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参麻颈复颗粒是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院经典的自制制剂，由丹参、山茱萸、栀子、续断等10余味药物组成，具有活血通络，宁神安脑，健筋壮骨的功效。通过益气活血、滋阴降火、补肝益肾、温脾化痰以达到气血双补、上中下统调的治疗作用[1]，多用于颈椎病、脑供血不足、头昏胀痛、夜寐梦扰等。脑梗死属于中医“中风”范畴，是指各种原因引起的脑部血液供应障碍，使局部脑组织发生不可逆性损害[2]，主要采用溶栓、抗血小板或抗凝、调脂药以及脑保护药等治疗手段。参麻颈复颗粒作为上海中医药大学附属岳阳医院（本院）的特色自制制剂，在数十年的临床应用中发现其对脑梗死患者的预后有明显的治疗作用，研究表明该方中当归[3]、川芎[4]、蒺藜[5]、杜仲[6]、天麻[7]等药味均对脑梗死有一定的疗效，但作用机制尚不清楚。本研究借助网络药理学方法，对参麻颈复颗粒治疗脑梗死的作用机制进行研究，预测可能的活性成分、作用靶点及通路，为该制剂的进一步研发提供参考依据。
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参麻颈复颗粒共由十二味中药组成，本研究利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP数据库） [8]、中药百科全书数据库（ETCM数据库）[9]、中医药资料库检索参麻颈复颗粒中组成中药的化学成分，TCMSP 数据库没有收录中药天麻和首乌藤，因此天麻的化学成分从ETCM数据库检索，首乌藤的化学成分从中医药资料库数据库检索[10-11]，鉴于不同数据库中化学成分名称可能不同，因此将检索的化学成分根据其CAS 匹配到 TCMSP，找到该化学成分并获取其作用靶点。其余十味药通过TCMSP查找并导出用于筛选活性成分的相应数据，根据参数的口服生物利用度( oral bioavailability, OB) 和类药性( drug-likeness, DL)[12]，以OB≥30%且DL ≥0.18作为条件筛选出活性成分，再利用TCMSP，关联相应的靶点，得到潜在靶点蛋白，并通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）[13]匹配靶点蛋白所对应的基因。
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将参麻颈复颗粒的活性成分及潜在靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建参麻颈复颗粒的活性成分-预测靶点网络。 -
基于OMIM数据库[14]检索脑梗死相关靶蛋白基因，以脑梗死（cerebral infarction）和缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke）为关键词进行靶标检索，所有靶标均通过UniProt数据库获取其UniProt ID信息。 -
将OMIM中收集到的与脑梗死相关的所有蛋白质，导入STRING数据库，导出分值>0.7的高置信度蛋白相互作用数据，用Cytoscape 3.7.2软件构建与治疗脑梗死有关的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI) 网络。 -
利用Cytoscape 3.7.2软件中Merge功能，将参麻颈复颗粒活性成分-预测靶点网络与脑梗死的蛋白质-蛋白质相互作用网络合并，确定两者是否存在交集，通过Cytoscape 3.7.2软件构建参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络，系统分析参麻颈复颗粒治疗脑梗死的潜在作用靶点。 -
采用DAVID数据库( https://david.ncifcrf.gov/home.jsp) [15-17]，对与脑梗死相关的参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络中的蛋白进行基于KEGG的生物通路富集分析，并利用OmicShare对通路进行可视化，采用DAVID数据库，对与治疗脑梗死相关的参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络中的蛋白进行GO功能富集分析。 -
在TCMSP数据库中对十二味药的活性成分进行检索，共得到183个潜在有效成分（表1），其中有13个为共有成分（表2）。
表 1 参麻颈复颗粒中药对应潜在有效成分个数
