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肾脏移植术是目前终末期肾病最有效的治疗方法，其中免疫抑制剂的使用是影响移植患者长期生存的重要因素之一。如何才能减少免疫抑制剂不良反应的发生、提高免疫抑制效果，临床医师和药师一直在不断探索解决方案。
百令胶囊是一种上市多年的补益中成药，其原料为中药冬虫夏草中分离出的中华束丝孢菌的发酵菌粉，其主要化学成分有虫草生物碱、多糖、氨基酸、麦角甾醇、多种维生素、微量元素及D-甘露醇等，这些成分是补肺肾、益精气等功效[1-2]的物质基础。临床上对虫草制剂保护肾脏的作用研究进行了广泛深入的研究报道，其主要机制为，通过促进细胞外基质降解、抑制氧化应激、调节细胞生长因子、改善脂质代谢、抑制肾组织早期炎症反应和减少肾细胞凋亡等多种途径、多个靶点来抑制肾脏疾病的发生和发展[3-4]。近年来，虫草制剂作为免疫调节剂已被广泛应用于器官移植术后患者的治疗。
本研究回顾性研究分析了60例肾移植受者应用百令胶囊在促进肾功能恢复、减少环孢素A（CsA）和他克莫司（FK506）等免疫抑制剂的用量和毒性、减轻肝功能损害等方面的资料。
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将2018−2020年在联勤保障部队第910医院就诊的60例同种异体肾移植术后患者，在基础免疫抑制剂方案相同的情况下，按是否加用百令胶囊分为两组：对照组35例，男21例，女14例，平均年龄（39.6±8.8）岁，18例服用CsA（瑞士诺华制药公司），17例服用FK506（安斯泰来制药有限公司）；治疗组25例，男15例，女10例，平均年龄（39.2±7.1）岁，12例服用CsA加百令胶囊，13例服用FK506加百令胶囊。
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所有患者均在术后第3天起口服CsA 4.5 mg/（kg·d）或FK506 0.1 mg /（kg·d）；泼尼松自40 mg/d，之后每天递减5 mg至20 mg/d，维持，1年后减为10 mg/d，维持；治疗组术后3 d开始增加口服百令胶囊1 g，tid。所有患者均根据血肌酐（SCr）水平和CsA或FK506的血药浓度进行用药剂量调整。百令胶囊的剂量在1年内基本保持不变。
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患者肾移植术后4周内，每周常规空腹检测2次血、尿常规，肝、肾功能，血药浓度，血清总蛋白（TP）和白蛋白（ALB），血尿酸（UA）等，术后 8~12周期间每周常规空腹检测以上指标至少1次，12~24周期间每2周检测1次上述指标，24~ 48周每4周检测上述指标1次，上述检测均在同一医疗机构内完成。用SCr、尿素氮（BUN）和24 h尿蛋白量（24 h-UPro）、UA、尿红细胞、尿白细胞等指标观察比较肾移植24、48周后的肾功能；用天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、24 h-UPro、总蛋白、ALB和总胆固醇（TC）分别测定肾移植24、48周后的肝功能。并分别进行红细胞计数、白细胞计数、血小板（PLT）计数等血常规检查。
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各组数据以（
$ \bar{x}\pm s $ ）表示，行两组间对应指标的 t检验；两组间对应指标比较行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。 -
两组SCr和BUN比较，差异无统计学意义（P>0.05）；24 h-UPro、UA、尿红细胞、尿白细胞在48周后治疗组显著低于对照组（P<0.05，P<0.01），见表1。
表 1 术后24、48周两组肾功能和尿常规比较（
$ \bar{x}\pm s $ ）组别 例数 时间 SCr（μmol/L） BUN（mmol/L） 24 h-UPro(μg) UA（μmol/L） 尿红细胞 (个/μl) 尿白细胞(个/μl) 对照组 35 24周 98.21±23.46 7.72±2.81 0.18±0.02 455.96±121.17 11.36±3.89 8.72±1.39 35 48周 95.82±28.13 7.88±1.99 0.19±0.02 477.62±98.91 20.46±1.77 9.61±2.97 治疗组 25 24周 97.44±25.25 7.69±2.55 0.18±0.02 403.74±131.23* 11.47±1.33 6.36±1.59 25 48周 96.57±26.17 7.84±2.12 0.17±0.02* 382.57±118.32* 11.83±2.01* 5.39±1.22** * P<0.05，** P<0.01，与对照组比较 -
两组血常规结果显示，血白细胞和红细胞数在肾移植术后的 24周前比较，两组差异无统计学意义，治疗组此两项在肾移植48周后显著高于对照组（P<0.05）；治疗组淋巴细胞数在移植 24~48周后均显著高于对照组（P<0.05），见表2。
