下载:
下载: 
-
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）是一种慢性自身免疫性疾病，在我国的发病率为40～70/10万[1]，是导致女性死亡的十大原因之一。SLE发病机制不明，尚无有效治疗手段。目前主要以激素、环磷酰胺和骁悉等免疫抑制剂为主，但药物引起的股骨头坏死、重症感染等副作用严重影响治疗效果[2]。随着对其免疫病理机制研究的进展，针对免疫紊乱关键环节的调控策略，如生物制剂、血浆置换、干细胞等为SLE的治疗提供了新的视角和理念[3-6]。但是，这些治疗方法仍然存在很多局限性和个体差异。SLE在祖国医学中属“阴阳毒” “蝴蝶丹” “痈证”等。近年来，很多中医药单独或者联合西药治疗SLE取得较好的效果，且副作用少，价格低廉，逐渐受到广大临床医生的认可和患者的接受。但是中医药治疗SLE的确切调节机制和作用环节尚不明确，本文从代谢组学、免疫细胞、淋巴细胞因子和细胞凋亡等多个方面，对中医药治疗SLE机制的研究进行综述，为利用现代化方法探索祖国传统医学治疗SLE的机制研究提供思路。
-
SLE是一种多器官和组织受累的自身免疫性疾病，临床表现多样，目前在现代医学领域尚无疾病亚型的分类。1987年中国卫生部药政局颁布的《系统性红斑狼疮辨证标准》，将SLE辨证分为4种证候，即热毒炽盛、肝肾阴虚、气血瘀滞、脾肾阳虚；1993年《中药新药治疗红斑狼疮的临床研究指导原则》将SLE分为热毒炽热、阴虚内热、肝肾阴虚、瘀热伤肝、脾肾阳虚、风湿热痹6种证候。
SLE的临床表现众多，但是其本质均是肝肾阴虚，进而产生热毒和血瘀。首先肝肾阴虚容易导致患者成为SLE易感人群，热毒和血瘀则可导致多器官和组织的损伤，因此，临床最常见的SLE证候为热毒血瘀阴虚证[7]。此外，中医证型与SLE不同系统受累存在关联，其中热毒炽盛证与神经精神系统、脾肾阳虚证与肾脏系统、瘀热痹阻证与血液和心血管系统、阴虚内热与肺脏系统存在相关性。有人利用气相色谱-质谱联用技术，对不同SLE中医证候类型患者的尿液进行了分析，发现相对于正常对照组，阴虚内热和脾肾阳虚两种证型的SLE患者有4种相同的代谢物（1，2，3-三羧酸环丙烷、柠檬酸三乙酯、甘氨酸和氯苯甲酸）；脾肾阳虚和阴虚内热两种证型的SLE患者有特征代谢物（包括琥珀酸、马尿酸、赤霉酸、9，10-开环胆甾-5，7，10-三烯和2H苯并吡喃），提示三羧酸循环、肠道菌群和糖代谢等通路参与SLE不同证型的病理机制[8]。
体外实验发现，热毒血瘀型SLE患者来源的血清在体外刺激人肾系膜细胞可诱导特异蛋白表达，其中膜联蛋白A2和 A5可作为热毒血瘀证的生物标志物及潜在治疗靶点[9]。自身抗体是SLE诊断的重要指标之一，基于不同自身抗体种类和SLE常见中医证型的关联研究发现：抗核抗体滴度按均值大小排列，依次为热毒炽盛型、阴虚内热型和脾肾阳虚型；抗双链DNA抗体（dsDNA）滴度按阳性率大小排列，依次是脾肾阳虚型、阴虚内热型和热毒炽盛型，其中抗组蛋白抗体阳性率在脾肾阳虚型和热毒炽盛型中存在显著差异[10]。还有研究发现SLE患者的自身抗体谱可以指导SLE中医辨证分型，比如，抗dsDNA抗体和抗U1RNP抗体阳性，多考虑为风湿热痹型，而抗dsDNA抗体和抗核小体抗体阳性，多考虑为脾肾阳虚型[11]。另外，SLE患者的血瘀证与抗心磷脂抗体、补体C3和补体C4等免疫学指标存在相关性，提示自身免疫复合物形成可能是血瘀证的发病机理之一[11]。
-
SLE是一种多器官受累的系统性疾病，患者体内的代谢网络必然发生变化，因此，患者循环系统中代谢物种类、浓度或相对比例都有可能发生改变。代谢组学是一种系统生物学技术，通过对体液及组织中的小分子代谢物的整体组成进行动态的跟踪监测，可以分析机体在环境和病理刺激时内源代谢物的改变，为临床疾病生物标志物探索、疾病分型和疗效评估等研究提供靶标和线索。多数研究显示SLE患者与健康对照组相比，血清代谢物的差异主要集中在脂质和氨基酸。高密度脂蛋白（HDL）降低，低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）升高，均提示SLE患者存在脂质代谢紊乱，而血清氨基酸水平降低和糖酵解中间代谢产物丙酮酸下降则说明SLE患者存在能量代谢紊乱[12]。
解毒祛瘀滋阴方能有效控制SLE的病情进展，研究报道其临床效果显著优于单用糖皮质激素组。在代谢水平上，该中医复方可显著上调二十碳五烯酸的含量，同时显著上调氨基酸生物标志物甘氨酸、苯丙氨酸和色氨酸至正常水平 [13]; 在狼疮小鼠模型的研究中，昆仙胶囊治疗组与对照组比较，其小鼠血清中支链氨基酸、丙氨酸、糖蛋白、 柠檬酸、磷酸胆碱、牛磺酸和葡萄糖含量升高，而酮体、肌酸等含量降低，提示其发挥作用的机制可能与促进机体正常的能量代谢和氧化能力，稳定细胞膜以及抑制细胞的异常凋亡有关[14]。MRL/lps狼疮鼠存在较明显的脂质代谢异常，青蒿-鳖甲药可以有效改善狼疮鼠体内脂质代谢异常，降低血清L-a-溶血卵磷脂水平，减少血栓发生，同时，改善狼疮小鼠急性期的炎症反应，减少其病理损伤[15]。
-
巨噬细胞是机体固有免疫的重要组成细胞，能够通过吞噬凋亡细胞协助清除自身抗原，避免自身免疫反应的发生。巨噬细胞吞噬能力障碍在SLE发病过程中发挥重要作用。体外研究显示植物多糖、柴胡多糖和黑灵芝多糖都能够显著增强巨噬细胞的吞噬能力[16]，可能通过调控固有免疫应答影响SLE的病程。雷公藤多苷能够下调SLE患者树突细胞表面的Toll样受体9（TLR9），进而抑制树突细胞对T细胞的激活作用[17]。