编号 中药名称 检索名称 检索拼音名 中药名称缩写 潜在有效成分个数 1 丹参 丹参 DAN SHEN DS 65 2 蒺藜 蒺藜 JI LI JL 30 3 杜仲 杜仲 DU ZHONG DZ 28 4 栀子 栀子 ZHI ZI ZZ 13 5 山茱萸 山茱萸 SHAN ZHU YU SZY 12 6 天麻 天麻 TIAN MA TM 9 7 川芎 川芎 CHUAN XIONG CX 7 8 续断 续断 XU DUAN XD 5 9 陈皮 陈皮 CHEN PI CP 5 10 首乌藤 夜交藤 YE JIAO TENG YJT 5 11 当归 当归 DANG GUI DG 2 12 桑寄生 桑寄生 SANG JI SHENG SJS 2 表 2 参麻颈复颗粒中药共有潜在有效成分
编号 共有成分 来源 编号 共有成分 来源 A1 槲皮素 栀子、杜仲、桑寄生 A8 多孔菌素-5-烯-3β-醇 丹参、山茱萸、天麻 A2 β-谷甾醇 栀子、杜仲、山茱萸、续断、当归 A9 京尼平-1-O-龙胆双糖苷 杜仲、栀子 A3 谷甾醇 桑寄生、续断、蒺藜、川芎、陈皮 A10 表儿茶素 杜仲、首乌藤 A4 山柰酚 栀子、杜仲、蒺藜 A11 大黄素甲醚 蒺藜、首乌藤 A5 豆甾醇 栀子、山茱萸、当归 A12 异欧前胡素 丹参、栀子 A6 十八碳-6,9-二烯酸乙酯 栀子、山茱萸、川芎 A13 油酸乙酯 山茱萸、栀子 A7 3-β-羟基亚甲基-苯醌 杜仲、丹参 -
将筛选出的参麻颈复颗粒183个潜在有效成分导入到TCMSP，查找相应的靶点，得到1785个潜在靶点蛋白，并通过UniProt数据库匹配其蛋白所对应的基因。将结果导入到Cytoscape 3.7.2软件中进行网络构建，得到参麻颈复颗粒主要活性成分靶点网络（见表1和图1）。该网络共有519个节点、1 927条边，矩形方阵中浅蓝色菱形表示单味药的作用靶点、蓝色菱形表示共有的作用靶点、八边形图标表示参麻颈复颗粒活性成分、黄色箭头图标表示共有活性成分。参麻颈复颗粒的活性成分按度值排序，前四名分别为槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、豆甾醇。该网络的构建提示参麻颈复颗粒的组成中药均具有多活性成分、多靶点的特点。
图 1 参麻颈复颗粒主要活性成分-靶点网络
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在OMIM数据库检索与脑梗死相关的基因，共检索到216个相关基因靶点。参麻颈复有效成份的1785个潜在靶点蛋白，删除重复项后得到384个相关靶点。将成分靶点和疾病靶点输入BioVenn在线软件进行交集分析，绘制韦恩图，筛选出脑梗死与参麻颈复活性成分共有30个共同靶点（图2）。
图 2 参麻颈复活性成分与脑梗死共同靶点韦恩图
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将参麻颈复颗粒预测所得的基因与脑梗死相关基因进行映射后得到共有靶基因，输入STRING数据库进行蛋白-蛋白相互作用分析。在分析过程中，选取物种为Homosapiens ，并将蛋白-蛋白互作得分>0.7的基因输入Cytoscape 3.7.2进行网络可视化，共有30个节点，253个连线。应用软件中的Network analysis plugin对网络图中节点（Node）进行统计，分析其在图中的作用，自由度（Degree）越大，该节点在网络中的生物功能则越多。同时，颜色越深代表该节点自由度较大、生物功能较多（图3）。进一步对与脑梗死潜在靶点网络进行分析，得到网络中潜在靶点的度值，网络中有20个靶点的度值>16.86（平均度值），可能为参麻颈复颗粒活性成分发挥作用的潜在靶点。
图 3 参麻颈复颗粒治疗脑梗死的PPI网络图
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利用DAVID平台进行GO功能富集分析，对与脑梗死相关的参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络中涉及的30个蛋白在基因功能中的作用进行研究，得到了151个GO条目，根据P<0.05，筛选出117个GO条目，针对前10条BP分析、CC分析、MF分析绘制直方图（图4）。其中，生物过程相关的条目最多，有74个，结果显示参麻颈复颗粒主要对基因表达的正向调控、白细胞迁移、炎症反应、一氧化氮生物合成过程的正向调节等方面影响较大；分子功能相关的条目23个，结果显示参麻颈复颗粒主要对蛋白质结合、钙离子结合、受体活性、细胞因子活性等方面影响较大；细胞组成相关的条目20个，结果显示参麻颈复颗粒主要对细胞外间隙、质膜、细胞表面、胞外区等方面影响较大。
图 4 参麻颈复颗粒治疗脑梗死潜在靶点的GO富集分析
利用DAVID平台的KEGG通路富集分析功能，对与脑梗死相关的参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络中涉及的蛋白信号通路中的作用进行研究，得到19条信号通路，包括补体和凝血级联通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、HTLV-I感染、神经活性配体受体相互作用等。