表 2 术后24、48周两组血常规比较 （
$ \bar{x}\pm s $ ）组别 例数 时间 白细胞（×1012/L） 红细胞（×1012/L） 淋巴细胞（×109/L） 血小板（×109/L） 对照组 35 24周 7.21±1.45 4.56±1.17 2.49±0.80 211.55±50.42 35 48周 6.82±2.11 4.42±0.91 3.01±0.91 211.34±70.59 治疗组 25 24周 7.04±2.26 4.64±1.29 3.05±1.21* 215.70±66.24 25 48周 7.27±1.17* 4.97±1.12* 3.47±1.08* 206.10±59.84 * P<0.05，与对照组比较 -
治疗组AST、ALT、血总胆红素及血直接胆红素值、TC显著低于对照组（P<0.05，P<0.01）；治疗组TP、血清白蛋白值显著高于对照组（P<0.05），见表3。
表 3 术后24、48周两组肝功能、血清蛋白及胆红素比较（
$ \bar{x}\pm s $ ）组别 例数 时间 肝转氨酶（U/L） 血清蛋白（g/L） 胆红素（μmol/L） 胆固醇（mmol/L） AST ALT TP ALB TBIL DBIL TC 对照组 35 24周 22.42±6.12 27.35±7.08 60.62±14.81 38.19±9.50 14.82±3.61 4.77±1.56 4.62±0.59 35 48周 21.55±5.71 29.69±5.96 63.33±15.44 40.55±6.57 12.71±2.97 4.51±0.96 4.85±0.66 治疗组 25 24周 14.89±6.22* 25.88±6.79 62.07±15.12 40.33±6.99 13.09±2.57 5.01±1.43 4.33±0.71 25 48周 13.92±3.29* 19.8.9±6.1.4* 66.46±18.43* 44.17±8.58* 9.78±2.69** 3.81±1.23* 4.21±0.82* * P<0.05，** P<0.01，与对照组比较 -
治疗组CsA及FK506用量在48周后显著低于对照组（P<0.05），见表4、表5。
表 4 术后1~48周两组免疫抑制剂FK506的用量比较 （
$ \bar{x}\pm s $ ）组别 例数 1周 4周 12周 24周 48周 对照组 17 0.10±0.02 0.10±0.02 0.09±0.03 0.09±0.01 0.08±0.02 治疗组 12 0.10±0.01 0.10±0.03 0.09±0.02 0.08±0.02 0.07±0.01* * P<0.05，与对照组比较 表 5 术后1~48周两组免疫抑制剂CsA的用量比较 (
$ \bar{x}\pm s $ )组别 例数 1周 4周 12周 24周 48周 对照组 18 4.5±0.9 4.5±1.5 4.3±1.2 4.2±1.3 3.5±1.2 治疗组 13 4.5±1.0 4.5±1.1 4.2±1.3 4.0±1.5 3.3±1.1* * P<0.05，与对照组比较 -
CsA是由11个氨基酸组成的环状多肽，是土壤中一种真菌的活性代谢物，英国于1978年首次将其应用于临床肾移植，是一种强效免疫抑制剂。FK506是日本藤泽药品工业株式会社从链霉菌属中分离出来的大环内酯类抗生素，被广泛用于减少或阻断外科移植、移植物抗宿主病以及自身免疫疾病治疗中出现的免疫排斥反应，其作用机制是抑制多种细胞因子，如白细胞介素-2、γ干扰素的产生，阻断T细胞活化，且抑制细胞毒性T细胞的增殖和白细胞介素-2受体的表达，也是肾脏移植患者的首选免疫抑制药物。但二者的缺点是均具有明显的毒副作用，特别是肾毒性对移植肾的长期存活影响较大[5-6]。CsA多见肾小球血栓、肾小管受阻、蛋白尿、管型尿等肾毒性；FK506也存在潜在肾毒性。因此，在临床应用中建议监测包括SCr、肌酐清除率及排尿量等肾功能指标。
在本研究中，肾移植术后患者在用药48周后，治疗组与对照组对SCr、BUN等方面的影响没有统计学差异。而在使用百令胶囊后，患者尿沉渣中红细胞、白细胞、24 h-UPro显著低于未使用者，说明使用百令胶囊者的移植肾脏得到了一定保护，肾炎症状、蛋白尿和低蛋白血症也得到改善；另一方面，用药24周后的治疗组比对照组UA显著减少，提示百令胶囊在预防或者减少肾移植术后发生痛风并发症方面有潜在益处。