淋巴细胞分化异常和过度激活是SLE的主要病理机制之一，包括T、B淋巴细胞过度活化和炎性细胞因子的异常表达。白藜芦醇能够通过减少干扰素-γ等细胞因子，抑制CD4+T细胞向Th1细胞分化，减轻降植烷（pristane）诱导狼疮鼠的炎症反应[18]。淫羊藿素能够通过转录因子STAT5b调控Foxp3/IL-17α的表达，影响调节性T（Treg）细胞和T辅助17（Th17）细胞的平衡，减轻MRL/lpr狼疮鼠的肾损伤[19]。狼疮颗粒具有补肾化毒的作用。研究发现，和西药组相比，联合狼疮颗粒的中西医结合治疗组的临床疗效更优，能够显著下调血清可溶白细胞介素2受体（sIL-2R）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平[20]。CD229即淋巴细胞信号活化分子家族3(SLAMF3)，是T细胞活化和分化的重要调节分子，能够通过上调CD25，促进CD4+T细胞向具有免疫抑制功能的Treg细胞转化。在MRL/lpr狼疮鼠的研究中也发现解毒祛瘀滋肾方能够通过CD299/CD25轴促进Treg细胞分化来改善SLE病情[21]。另外，研究显示白芍总苷单药能够有效降低小鼠尿蛋白水平，同时降低其外周血单个核细胞中IL-17的mRNA水平，提示白芍总苷也能调控Th17/Treg细胞平衡这一机制发挥作用[22]。基于流式细胞术的分析，进一步证实了白芍总苷能够显著降低MRL/lpr 狼疮鼠外周血Th17细胞的比例，同时增高Treg 细胞的比例[23]。B细胞异常激活产生大量致病性自身抗体是SLE的另一重要免疫病理机制。青蒿素具有免疫调控作用，有望成为SLE的新型治疗药物，目前已进入三期临床试验[24]。在MRL/lpr 狼疮鼠的研究中发现，青蒿素衍生物马来酸蒿薏米胺（SM934）能够显著抑制B细胞TLR7/9的表达，抑制B细胞活化和浆细胞形成，从而降低自身抗体的水平，使狼疮疾病得到有效控制[25]。
-
目前，多数研究证实炎性因子的异常表达参与SLE的发生和发展。SLE患者外周血中IL-2水平较低，但IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-21、TNF和IFN 水平较高。狼疮定具有滋阴、解毒的祛瘀作用。临床研究发现SLE 患者的sIL-2R明显高于健康对照组，且疾病活动度高的患者其表达水平更高，这可能是导致SLE患者血清中IL-2水平较低的原因，狼疮定能够有效降低SLE患者sIL-2R水平，调控细胞免疫功能，使紊乱的免疫内环境趋于平衡[26]。狼疮方具有解毒活血的功效，在慢性移植物抗宿主的小鼠模型研究中发现，狼疮方能够有效减少2型T辅助（Th2）细胞分泌的IL-6和IL-10的水平，同时降低自身抗体水平，从而减轻狼疮肾炎的损伤[27]。中药组方通过养阴清热、凉血活血等功效，有效降低阴虚内热型SLE患者血清中IL-4和IL-10水平，同时增加IL-2水平，以调控Th1/Th2细胞平衡并降低狼疮疾病的活动度[28]。凉血化瘀方能有效降低MRL/lpr狼疮鼠血清中IL-6、IL-17、IL-21和自身抗体的水平[29]。益气养阴方通过活血通络、抗炎消肿、解毒清热等功效，显著降低SLE 患者血清中IL-6、IL-8和TNF-α的水平，有助于SLE患者免疫功能的重建[30]。另有研究发现，与常规西药治疗组相比，联合滋阴降火方（生地黄、赤芍、丹参、防风、百合、青蒿、黄芪）治疗阴虚内热型SLE患者，能够显著降低血清中IL-10 和IL-18的水平并提高临床疗效，不良反应无显著差异[31]。
细胞黏附分子(ICAMs)是一类能够介导免疫细胞与内皮细胞相互作用的糖蛋白分子。研究显示ICAM-1、ICAM-3和p选择素在SLE患者血清中显著高于正常对照组，养阴清热煎通过滋阴凉血、解毒化瘀、补虚泻实等功效，能够显著抑制SLE患者高表达的ICAMs，实现对器官损伤的保护和修复[32]。血管炎是SLE的基本病理机制，血管内皮细胞是直接受损的靶器官。可溶性血栓调节蛋白 、血管假性血友病因子均是由血管内皮细胞合成的糖蛋白，也是血管内皮细胞受损的标志。在自发性狼疮小鼠模型的研究中发现，清养透解方（青蒿、鳖甲、水牛角、生地黄、牡丹皮、玄参）能够有效降低狼疮小鼠血清可溶性血栓调节蛋白、血管假性血友病因子的表达，保护血管内皮，改善肾脏组织慢性炎症的病理改变[33]。
-
活动期SLE患者外周淋巴细胞的凋亡水平显著增高，可能与Fas的高表达有关。芪加真武汤可以通过干扰Fas的表达抑制异常的细胞凋亡，从而实现治疗SLE的功效[34]。采用清热化瘀滋阴方，联合常规激素治疗气阴两虚型SLE患者，相对于常规激素单独治疗组，其外周血单个核细胞的凋亡指标bcl-2、bax、fas、p53和c-myc显著降低，提示清热化瘀滋阴方可通过降低细胞凋亡率来实现对免疫功能的调控[35]。解毒祛瘀滋阴方联合激素治疗相对单用激素治疗能够有效上调CD4和CD8阳性细胞中bcl-2的表达，促使机体紊乱的免疫内环境趋于平衡[36]。在BXSB狼疮小鼠的研究中发现，狼疮静能够显著抑制小鼠脾脏中T、B淋巴细胞的异常凋亡，阻止过量核酸抗原的释放，从而抑制B细胞产生致病性自身抗体，来达到治疗SLE的目的[37]。