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基于上述信息，构建活性成分-靶点-通路图，以全面阐述参麻颈复颗粒脑梗死的作用机制（图5、表3），图中有74个节点和188条边，黄色菱形代表参麻颈复颗粒活性成分，绿色圆形代表潜在靶点，红色箭头代表信号通路，边代表三者之间的相互作用。从结果可以看出参麻颈复方中槲皮素、β-胡萝卜素、柚皮素、西红花酸、大黄素、报春色素苷、表儿茶素等活性成分可能是参麻颈复治疗脑梗死的关键成分。
图 5 参麻颈复颗粒治疗脑梗死的“活性成分-靶点-信号通路”网络图
表 3 参麻颈复颗粒活性成分对照表
编号 活性成分 口服利用度（%） 类药系数 度值 A1 槲皮素 46.43 0.28 414 A4 山柰酚 41.88 0.24 174 A9 京尼平-1-O-龙胆双糖苷 36.91 0.75 45 TM1 蔗糖 37.17 0.23 38 CP1 柚皮素 59.29 0.21 34 TM3 琥珀酸 31.62 0.23 34 CP4 柠檬苦素 61.67 0.52 33 JL2 大黄素 32.41 0.24 33 JL1 异鼠李素 49.60 0.31 31 SWT1 表儿茶素 48.96 0.24 29 A11 大黄素甲醚 22.29 0.27 28 ZZ5 5-羟基-7-甲氧基-2-（3,4,5-三甲氧基苯基）色酮 51.96 0.41 25 CX1 杨梅酮 40.60 0.51 22 TM7 胡萝卜苷 36.91 0.75 20 JL4 麦黄酮 118.35 0.26 17 DZ11 （E）-3-[4-[（1R，2R）-2-羟基-2-（4-羟基-3-甲氧基-苯基）-1-羟甲基-乙氧基]-3-甲氧基苯基]丙烯醛 56.32 0.36 15 DZ20 报春色素苷 49.81 0.37 15 DZ5 β-胡萝卜素 37.18 0.58 15 DZ15 脱氢二甘醇4，γ'-二-O-β-D-吡喃糖苷 51.44 0.40 13 DZ13 （+）-右旋杜仲树脂酚 87.19 0.62 12 DZ4 40957-99-1 57.20 0.62 12 JL10 4-酮皮诺类 49.60 0.56 12 CP3 二氢川陈皮素 86.90 0.51 11 DZ19 4-[（2S，3R）-5-[（E）-3-羟基p-1烯基]-7-甲氧基-3-羟甲基-2,3-二氢苯并呋喃-2-基]-2-甲氧基苯酚 50.76 0.39 11 ZZ1 西红花酸 35.30 0.26 11 ZZ3 苏丹Ⅲ 84.07 0.59 11 A10 表儿茶素 48.96 0.24 10 TM6 香兰素 52.00 0.33 8 DZ8 AIDS214634 92.43 0.55 7 -
中药复方具有多活性成分、多作用靶点的特性，通过网络药理学手段，可以有效预测参麻颈复颗粒治疗脑梗死的作用机制。通过药物-化合物-靶点-通路网络的构建，可以发现参麻颈复颗粒中的陈皮、川芎、栀子、蒺藜、杜仲、天麻、首乌藤、山茱萸等药味中的槲皮素[18]、β-胡萝卜素[19]、西红花酸、柚皮素[20]、大黄素、报春色素苷、表儿茶素等活性成分可改善脑梗死患者的预后情况。研究显示槲皮素可通过抑制细胞凋亡和氧化应激水平，改善脑梗死受损神经功能，改善脑纤溶功能。β-胡萝卜素能阻止脑组织因自由基激活的氧化损伤，保护低密度脂蛋白免遭氧化损伤，在降低脑血管病危险因素方面有一定的作用。柚皮素可降低缺血再灌注损伤侧脑组织含水量、缩小脑梗死体积、降低脑组织MDA含量，提高SOD活性，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。通过GO功能富集结果提示，参麻颈复颗粒可能通过作用于纤溶酶原激活物抑制物1、血栓调节蛋白、凝血因子Ⅶ、血管内皮生长因子A等多个靶点，干预血小板激活、改善受损神经功能、保护脑缺血再灌注损伤，从而有助于脑梗死患者的恢复。
脑梗死后出现的炎症反应与脑损伤存在一定的关系，KEGG生物通路富集分析结果提示参麻颈复颗粒在干预脑梗死相关通路中，TNF信号通路和NF-κB信号通路起到了治疗脑梗死后炎症反应的重要作用。 IL-6靶点和TNF信号通路是脑梗死后重要的炎症反应通路[21]。NF-κB信号通路对炎症反应具有显著的影响，是脑缺血后炎性级联反应的始动因素[22]，NF-κB被激活，使其调控的靶基因转录活性升高，可诱导TNF和IL-6等炎症因子的产生，促进炎症发生发展和诱导细胞凋亡加重脑缺血的损伤。因此，参麻颈复颗粒可能是通过抑制NF-κB、TNF等炎症信号通路，起到保护脑血管损伤的作用。
HIF-1信号通路参与脑缺血组织的血管再生和血脑屏障的维持[23]，可以通过调控下游基因的转录，对抗低氧造成的细胞功能紊乱。HIF-1可以调控10余种下游基因的表达和转录，进而对多种细胞的多种生物学活动有重要影响[24]。因此，参麻颈复颗粒可能通过调节HIF-1信号通路促进对脑血管组织的再生，维持脑梗死患者的血脑屏障，改善脑梗死患者的预后情况。
本研究运用网络药理学的技术和方法，通过中药活性成分的筛选、靶点预测、网络构建与分析，从“药物-化合物-靶点-疾病”的关联性对中药复方参麻颈复颗粒治疗脑梗死的相关作用机制进行分析，预测参麻颈复颗粒治疗脑梗死的主要活性成分、作用靶点及信号通路，为进一步的实验验证提供依据。