本研究进一步提示，两组患者在肾移植术后的前24周内血中红细胞及白细胞比较无统计学差异，这可能是因为在术后早期，大量免疫抑制剂的冲击应用强有效地抑制了机体造血系统的活力，而此时使用百令胶囊在短期内并不能改善免疫抑制剂造成的骨髓抑制反应。但在术后用药48周后，治疗组血中红细胞及白细胞相较于对照组有显著升高的趋势，百令胶囊促进造血功能的长期效果得以体现。从术后用药24周后的淋巴细胞指标来看，治疗组较对照组明显增加，这可能与百令胶囊刺激造血干细胞的产生、分化[7]有关。另有研究表明，天然药物冬虫夏草、冬虫夏草发酵菌及其制剂中均含有虫草多糖、生物碱、腺苷、麦角甾醇、多种氨基酸、多种维生素、D-甘露醇及微量元素等化学成分[8-9]，这些成分中有些是核酸、蛋白质合成的前体，可刺激骨髓造血干细胞的产生，促进其生长、增殖，有利于骨髓造血功能的快速恢复，因此具有显著的促生血作用[10]。另外，百令胶囊中还有一些活性成分，例如，腺苷可以通过对T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK细胞刺激活化从而提高细胞免疫功能，是一种作用较广的免疫增强剂；同时，其对淋巴细胞转化又有一定的促进作用，故具有双向免疫调节效应[11]。另有研究报道，冬虫夏草及其制剂在改善肾脏微循环、减轻尿蛋白等方面也具有良好的治疗效果，在联合西药治疗肾脏疾病过程中可以减少相关并发症的发生，如今在临床上已被广范用于肾脏疾病的保护性治疗[12-13]。
长期的免疫抑制剂如CsA、FK506的使用亦会导致肝功能受损，因此在使用过程中还要严密监测肝功能情况。本研究中，两组患者肝功能比较数据表明，百令胶囊对肾移植术后患者的肝功能恢复有显著改善，如可促进胆红素分泌和排泄，这提示冬虫夏草制剂对肝细胞可能具有保护作用。有研究资料表明，冬虫夏草制剂中维生素与多胺类及其他成分可以清除细胞内的氧自由基，保护细胞免受损伤[5]。核苷酸和核苷能促进肠道正常的发育、成熟和修复，对维持机体正常的免疫功能和肝脏的正常功能也有重要意义[14]。肾移植患者使用百令胶囊还可以减轻其他免疫抑制药物的肝毒性，加快有害物质的清除，减轻肝细胞损伤，并促进受损肝细胞的恢复。本次研究中，治疗组TP、血清白蛋白值显著高于对照组，这可能与冬虫夏草菌粉中含有的多种氨基酸和肽类成分有关，这些成分可促进蛋白质合成，纠正血浆氨基酸紊乱，与巨噬细胞和淋巴细胞转化以及白介素-1生成等免疫抑制作用呈正相关[15]。
两组免疫抑制剂用量比较提示，在肾移植术后前24周内基础免疫抑制剂CsA及FK506的用量无明显差异，在术后的前3个月内，是受者与供者器官的激烈较量期，免疫抑制剂的用量必须用足，两组的用量与基础用量的差异均不是很大，这期间的免疫抑制剂的用量调整也极为谨慎。肾移植48周后，从免疫抑制剂CsA、FK506的用量来看，两组用量均比初始量明显降低，这是根据两种药物的毒副作用监测而进行的剂量调整。两种药物的治疗组均显著少于对照组，这一现象可能是由于百令胶囊在发挥免疫调节作用，但具体机制还有待于进一步研究阐明。
Clinical effect of Bailing capsule on patients after renal transplantation
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摘要:
目的 回顾性分析联勤保障部队第910医院（本院）60例肾移植术后患者服用百令胶囊的临床效果，探讨百令胶囊对肾移植术后患者的肾功能及其他机体系统的影响。 方法 从医院HIS系统抽调2018−2020年于本院就诊的60例同种异体肾移植术后患者用药资料，依照不同的免疫抑制剂给药方案分成2组，分别为对照组35例：霉酚酸酯（MMF）联合环孢素A（CsA）或他克莫司（FK506）；治疗组25例：MMF联合CsA或FK506同时联合百令胶囊。术后检测肝、肾功能，血、尿常规及尿酸等；随访并分别记录1、4、12、24、48周免疫抑制剂CsA和FK506的使用量。 结果 治疗组尿中红细胞数量、白细胞数量、血谷草转氨酶和谷丙转氨酶、血清尿酸、总胆红素、直接胆红素显著少于对照组，而血清总蛋白、白蛋白显著高于对照组；治疗组血红细胞、白细胞数量在肾移植术后12~48周显著高于对照组，淋巴细胞在肾移植术后24~48周显著高于对照组。治疗组CsA或FK506的用量在术后48周之后显著低于对照组。 结论 百令胶囊能有效减轻肾移植术后患者的常见并发症状，并具有减少免疫抑制剂使用量等效果，可作为一种较理想的免疫调节剂用于肾移植术后患者的治疗。 Abstract:Objective To study the effect of Bailing capsule on renal function and other organ systems in 60 patients after renal transplantation in No. 910 Hospital of Joint Logistics Support Force. Methods 60 patients with renal allograft in 2018−2020 were divided into 2 groups according to different immunosuppressive regimens. In the control group, 35 cases were treated with MMF + CsA or FK506; in the treatment group, 25 cases were treated with MMF + CsA or FK506 + Bailing