细胞焦亡（pyroptosis）是一种新发现的程序性细胞死亡。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3 (NL- RP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 1 (Caspase-1)及 IL-1β 是参与细胞焦亡的重要因子，提示细胞焦亡与炎症反应的发生发展密切相关。滋阴清热方具有滋阴清热、解毒凉血的功效，联合糖皮质激素治疗阴虚内热型SLE患者效果显著，通过狼疮鼠的体内实验研究发现，滋阴清热方能够显著降低细胞焦亡相关因子，可能是其治疗SLE的机制之一[38]。
综上所述，很多中药能够通过多靶点调控机体的免疫和代谢功能，从而实现对SLE病情的改善（表1）。
表 1 中药治疗系统性红斑狼疮的机制和靶点
药名 组成成分 作用机制/靶点 相关分子 单药 柴胡多糖 巨噬细胞 NO、TNF-α、IL-1β、IL-6 黑灵芝多糖 巨噬细胞 TLR4 雷公藤素 树突细胞 TLR9 淫羊藿 Treg/Th17 STAT5b 白芍总苷 Treg/Th17 IL-17 mRNA 青蒿素 B细胞 TLR7/9 复方 青蒿-鳖甲药 青蒿、鳖甲 脂质代谢 L-a-溶血卵磷脂 解毒祛瘀滋阴方 白花蛇草、紫草、赤芍、生地、炙鳖甲 氨基酸代谢 二十碳五烯酸、甘氨酸、
苯丙氨酸、色氨酸细胞凋亡 Bcl-2 清热化瘀滋阴方 麦冬、赤芍、水牛角片、炒白术、连翘、牡丹皮、
紫草、秦艽、青风藤、金银花、白花蛇草细胞凋亡 Bcl-2、bax、fas、p53、c-myc 解毒祛瘀滋肾方 生地黄、炙鳖甲、青蒿、白花蛇草、积雪草、赤芍、
牡丹皮、佛手、升麻、重楼、生甘草Treg CD299、CD25 凉血化瘀方 水牛角、生地黄、赤芍、牡丹皮、制大黄、玄参、知母 细胞因子 IL-6、IL-17、IL-21 益气养阴方 生薏仁、丹皮、芍药、白花蛇草、升麻、水牛角、丹参、青蒿、鳖甲 细胞因子 IL-6、IL-8、TNF-α 养阴清热煎 生地黄、牡丹皮、青蒿、白花蛇草、蛇莓、半枝莲、益母草、丹参 细胞黏附分子 ICAM-1、ICAM-3 滋阴清热方 山茱萸、生地黄、茯苓、泽泻、牡丹皮、青蒿、甘草 细胞凋亡 IL-1β、NLRP3 芪加真武汤 茯苓、白芍、附子、生姜、甘草、黄芪、刺五加 细胞凋亡 fas 中药组方 生地、黄芩、积雪草、川穹、丹参、猫抓草 细胞因子 IL-2、IL-4、IL-10 狼疮静 生地、熟地、丹皮、白花蛇草 细胞凋亡、B细胞 核酸抗原 狼疮定 白花蛇草、赤芍、生地、水牛角等 细胞因子 IL-2 狼疮方 白花蛇草、半枝莲、紫草、丹参、益母草 细胞因子 IL-6、IL-10 狼疮颗粒 生地黄、熟地黄、牡丹皮、白花蛇草 Treg/Th17 sIL-2R、TNF-α 昆仙胶囊 昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子、菟丝子等 能量代谢 支链氨基酸、丙氨酸、糖蛋白、柠檬酸、磷酸胆碱、牛磺酸、葡萄糖 注：NLRP. 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白；IL. 白介素；ICAM. 细胞黏附分子；Treg. 调节性T细胞；Th17. T辅助细胞17；TNF. 肿瘤坏死因子；TLR. Toll 样受体 -
SLE是一种复杂的多器官受累疾病，具有明显的异质性，而中医药的优势在于整体调控和辨证论治。中医理论中的“扶正驱邪”，即达到驱邪而不伤正，有助免疫功能恢复新的平衡；“同病异治”，即同一种疾病根据不同的证型采用不同的治疗方法，有助SLE个体化治疗方案的制定。但目前中医药治疗SLE的基础理论尚不明确，基于生物标志物探索中医药治疗SLE的病理机制，有望为SLE的诊疗提供新的思路和策略。
Research progress of tradition Chinese medicine treatment mechanism of systemic lupus erythematosus based on biomarkers
-
摘要: 系统性红斑狼疮（SLE）是一种多器官受累的自身免疫性疾病，目前基于糖皮质激素和免疫抑制剂的治疗，仍然存在很多局限性和个体差异。近年来，越来越多的研究表明，联合中医药治疗SLE具有疗效好，不良反应低和安全性高等优点。但是，中医药治疗SLE的确切调节机制和作用环节尚不明确，本文从代谢组学、免疫细胞、淋巴细胞因子和细胞凋亡等，对中医药治疗SLE机制的研究进行综述，为利用现代化方法探索祖国传统医学治疗SLE的机制研究提供思路。Abstract: Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with multiple organ involvement. There are still many limitations and individual differences in the treatment based on glucocorticoids and immunosuppressants. In recent years, more and more studies have shown that the combination of traditional Chinese medicine in the treatment of SLE has the advantages of good efficacy, low adverse reactions, and high safety. However, the exact regulatory