Study on the treatment of cerebral infarction with Chinese medicine Shenmajingfu granule by network pharmacology
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摘要:
目的 应用网络药理学的研究方法探索中药复方参麻颈复颗粒治疗脑梗死的物质基础及其作用机制。 方法 通过TCMSP数据库、ETCM数据库、中医药资料库检索参麻颈复颗粒中潜在活性成分及作用靶点；OMIM数据库检索脑梗死相关靶蛋白基因，采用交集法获得参麻颈复颗粒与脑梗死的共同靶点基因。运用Cytoscape 构建“参麻颈复活性成分-靶点”网络，利用STRING 数据库构建PPI网络，采用DAVID数据库进行GO和KEGG 富集分析。 结果 筛选出参麻颈复颗粒的183个潜在有效成分，在TCMSP数据库中筛选到1785个潜在靶点蛋白，其中与脑梗死有关的作用靶点 30个，这些靶点基因主要参与炎症反应和细胞凋亡过程，涉及TNF信号通路、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路等。 结论 参麻颈复颗粒对脑梗死的治疗作用可能与调控炎症反应、改善受损神经功能、保护脑缺血再灌注损伤有关。 Abstract:Objective To explore the material basis and mechanism of the Chinese medicine Shenmajingfu granules in the treatment of cerebral infarction. Methods The potential active ingredients and targets of Shenmajingfu granules were retrieved through TCMSP, ETCM database and TCM Database. The related target genes of cerebral infarction were searched from OMIM database. The common targets of Shenmajingfu granules and cerebral infarction were obtained by the intersection method. Cytoscape was used to construct active components of Shenmajingfu granules-targets network. Protein-protein interaction network was constructed by STRING software. DAVID database was used for GO and KEGG enrichment analysis. Results The 183 potential active ingredients of Shenmajingfu granules were screened out. 1785 potential targets were screened in the TCMSP database, including 30 targets related to cerebral infarction. These target genes were mainly involved in the inflammatory response and apoptosis process, involving the TNF signaling pathway, HIF-1 signaling pathway and NF-κB signaling pathway. Conclusion The therapeutic effect of Shenmajingfu granules on cerebral infarction may be related to the regulation of inflammatory response, improvement of impaired neurological function and protection of cerebral ischemia-reperfusion injury. -
Key words:
- Shenmajingfu granules /
- cerebral infarction /
- network pharmacology
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流感是一种严重的上呼吸道病毒感染，由于其高毒力和突变率，该病毒仍然是对公众健康的主要威胁。据美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织估计，每年有多达65 万人死于季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。传统中医药预防和治疗流感病毒导致的感染（如呼吸道肺炎和支气管炎）已成为中国临床上常规治疗策略，发挥了独特的医疗优势[2,3]。