capsule. Blood and urine routine, liver and renal function and uric acid were measured after operation. The dosage of immunosuppressive drugs was recorded in stages at 48 weeks. Results The urinary red and white blood cell counts, blood aspartate transaminase and alanine transaminase, serum uric acid, total bilirubin and direct bilirubin in the treatment group were significantly less than those in the control group, while the serum total protein and albumin were significantly higher than those in the control group. The number of red blood cells and white blood cells in the treatment group was significantly higher than that in the control group at 12-48 weeks after kidney transplantation, and that in the lymphocyte group was significantly higher than that in the control group at 24-48 weeks after kidney transplantation. The dosage of CsA and FK506 in the treatment group was significantly lower than that in the control group after 48 weeks. Conclusion Bailing capsule could protect liver and kidney, stimulate hematopoiesis, improve hypoalbuminemia and reduce the dosage of immunosuppressant, which could be an ideal immunomodulator. -
Key words:
- Bailing capsule /
- tacrolimus /
- cyclosporine A /
- renal transplantation /
- immunoregulation
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流感是一种严重的上呼吸道病毒感染，由于其高毒力和突变率，该病毒仍然是对公众健康的主要威胁。据美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织估计，每年有多达65 万人死于季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。传统中医药预防和治疗流感病毒导致的感染（如呼吸道肺炎和支气管炎）已成为中国临床上常规治疗策略，发挥了独特的医疗优势[2,3]。
感冒安颗粒是由金银花、连翘、板蓝根、拳参、桑叶、紫苏和荆芥等七味中药制成的复方制剂，临床应用30 多年，具有疏散风邪，解表退热功能，其预防和治疗呼吸道感染的作用已得到很好的临床验证，特别是在病毒感染初期的治疗效果尤其显著，但药效物质基础并不清楚。目前，建立了TLC法对方中的板蓝根和连翘两味药材进行特征鉴别；同时对方中各药味的共有成分绿原酸和齐墩果酸也建立了TLC鉴别方法。在含量限度方面，则建立了制剂中连翘酯苷A的HPLC法。尽管这些获批的标准已用于制剂常规质量控制，但尚需进一步进行质量评价，以期更客观、准确地反映感冒安颗粒的临床疗效。
由于中药复方复杂的化学成分，它的药理作用是通过多靶点、多途径而实现的。流感病毒感染的病理生理过程主要是病毒的直接作用和宿主免疫反应损伤（如细胞因子风暴所致的炎性损伤和ROS导致的氧化应激损伤）的结果[2,4]。为了研究感冒安颗粒临床效果的药效物质基础，我们对组方各药味的化学成分进行了文献追踪，发现方中药味含有多种黄酮类成分，如异槲皮苷、芦丁、木樨草素及木樨草苷等[5-9]。而黄酮类成分对流感病毒的作用越来越受到关注[10,11]。异槲皮苷抑制流感病毒A和B的复制，与抗病毒药amantadine或者oseltamivir合用可抑制它们导致的耐药病毒出现[12]。槲皮素与流感病毒A H1N1（A/PR/8/34）的神经酰胺酶的结合与zanamivir相当，体内研究也证实了其抗流感病毒能力，可作为抗甲型H1N1流感的有效先导化合物[13]。