mechanism and combined traditional Chinese medicine in the treatment of SLE are still unclear. This paper reviews the research on the mechanism of traditional Chinese medicine in the treatment of SLE from metabonomic, immune cells, lymphocyte factors and apoptosis, etc, provides ideas for exploring the mechanism of traditional Chinese medicine in the treatment of SLE with modern methods.
-
Key words:
- biomarkers /
- systemic lupus erythematosus (SLE) /
- traditional Chinese medicine /
- metabonomic /
- immune cells /
- cytokines
-
奥卡西平(oxcarbazepine, OXC)是第二代抗癫痫药物，可用于儿童全面强直-阵挛发作，部分伴或不伴继发性全面发作的一线治疗[1]，其具有与传统的抗癫痫药物（AEDs）如苯妥英钠、卡马西平和丙戊酸钠相同的疗效，但其对肝药酶和自身的诱导作用小，药物间相互作用较少，临床上可用于替代传统的AEDs。OXC是卡马西平（carbamazepine, CBZ）的一种10-酮类衍生物，但两者之间的药动学存在差异，OXC的耐受性好且不良反应少[2]。OXC是无活性的前体药物，在体内经过肝脏内细胞溶质芳基酮还原酶的作用转化为具有药理活性的中间代谢产物单羟基卡马西平（monohydroxy carbamazepine, MHD）[3-4]。国际抗癫痫联盟推荐MHD血清浓度的参考范围为3～35 μg/ml[5]，有研究表明，当血药浓度高于30 μg/ml时，容易发生药物不良反应，且在许多患者中，不良反应间歇性的发生与MHD浓度的波动有关[6]。在临床用药中也发现OXC服药后的药物浓度个体化差异大，年龄、性别、体重、肝肾功能等均会影响MHD的药动学参数[7]，故需要对其血药浓度进行监测。本研究在参考既往研究的基础上[8-12]，对色谱条件进行了优化，并简化了血样处理的过程，建立了HPLC法测定OXC活性代谢产物MHD血药浓度的方法，该方法快速、简单、准确、选择性好、灵敏度高，为临床监测血药浓度、调整给药剂量提供了手段。
1. 仪器与材料
1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；H1850R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科仪器有限公司）；SHB-B95A型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；Discovery DV215CD型分析天平（美国OHAUS公司）；Vortex-5型涡旋混合器（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。
1.2 材料
MHD对照品（美国CATO公司）；内标：奥硝唑（中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈（色谱纯，上海科丰化学试剂有限公司）；空白血浆（医院血库提供）；超纯水（实验室自制）。
2. 实验方法
2.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），预柱为Eclipse XDB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈（80:20，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μl；双波长检测：在192 nm处检测MHD，318 nm处检测奥硝唑。
2.2 溶液及血浆样品的配制
2.2.1 储备液的配制
精密称取MHD对照品10 mg于10 ml的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为1 mg/ml的储备液，置于−20 ℃下保存。
2.2.2 内标工作液的配制
精密称取奥硝唑1.4 mg于10 ml的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为140 μg/ml的内标工作液，置于−20 ℃下保存。
2.2.3 血浆标准曲线和质控样品的配制
分别精密量取适量储备液，用甲醇稀释成20、50、100、200、300、400、500 μg/ml浓度梯度的标准对照溶液。取以上6个标准对照溶液，加入适量空白血浆，得2、5、10、20、30、40、50 μg/ml系列浓度的血浆标准曲线样品。同法配制相应的低、中、高浓度的血浆质控样品（QC），使得MHD对应的浓度分别为5、15、40 μg/ml。
2.3 血浆样品的预处理
取200 μl血浆样品，加入200 μl内标工作液、400 μl甲醇，涡旋混合30 s，10 ℃条件下13 000 r/min离心10 min，取上清液直接进样。