感冒安颗粒是由金银花、连翘、板蓝根、拳参、桑叶、紫苏和荆芥等七味中药制成的复方制剂，临床应用30 多年，具有疏散风邪，解表退热功能，其预防和治疗呼吸道感染的作用已得到很好的临床验证，特别是在病毒感染初期的治疗效果尤其显著，但药效物质基础并不清楚。目前，建立了TLC法对方中的板蓝根和连翘两味药材进行特征鉴别；同时对方中各药味的共有成分绿原酸和齐墩果酸也建立了TLC鉴别方法。在含量限度方面，则建立了制剂中连翘酯苷A的HPLC法。尽管这些获批的标准已用于制剂常规质量控制，但尚需进一步进行质量评价，以期更客观、准确地反映感冒安颗粒的临床疗效。
由于中药复方复杂的化学成分，它的药理作用是通过多靶点、多途径而实现的。流感病毒感染的病理生理过程主要是病毒的直接作用和宿主免疫反应损伤（如细胞因子风暴所致的炎性损伤和ROS导致的氧化应激损伤）的结果[2,4]。为了研究感冒安颗粒临床效果的药效物质基础，我们对组方各药味的化学成分进行了文献追踪，发现方中药味含有多种黄酮类成分，如异槲皮苷、芦丁、木樨草素及木樨草苷等[5-9]。而黄酮类成分对流感病毒的作用越来越受到关注[10,11]。异槲皮苷抑制流感病毒A和B的复制，与抗病毒药amantadine或者oseltamivir合用可抑制它们导致的耐药病毒出现[12]。槲皮素与流感病毒A H1N1（A/PR/8/34）的神经酰胺酶的结合与zanamivir相当，体内研究也证实了其抗流感病毒能力，可作为抗甲型H1N1流感的有效先导化合物[13]。Zima研究认为木犀草素及其同源物是强效流感核酸内切酶抑制剂，揭示黄酮类化合物的抗流感作用[14]。鉴于此，本研究在总黄酮含量测定的基础上[15]，采用HPLC-MS/MS方法建立5 种黄酮类成分的定量方法，不仅为制剂质量评价提供方法学，也为进一步研究感冒安颗粒防治流感病毒引起的呼吸道感染机制奠定物质基础。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS仪，配以Triple Quad B.02.01（B2043.12）数据处理软件（美国安捷伦公司）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；DL-720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。1.2 试药
感冒安颗粒（本院院内制剂，批号110418、110704、111025、111121、111130、111221、120131、120201、120207、120214）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，供UV法测定，含量以92.5 %计，批号：100080-200707）；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以93.9 %计，批号：111521-201004）；木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111520-200504）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100081-200406）；异槲皮苷对照品（成都曼斯特生物制品有限公司，纯度>99.0 %，批号：MUST-10021901）；甲醇为色谱纯；甲酸为分析纯；水为蒸馏水。
2. 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素对照品各适量，用甲醇溶解，摇匀，各配制成500 μg/ml的对照品贮备液。分别精密量取5种对照品贮备液适量，稀释成浓度如下：分别含芦丁0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml，金丝桃苷0.002、0.008、0.020、0.032、0.044、0.056、0.080 μg/ml，异槲皮苷0.03、0.10、0.25、0.45、0.65、0.95、2.00 μg/ml，槲皮素0.02、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.70 μg/ml，木犀草素0.012、0.026、0.040、0.054、0.082、0.096、0.200 μg/ml的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备
按已优化的黄酮提取方法进行[15]。取样品约0.5 g，精密称定，置量瓶中，加70 %甲醇35 ml，超声提取30 min，放冷，过滤，滤液加70 %甲醇溶液定容至50 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.2 色谱-质谱条件
