碱 18.058 1.00 0.6 峰2 刺桐碱 21.658 1.20 0.7 峰3 夏佛塔苷 42.865 2.37 0.4 峰4 异夏佛塔苷 47.433 2.63 0.3 表 3 稳定性实验色谱峰保留时间(t/min)
时间(t/h) 相思子碱 刺桐碱 夏佛塔苷 异夏佛塔苷 0 16.892 20.783 42.283 46.967 2 16.892 20.783 42.283 46.967 4 16.900 20.808 42.308 47.000 8 16.867 20.758 42.258 46.950 12 16.858 20.742 42.242 46.942 24 16.875 20.775 42.300 47.000 RSD(%) 0.09 0.10 0.05 0.05 表 4 样品特征峰相对保留时间(n=13)
样品 相思子碱峰 刺桐碱峰 夏佛塔苷峰 异夏佛塔苷峰 保留时间
(t/min)相对保
留时间保留时间
(t/min)相对保
留时间保留时间
(t/min)相对保
留时间保留时间
(t/min)相对保
留时间对照品 18.058 1.00 21.658 1.20 42.865 2.37 47.433 2.63 JGC-01-001 17.717 1.00 21.175 1.20 42.400 2.39 46.767 2.64 JGC-01-002 17.733 1.00 21.183 1.19 42.200 2.38 46.917 2.65 JGC-01-003 18.025 1.00 21.658 1.20 42.900 2.38 − − JGC-01-004 18.033 1.00 21.683 1.20 43.950 2.44 47.483 2.63 JGC-01-006 18.183 1.00 21.408 1.18 42.700 2.35 47.542 2.61 JGC-01-007 17.967 1.00 21.675 1.21 42.933 2.39 − − JGC-01-010 16.881 1.00 20.775 1.22 42.279 2.49 47.000 2.78 JGC-03-004 17.650 1.00 21.225 1.20 42.475 2.41 − − JGC-03-012 17.833 1.00 21.350 1.20 42.325 2.37 48.392 2.71 JGC-04-003 17.000 1.00 21.575 1.27 42.175 2.48 47.083 2.77 JGC-04-004 17.475 1.00 21.500 1.23 42.417 2.43 45.683 2.61 JGC-04-006 17.975 1.00 22.650 1.26 42.417 2.36 − − JGC-04-007 17.892 1.00 21.400 1.20 42.708 2.39 47.067 2.63 平均值 17.720 1.00 21.481 1.21 42.606 2.40 47.104 2.67 RSD(%) 2.1 0.0 1.9 2.1 1.1 1.7 1.4 2.3 注:“-”为样品中未检测到相关色谱峰。 表 5 不同色谱条件对相对保留时间的影响(n=3)
色谱条件 相对保留时间 峰1 峰2 峰3 峰4 色谱柱 Thermo 1.00 1.20 2.37 2.63 Agilent 1.00 1.22 2.54 2.93 Diamonsil 1.00 1.24 2.51 2.82 平均値 1.00 1.22 2.47 2.79 RSD(%) 0.00 1.30 3.00 4.40 柱温(℃) 25 1.00 1.20 2.34 2.60 30 1.00 1.20 2.37 2.63 35 1.00 1.19 2.34 2.64 平均値 1.00 1.20 2.35 2.62 RSD(%) 0.00 1.40 1.10 0.70 流速(ml/min) 0.8 1.00 1.20 2.37 2.63 1.0 1.00 1.20 2.53 2.85 1.2 1.00 1.19 2.66 3.08 平均値 1.00 1.20 2.52 2.85 RSD(%) 0.00 0.40 4.70 6.40 -
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