3. 结果
3.1 专属性试验
通过考察6份不同生物来源的空白血浆样品色谱图、空白血浆样品加入MHD对照品和内标的色谱图，以及临床实际用药后的患者血浆样品色谱图，以此反映方法的专属性。由图1可见，在本实验条件下，被测物MHD与内标的色谱峰分离良好，且血浆中的内源性物质不干扰测定。MHD和内标的保留时间分别为9.5 min和6.1 min。
3.2 标准曲线与线性范围
取上述浓度为2、5、10、20、30、40、50 μg/ml的血浆标准曲线样品按“2.3”项下方法处理。经HPLC法分析，以测得OXC的峰面积与内标峰面积之比（Y）作为纵坐标，以血浆MHD浓度（X）为横坐标，得到回归方程为：Y=0.047 1X+0.022 2（r=0.998 6）。线性范围：根据标准曲线，MHD血药浓度在2～50 μg/ml范围内线性关系良好，其定量下限浓度为2 μg/ml。
3.3 日内、日间精密度和准确度
配制定量下限、低、中、高（2、5、15、40 μg/ml）4种浓度的QC样品各6个，按“2.3”项下方法处理后测定，连续测定3 d，以当天的标准曲线计算QC样品的测定浓度，计算日内、日间精密度以及准确度。经测定，MHD的日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，均符合生物样品的测定要求，结果见表1。
表 1 单羟基卡马西平日内、日间精密度和准确度（n=6）理论浓度
（μg/ml）实测浓度
（μg/ml）RSD（%） RE（%） 日内精密度 日间精密度 2 1.85±0.16 8.64 12.21 −3.63 5 4.93±0.24 4.86 7.68 −4.43 15 14.32±0.37 6.86 6.16 −3.11 40 41.80±1.26 3.03 5.33 0.59 3.4 提取回收率
配制低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各6个，按“2.3”项下方法处理。同时另取18份空白血浆，除了不加系列对照品溶液和内标外，按“2.3”项下方法处理，在获得的上清液中加入MHD和内标溶液至相应浓度。进样分析，以每一浓度中2种不同处理方法的峰面积比值计算提取回收率。经测定，本法中MHD的平均提取回收率在89.62%～95.32%之间；内标的平均提取回收率为98.76%，符合生物学样品的分析要求，结果见表2。
表 2 单羟基卡马西平、MHD和内标提取回收率试验结果（n=6）化合物 浓度（μg/ml） 提取回收率（%） MHD 5 89.62±4.82 15 94.67±6.76 40 95.32±4.90 内标 140 98.76±5.92 3.5 稳定性试验
3.5.1 室温稳定性试验
取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各5份，测定即时血药浓度，并在室温条件下放置4 h和10 h后测定样品血药浓度，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品在室温下放置10 h后仍稳定，RSD均小于4.47%，RE值在1.50%～2.98%之间，结果见表3。
表 3 奥卡西平代谢产物单羟基卡马西平稳定性试验结果 (n=5)储存条件 理论浓度（μg/ml） 实测浓度（μg/ml） RSD（%） RE（%） 室温10 h 5 5.15±0.19 3.60 2.98 15 15.39±0.69 4.47 2.62 40 40.60±0.40 0.98 1.50 冻融3次 5 5.47±0.15 2.83 9.41 15 15.79±0.32 2.06 5.24 40 40.75±1.10 2.71 1.86 处理后36 h 5 5.39±0.27 5.09 7.74 15 15.66±0.58 3.70 4.39 40 39.46±1.80 4.57 −1.34 −20 ℃，30 d 5 5.16±0.23 4.39 3.19 15 14.62±0.39 2.64 −2.53 40 40.37±0.58 1.44 0.93 3.5.2 冻融稳定性试验
取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各5份，测定即时血药浓度，并于−20 ℃冰箱中冷冻保存24 h后室温下解冻1 h后测定，反复冻融3次，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品反复冻融3次后仍能保持稳定，RSD均小于2.83%，RE值在1.86%～9.41%之间，结果见表3。
3.5.3 处理后的血浆样品在自动进样器中储存的稳定性试验
取低、中、高3个浓度水平的血浆QC样品（5、15、40 μg/ml）各5份，测定即时血药浓度，然后放置在自动进样器内12 h、36 h后再次测定，求得RSD和RE值。经测定处理后的MHD血浆样品在进样器内放置36 h仍能保持稳定，RSD均小于5.09%，RE值在−1.34%～7.74%之间，结果见表3。
3.5.4 长期稳定性试验
取低、中、高3个浓度水平的血浆质控样品（5、15、40 μg/ml）各5份，测定即时血药浓度，并置于−20 ℃冰箱中冻存30 d后取出解冻后测定，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品在−20 ℃冰箱中冻存30 d后仍能保持稳定，RSD均小于4.39%，RE值在−2.53%～3.19%之间，结果见表3。