色谱条件：采用Kromasil C 18（4.6 mm×150 mm，5 μm，100 Å）色谱柱；甲醇（A）- 0.1 %甲酸（B）作为流动相，按0～20 min，35 % A；20～40 min，45 % A梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾负离子化（ESI−）源：毛细管电压 3.0 kV；气体温度 350 ℃，气体流速 10 L/min，雾化气压 35 psi。多反应模式（MRM）监测。5种黄酮检测的离子对：芦丁m/z 609.1→300.1、金丝桃苷和异槲皮苷m/z 463.0→300.1、槲皮素m/z 301.0→151.0、木犀草素m/z 285.0→132.9。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测限和定量限
采用上述色谱条件，每个待测化合物对照品用70%甲醇溶液进行系列稀释，分别以信噪比（S/N）等于3和10确定各自的检测限和定量限。结果见表1。
表 1 5种黄酮成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限黄酮化合物 线性方程 相关系数
r线性范围
（ng/ml）检测限
（ng/ml）定量限
（ng/ml）芦丁 Y=24 527X–162.17 0.999 7 250~8 000 0.025 0.50 金丝桃苷 Y=34 123X– 1.7381 0.999 1 2~80 0.005 0.01 异槲皮苷 Y=29 935X+1 597.80 0.999 1 30 ~2 000 0.02 0.50 槲皮素 Y=19 667X+370.71 0.999 2 20~700 0.02 0.10 木犀草素 Y=33 076X–177.98 0.999 7 12~200 0.005 0.01 2.3.2 线性范围考察
精密量取“2.1.1”项下配制的5 种黄酮成分的对照品混合溶液，照“2.2”项下进样测定，记录各待测组分的峰面积积分值。横坐标为黄酮成分质量浓度（X，ng/ml），纵坐标为峰面积（Y），进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果见表1，表明5 种黄酮成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验
精密吸取供试品溶液（批号
120131 ），照“2.2”项下操作，进样，连续测定5 次和连续测定5 d，记录各待测组分的峰面积积分值，计算日内、日间RSD。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的日内精密度RSD分别为1.09 %、1.42 %、1.69 %、0.86 %、1.27 %（n=5），日间精密度RSD分别为1.85 %、1.76 %、1.43 %、2.01 %、1.90 %（n=5），表明仪器精密度良好。2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号
120131 ）5 份，各0.5 g，精密称定，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，并进行含量测定。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的含量分别为260.16、1.84、19.76、13.39、3.73 μg/g（n=5），RSD分别为1.51 %、1.73 %、0.90 %、1.44 %、1.68 %（n=5），表明方法的重复性良好。2.3.5 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号120131）9 份，每份约0.5 g，精密称定，各精密加入对照品贮备液适量，使已知样品中加入的相当对照品量分别含芦丁140.00 μg、金丝桃苷0.90 μg、异槲皮苷10.00 μg、槲皮素7.00 μg、木犀草素1.90 μg的各对照品贮备液，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算加样回收率。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的平均加样回收率分别为：102.06%、101.60%、100.63%、102.81%、101.80%（n=9），RSD分别为1.56%、1.93%、0.67%、2.07%、1.84%（n=9）。
2.3.6 样品含量测定
取10 个批号的感冒安颗粒，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算含量，结果见表2。
表 2 不同批号感冒安颗粒含量测定结果（$\bar x $ ±s, n=3）批号 芦丁 金丝桃苷 异槲皮苷 槲皮素 木犀草素 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 110418 479.83±1.99 0.41 0.855±0.004 0.49 20.54±0.25 1.23 14.83±0.05 0.31 3.46±0.06 1.70 110704 198.98±3.01 1.52 0.596±0.006 1.05 11.79±0.20 1.68 15.31±0.13 0.86 4.51±0.01 0.19 111025 32.23±0.26 0.83 0.993±0.012 1.26 13.31±0.00 0.02 6.53±0.04 0.55 5.15±0.08 1.58 111121 69.18±1.03 1.51 0.499±0.006 1.26 13.36±0.21 1.56 8.04±0.14 1.69 5.65±0.07 1.19 111130 67.53±0.27 0.40 0.533±0.008 1.57 13.36±0.21 1.54 7.48±0.12 1.62 5.42±0.06 1.15 111221 275.38±3.61 1.31 0.291±0.002 0.73 11.44±0.02 0.21 15.74±0.02 0.14 6.51±0.02 0.24 120131 264.55±0.51 0.19 1.825±0.012 0.68 20.29±0.04 0.17 13.66±0.02 1.52 3.78±0.01 0.26 120201 239.19±1.55 0.65 0.593±0.010 1.76 18.95±0.06 0.33 18.41±0.21 1.16 3.86±0.03 0.81 120207 109.20±2.14 1.97 0.503±0.004 0.83 18.00±0.21 1.16 6.72±0.08 1.22 4.21±0.02 0.37 120214 108.93±0.59 0.54 0.461±0.002 0.45 17.67±0.10 0.01 6.32±0.08 1.19 4.73±0.01 0.11 3. 讨论
3.1 MS/MS条件的优化
为了获得良好的MS结果，优化了检测的离子模式、碎裂电压、碰撞能量等参数，以获得高灵敏度的分子离子和碎片离子。结果显示，ESI采用负离子模式可使待测的黄酮成分有更高的灵敏度。对照品混合液经产物离子扫描显示，芦丁的主要碎片为m/z：300.1、271.0；金丝桃苷和异槲皮苷的主要碎片为m/z：300.1、270.8；槲皮素的主要碎片为m/z：178.6、151.0、120.9、106.9；木犀草素的主要碎片为m/z：150.9、132.9、106.8。依据定量碎片离子选择原则，从远离母离子、裂解方式稳定、碎片离子有足够的丰度等方面进行考察，最终选择的碎裂电压、碰撞能量和定量离子如表3所示。由于金丝桃苷和异槲皮苷是结构异构体，它们有相同分子离子峰[M-H]− m/z 463，MS/MS图谱中有相同的产物离子峰m/z 300，这两个化合物通过比较两者在HPLC中的保留时间进行定位。
表 3 5种黄酮化合物的质谱检测参数黄酮化合物 母离子 产物离子 碰撞电压
（U/ V）碰撞能量
（U/ eV）芦丁 609.1 300.1 190 38 金丝桃苷 463.0 300.1 170 25 异槲皮苷 463.0 300.1 170 25 槲皮素 301.0 151.0 130 19 木犀草素 285.0 132.9 150 37 3.2 定量方法学验证
采用已优化的测定条件，感冒安颗粒中5 种黄酮类成分通过与各自标准对照品的保留时间和MS谱图的比较得以鉴别和确认，结果见图1。由于金丝桃苷、异槲皮苷和芦丁均是以槲皮素为苷元，结合不同的糖而形成，金丝桃苷与异槲皮苷还具有相同的分子量，它们的保留时间非常相近。采用HPLC-UV或二极管阵列检测的方法专属性不强，待测成分间相互干扰，很难保证测定结果的准确性。而本研究采用MS/MS-MRM模式测定，实现了准确定量的目的。
图 1 感冒安颗粒提取液5 种黄酮成分的MRM色谱图A. 芦丁的MRM色谱图；B.金丝桃苷、异槲皮素的MRM色谱图；C.槲皮素的MRM色谱图；D.木犀草素的MRM色谱图；1.芦丁；2. 金丝桃苷；3.异槲皮苷；4.槲皮素；5.木犀草素3.3 结果分析
本研究采用经优化的超声提取法提取感冒安颗粒中黄酮成分，用所建立的LC-MS/MS方法测定了10 个批号样品，结果显示，每批样品中均为芦丁含量最高，金丝桃苷含量最低；批间样品同种黄酮成分含量存在差异。为了保证感冒安颗粒质量的稳定性，临床疗效的一致性，对其中的主要黄酮成分可以考虑设定最低限度要求。感冒安颗粒是经传统水提醇沉工艺制得的稠膏制粒而成，我们以往的研究表明，制剂中含有大量的酸性成分[16]，工艺提取过程中的高温、偏低的pH值可能导致金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等苷类黄酮化合物发生水解反应。本研究将3种黄酮苷对照品及生产工艺获得的稠膏经2 % HCl溶液在80 ℃水浴加热处理30 min，进行HPLC-MS/MS分析，处理后的稠膏样品中金丝桃苷和芦丁含量降低，异槲皮苷和槲皮素含量增加；在3种黄酮苷对照品水解液中，均有槲皮素产生；除此之外，芦丁对照品溶液水解还出现了异槲皮苷。由此可以推测，感冒安颗粒的制备工艺可能导致黄酮类成分的水解和转化。