4. 讨论
目前，有关MHD的检测方法的文献很多，其中,高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法都有报道，后者虽有灵敏度高、专属性强的特点，但其仪器昂贵，且需专业人员进行操作，很难在大部分的医疗机构普及[13-15]。另外，国内外文献报道中多使用固液萃取法或液液萃取法进行血样的前处理，但这种处理过程相对复杂、耗时，且经济成本较高[11, 16]。本方法采用甲醇沉淀蛋白进行血样的前处理，建立了HPLC法测定人血浆中MHD血药浓度的方法，整个过程操作简单、快速，样品分析时间较短，适用于临床大量样品的连续检测。
文献报道的流动相有乙腈-10 mmol/L磷酸二氢钾溶液（33∶67，V/V）[12]、水-乙腈（65∶35，V/V）[17]、水-甲醇-乙腈（64∶30∶6，V/V/V）[18]等。本方法采用了水-乙腈，按不同的配比进行试验，发现当水-乙腈的比例为80∶20时，色谱峰的峰形、出峰时间及分离度最佳。文献采用卡马西平[17]、苯巴比妥[19]和奥硝唑[20]等作为内标，本研究通过筛选发现奥硝唑的保留时间为6.1 min，不仅与MHD的保留时间相近，又能与其有很好的分离，且其性质稳定，满足内标的要求。
本实验建立的测定人血浆中OXC活性代谢产物MHD的HPLC法，MHD线性回归方程中的r=0.998 6，说明血药浓度在2～50 μg/ml范围内具有良好的线性关系，日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，MHD及内标的平均提取回收率在89.62%～98.76%之间。血浆样品的稳定性试验证明，在室温放置10 h、反复冻融、处理后放置进样器36 h以及低温保存30 d的情况下，样品未见明显降解，仍能保持稳定。本研究建立的HPLC法操作快速简单，精密度、回收率高，稳定性好，专属性强，不受血浆中内源性物质的干扰，结果准确可靠，且灵敏度高，适用于奥卡西平临床血药浓度的监测。
目前癫痫治疗主要以药物治疗为主，奥卡西平是第二代抗癫痫药物，我国诸多癫痫病专家也建议将其作为癫痫部分性发作和全面强直阵挛发作的首选药物[21]。但奥卡西平使用过程中可能出现瘙痒、荨麻疹、血管性水肿等超敏反应，包括Stevens Johnson综合征中毒性表皮坏死松解症[22]等，还可引起低钠血症、头晕、胃肠道不适等不良反应，有文献报道，其疗效及不良反应可能与血药浓度密切相关[23]，因此开展奥卡西平血药浓度的测定，能提高药物治疗的疗效，同时可以有效避免或减少可能产生的药物不良反应，提高癫痫患者服药的依从性。本研究建立了测定人血浆中MHD血药浓度的方法，应用于临床，为临床个体化给药提供依据，值得临床推广使用。
-
表 1 中药治疗系统性红斑狼疮的机制和靶点
药名 组成成分 作用机制/靶点 相关分子 单药 柴胡多糖 巨噬细胞 NO、TNF-α、IL-1β、IL-6 黑灵芝多糖 巨噬细胞 TLR4 雷公藤素 树突细胞 TLR9 淫羊藿 Treg/Th17 STAT5b 白芍总苷 Treg/Th17 IL-17 mRNA 青蒿素 B细胞 TLR7/9 复方 青蒿-鳖甲药 青蒿、鳖甲 脂质代谢 L-a-溶血卵磷脂 解毒祛瘀滋阴方 白花蛇草、紫草、赤芍、生地、炙鳖甲 氨基酸代谢 二十碳五烯酸、甘氨酸、
苯丙氨酸、色氨酸细胞凋亡 Bcl-2 清热化瘀滋阴方 麦冬、赤芍、水牛角片、炒白术、连翘、牡丹皮、
紫草、秦艽、青风藤、金银花、白花蛇草细胞凋亡 Bcl-2、bax、fas、p53、c-myc 解毒祛瘀滋肾方 生地黄、炙鳖甲、青蒿、白花蛇草、积雪草、赤芍、
牡丹皮、佛手、升麻、重楼、生甘草Treg CD299、CD25 凉血化瘀方 水牛角、生地黄、赤芍、牡丹皮、制大黄、玄参、知母 细胞因子 IL-6、IL-17、IL-21 益气养阴方 生薏仁、丹皮、芍药、白花蛇草、升麻、水牛角、丹参、青蒿、鳖甲 细胞因子 IL-6、IL-8、TNF-α 养阴清热煎 生地黄、牡丹皮、青蒿、白花蛇草、蛇莓、半枝莲、益母草、丹参 细胞黏附分子 ICAM-1、ICAM-3 滋阴清热方 山茱萸、生地黄、茯苓、泽泻、牡丹皮、青蒿、甘草 细胞凋亡 IL-1β、NLRP3 芪加真武汤 茯苓、白芍、附子、生姜、甘草、黄芪、刺五加 细胞凋亡 fas 中药组方 生地、黄芩、积雪草、川穹、丹参、猫抓草 细胞因子 IL-2、IL-4、IL-10 狼疮静 生地、熟地、丹皮、白花蛇草 细胞凋亡、B细胞 核酸抗原 狼疮定 白花蛇草、赤芍、生地、水牛角等 细胞因子 IL-2 狼疮方 白花蛇草、半枝莲、紫草、丹参、益母草 细胞因子 IL-6、IL-10 狼疮颗粒 生地黄、熟地黄、牡丹皮、白花蛇草 Treg/Th17 sIL-2R、TNF-α 昆仙胶囊 昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子、菟丝子等 能量代谢 支链氨基酸、丙氨酸、糖蛋白、柠檬酸、磷酸胆碱、牛磺酸、葡萄糖 注：NLRP. 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白；IL. 白介素；ICAM. 细胞黏附分子；Treg. 调节性T细胞；Th17. T辅助细胞17；TNF. 肿瘤坏死因子；TLR. Toll 样受体 