本研究采用HPLC-MS/MS同时测定了感冒安颗粒中5 种黄酮类成分的含量，所建立方法的专属性、灵敏度、精密度和准确性均已得到确证，达到了同时测定多种结构相似的黄酮类成分的目的，为其质量标准的建立提供了方法学依据。我们的研究已经证明感冒安颗粒中含有多种酚酸类成分[17]，本研究又测定了其中的黄酮类成分。这些成分可能共同作用于流感病毒在宿主内复制的多环节，或者改善流感病毒对机体的炎性损伤，降低炎性细胞因子表达，改善氧化应激损伤，提高机体的免疫力等，充分发挥其多途径和多靶点作用优势，为其预防和治疗流感病毒所致呼吸道感染性疾病奠定物质基础。
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表 1 参麻颈复颗粒中药对应潜在有效成分个数
编号 中药名称 检索名称 检索拼音名 中药名称缩写 潜在有效成分个数 1 丹参 丹参 DAN SHEN DS 65 2 蒺藜 蒺藜 JI LI JL 30 3 杜仲 杜仲 DU ZHONG DZ 28 4 栀子 栀子 ZHI ZI ZZ 13 5 山茱萸 山茱萸 SHAN ZHU YU SZY 12 6 天麻 天麻 TIAN MA TM 9 7 川芎 川芎 CHUAN XIONG CX 7 8 续断 续断 XU DUAN XD 5 9 陈皮 陈皮 CHEN PI CP 5 10 首乌藤 夜交藤 YE JIAO TENG YJT 5 11 当归 当归 DANG GUI DG 2 12 桑寄生 桑寄生 SANG JI SHENG SJS 2 
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表 2 参麻颈复颗粒中药共有潜在有效成分
编号 共有成分 来源 编号 共有成分 来源 A1 槲皮素 栀子、杜仲、桑寄生 A8 多孔菌素-5-烯-3β-醇 丹参、山茱萸、天麻 A2 β-谷甾醇 栀子、杜仲、山茱萸、续断、当归 A9 京尼平-1-O-龙胆双糖苷 杜仲、栀子 A3 谷甾醇 桑寄生、续断、蒺藜、川芎、陈皮 A10 表儿茶素 杜仲、首乌藤 A4 山柰酚 栀子、杜仲、蒺藜 A11 大黄素甲醚 蒺藜、首乌藤 A5 豆甾醇 栀子、山茱萸、当归 A12 异欧前胡素 丹参、栀子 A6 十八碳-6,9-二烯酸乙酯 栀子、山茱萸、川芎 A13 油酸乙酯 山茱萸、栀子 A7 3-β-羟基亚甲基-苯醌 杜仲、丹参
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表 3 参麻颈复颗粒活性成分对照表
编号 活性成分 口服利用度（%） 类药系数 度值 A1 槲皮素 46.43 0.28 414 A4 山柰酚 41.88 0.24 174 A9 京尼平-1-O-龙胆双糖苷 36.91 0.75 45 TM1 蔗糖 37.17 0.23 38 CP1 柚皮素 59.29 0.21 34 TM3 琥珀酸 31.62 0.23 34 CP4 柠檬苦素 61.67 0.52 33 JL2 大黄素 32.41 0.24 33 JL1 异鼠李素 49.60 0.31 31 SWT1 表儿茶素 48.96 0.24 29 A11 大黄素甲醚 22.29 0.27 28 ZZ5 5-羟基-7-甲氧基-2-（3,4,5-三甲氧基苯基）色酮 51.96 0.41 25 CX1 杨梅酮 40.60 0.51 22 TM7 胡萝卜苷 36.91 0.75 20 JL4 麦黄酮 118.35 0.26 17 DZ11 （E）-3-[4-[（1R，2R）-2-羟基-2-（4-羟基-3-甲氧基-苯基）-1-羟甲基-乙氧基]-3-甲氧基苯基]丙烯醛 56.32 0.36 15 DZ20 报春色素苷 49.81 0.37 15 DZ5 β-胡萝卜素 37.18 0.58 15 DZ15 脱氢二甘醇4，γ'-二-O-β-D-吡喃糖苷 51.44 0.40 13 DZ13 （+）-右旋杜仲树脂酚 87.19 0.62 12 DZ4 40957-99-1 57.20 0.62 12 JL10 4-酮皮诺类 49.60 0.56 12 CP3 二氢川陈皮素 86.90 0.51 11 DZ19 4-[（2S，3R）-5-[（E）-3-羟基p-1烯基]-7-甲氧基-3-羟甲基-2,3-二氢苯并呋喃-2-基]-2-甲氧基苯酚 50.76 0.39 11 ZZ1 西红花酸 35.30 0.26 11 ZZ3 苏丹Ⅲ 84.07 0.59 11 A10 表儿茶素 48.96 0.24 10 TM6 香兰素 52.00 0.33 8 DZ8 AIDS214634 92.43 0.55 7
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