下载: 导出CSV
-
[1] LI M, ZHANG W, LENG X, et al. Chinese SLE Treatment and Research group (CSTAR) registry: I. Major clinical characteristics of Chinese patients with systemic lupus erythematosus[J]. Lupus,2013,22(11):1192-1199. doi: 10.1177/0961203313499086 [2] FELDMAN C H, MARTY F M, WINKELMAYER W C, et al. Comparative rates of serious infections among patients with systemic lupus erythematosus receiving immunosuppressive medications[J]. Arthritis Rheumatol,2017,69(2):387-397. doi: 10.1002/art.39849 [3] MORAND E F, FURIE R, TANAKA Y, et al. Trial of anifrolumab in active systemic lupus erythematosus[J]. N Engl J Med,2020,382(3):211-221. doi: 10.1056/NEJMoa1912196 [4] LEE H K, KIM E Y, KIM H S, et al. Effect of human mesenchymal stem cells on xenogeneic T and B cells isolated from lupus-prone MRL. Faslpr mice[J]. Stem Cells Int,2020,2020:5617192. [5] WANG D D, NIU L Y, FENG X B, et al. Long-term safety of umbilical cord mesenchymal stem cells transplantation for systemic lupus erythematosus: a 6-year follow-up study[J]. Clin Exp Med,2017,17(3):333-340. doi: 10.1007/s10238-016-0427-0 [6] DÖRNER T, FURIE R. Novel paradigms in systemic lupus erythematosus[J]. Lancet,2019,393(10188):2344-2358. doi: 10.1016/S0140-6736(19)30546-X [7] 潘杰. 系统性红斑狼疮中医证型与实验室指标及病变系统的相关性分析[D]. 南京: 南京中医药大学, 2015. [8] 苏励, 姚重华, 茅建春, 等. 风湿病 “同病异治” 病证相关性的代谢组学研究[C] //全国第八届中西医结合风湿病学术会议论文汇编, 广州, 2010: 25-29. [9] 周燕妮, 汤水福. 热毒血瘀型 LN 肾系膜细胞的蛋白质组学研究[C] //中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会2018年学术年会论文摘要汇编, 重庆, 2018: 1421. [10] 刘瑞萍, 朱妮, 李达, 等. 系统性红斑狼疮中医辨证分型与自身抗体谱的关系[J]. 广东医学, 2012, 33(2):273-275. doi: 10.3969/j.issn.1001-9448.2012.02.052 [11] 代荣琴, 潘磊, 杨丽娟. 系统性红斑狼疮患者自身抗体与中医辨证分型的关系[J]. 世界中西医结合杂志, 2016, 11(6):808-811. [12] 欧阳昕, 文锦丽, 彭武建, 等. 应用代谢组学方法构建系统性红斑狼疮诊断模型[J]. 中国现代医学杂志, 2011, 21(23):2878-2881,2885. doi: 10.3969/j.issn.1005-8982.2011.23.015 [13] 闻向晖, 范永升, 温成平. 系统性红斑狼疮证候特征、中医临床疗效及作用机制研究[J]. 浙江中医药大学学报, 2019, 43(10):1108-1113. doi: 10.16466/j.issn1005-5509.2019.10.020 [14] 鲁莹. 昆仙胶囊对MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎代谢组学影响的研究[D]. 广州: 南方医科大学, 2011. [15] 陈娟, 邓军, 周佳, 等. 青蒿-鳖甲药对配伍治疗系统性红斑狼疮小鼠的代谢组学研究[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(5):727-732. doi: 10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.026 [16] 余强. 黑灵芝多糖的免疫调节活性及其作用机制[D]. 南昌: 南昌大学, 2014. [17] 张丽萍. 雷公藤治疗系统性红斑狼疮的临床观察[J]. 中国现代药物应用, 2011, 5(19):85-86. doi: 10.3969/j.issn.1673-9523.2011.19.071 [18] 王卓龙. 白藜芦醇对Pristane诱导狼疮鼠作用研究[D]. 北京: 北京协和医学院, 2012. [19] 廖洁月. 淫羊藿素对系统性红斑狼疮Foxp3/IL17a调控作用与分子机制及其治疗MRL/1pr狼疮鼠的实验研究[D]. 长沙: 中南大学, 2014. [20] 刘喜德, 金实. 狼疮静颗粒对活动性系统性红斑狼疮患者血清可溶性白介素-2受体、肿瘤坏死因子的影响[J]. 中医杂志, 2003, 44(5):360-361. doi: 10.3321/j.issn:1001-1668.2003.05.024 [21] 陈雷鸣, 朱正阳, 范永升, 等. 解毒祛瘀滋肾方对MRL/lpr狼疮小鼠CD4+T细胞CD229/CD25轴的影响[J]. 中华中医药杂志, 2021, 36(4):1873-1877. [22] 郭云龙. 白芍总苷对MRL/lpr狼疮小鼠临床疗效及外周血IL-17、Foxp3 mRNA表达的影响[D]. 广州: 南方医科大学, 2013. [23] 简练. 白芍总苷对系统性红斑狼疮样小鼠的治疗作用及对Th17/Treg细胞免疫失衡的影响[D]. 广州: 南方医科大学, 2013. [24] 常杰, 李忱, 张文. 青蒿、青蒿素及其衍生物治疗系统性红斑狼疮研究现状[J]. 中国中西医结合杂志, 2019, 39(3):377-380. doi: 10.7661/j.cjim.20180521.084 [25] 吴言为. 青蒿素衍生物SM934对系统性红斑狼疮的疗效及作用机制研究[D]. 上海: 中国科学院上海药物研究所, 2016. [26] 温成平, 范永升, 李学铭. 中药狼疮定对系统性红斑狼疮患者血清可溶性白细胞介素-2受体和新喋呤水平的影响[J]. 中国中西医结合杂志, 2001, 21(5):339-341. doi: 10.3321/j.issn:1003-5370.2001.05.006 [27] 梁鸣, 李幼姬, 阳晓, 等. 中药狼疮方对狼疮样小鼠脾细胞体外分泌白细胞介素-6和白细胞介素-10的影响[J]. 中国中西医结合杂志, 2002, 22(5):372-375. doi: 10.3321/j.issn:1003-5370.2002.05.015 [28] 堵建岗, 沈建国, 王卫兰, 等. 中药组方对阴虚内热型系统性红斑狼疮的疗效及对Th1/Th2平衡的调节作用[J]. 中华中医药学刊, 2016, 34(7):1756-1758. doi: 10.13193/j.issn.1673-7717.2016.07.064 [29] 朱震, 余黎, 汪悦. 凉血化瘀方对MRL/lpr小鼠自身抗体及血清白细胞介素-6、17、21表达的影响[J]. 广州中医药大学学报, 2015, 32(6):1055-1058. [30] 田昱平, 彭飞, 陈涛, 等. 益气养阴活血方对系统性红斑狼疮患者血清炎症因子、生活质量及疗效的影响[J]. 广西医科大学学报, 2017, 34(9):1341-1343. [31] 谢晓辉, 杜晨光, 丁培杰, 等. 滋阴降火法对阴虚内热证系统性红斑狼疮患者细胞因子IL-10、IL-18的影响[J]. 实用临床医药杂志, 2017, 21(17):61-63. doi: 10.7619/jcmp.201717018 [32] 陈爱平, 熊佩华, 李福民, 等. 养阴清热煎剂对系统性红斑狼疮患者黏附分子表达及狼疮损伤指数的影响[J]. 中医杂志, 2005, 46(6):433-435. doi: 10.3321/j.issn:1001-1668.2005.06.013 [33] 黄钢花, 刘叶, 陈银环, 等. 清养透解法对自发性红斑狼疮模型小鼠血管损伤因子的影响[J]. 广州中医药大学学报, 2012, 29(5):555-557,611. [34] 陈明, 汤郁, 曾瑜, 等. 芪加真武汤对系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞凋亡及Fas和FasL表达的影响[J]. 中国皮肤性病学杂志, 2005, 19(6):338-340. doi: 10.3969/j.issn.1001-7089.2005.06.007 [35] 胡晓琳. 中药干预对气阴两虚型系统性红斑狼疮PBMC凋亡及相关指标的影响[J]. 新中医, 2015, 47(6):99-101. [36] 温成平, 范永升, 许志良, 等. 解毒祛瘀滋阴药与激素对系统性红斑狼疮T细胞亚群Bcl-2基因表达的干预作用研究[J]. 中国中西医结合肾病杂志, 2006, 7(5):272-274. doi: 10.3969/j.issn.1009-587X.2006.05.008 [37] 刘喜德, 金实. 中药狼疮静颗粒对狼疮性BXSB小鼠脾脏CD4+T、CD19+B细胞凋亡的影响[J]. 中国中西医结合杂志, 2003, 23(9):692-694. doi: 10.3321/j.issn:1003-5370.2003.09.014 [38] 范萍, 梁康礼, 胡小倩, 等. 滋阴清热方对系统性红斑狼疮小鼠细胞焦亡相关因子的影响[J]. 中医杂志, 2017, 58(16):1404-1407. -