Zima研究认为木犀草素及其同源物是强效流感核酸内切酶抑制剂，揭示黄酮类化合物的抗流感作用[14]。鉴于此，本研究在总黄酮含量测定的基础上[15]，采用HPLC-MS/MS方法建立5 种黄酮类成分的定量方法，不仅为制剂质量评价提供方法学，也为进一步研究感冒安颗粒防治流感病毒引起的呼吸道感染机制奠定物质基础。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS仪，配以Triple Quad B.02.01（B2043.12）数据处理软件（美国安捷伦公司）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；DL-720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。1.2 试药
感冒安颗粒（本院院内制剂，批号110418、110704、111025、111121、111130、111221、120131、120201、120207、120214）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，供UV法测定，含量以92.5 %计，批号：100080-200707）；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以93.9 %计，批号：111521-201004）；木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111520-200504）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100081-200406）；异槲皮苷对照品（成都曼斯特生物制品有限公司，纯度>99.0 %，批号：MUST-10021901）；甲醇为色谱纯；甲酸为分析纯；水为蒸馏水。
2. 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素对照品各适量，用甲醇溶解，摇匀，各配制成500 μg/ml的对照品贮备液。分别精密量取5种对照品贮备液适量，稀释成浓度如下：分别含芦丁0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml，金丝桃苷0.002、0.008、0.020、0.032、0.044、0.056、0.080 μg/ml，异槲皮苷0.03、0.10、0.25、0.45、0.65、0.95、2.00 μg/ml，槲皮素0.02、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.70 μg/ml，木犀草素0.012、0.026、0.040、0.054、0.082、0.096、0.200 μg/ml的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备
按已优化的黄酮提取方法进行[15]。取样品约0.5 g，精密称定，置量瓶中，加70 %甲醇35 ml，超声提取30 min，放冷，过滤，滤液加70 %甲醇溶液定容至50 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.2 色谱-质谱条件
色谱条件：采用Kromasil C 18（4.6 mm×150 mm，5 μm，100 Å）色谱柱；甲醇（A）- 0.1 %甲酸（B）作为流动相，按0～20 min，35 % A；20～40 min，45 % A梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾负离子化（ESI−）源：毛细管电压 3.0 kV；气体温度 350 ℃，气体流速 10 L/min，雾化气压 35 psi。多反应模式（MRM）监测。5种黄酮检测的离子对：芦丁m/z 609.1→300.1、金丝桃苷和异槲皮苷m/z 463.0→300.1、槲皮素m/z 301.0→151.0、木犀草素m/z 285.0→132.9。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测限和定量限
采用上述色谱条件，每个待测化合物对照品用70%甲醇溶液进行系列稀释，分别以信噪比（S/N）等于3和10确定各自的检测限和定量限。结果见表1。
表 1 5种黄酮成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限黄酮化合物 线性方程 相关系数
r线性范围
（ng/ml）检测限
（ng/ml）定量限
（ng/ml）芦丁 Y=24 527X–162.17 0.999 7 250~8 000 0.025 0.50 金丝桃苷 Y=34 123X– 1.7381 0.999 1 2~80 0.005 0.01 异槲皮苷 Y=29 935X+1 597.80 0.999 1 30 ~2 000 0.02 0.50 槲皮素 Y=19 667X+370.71 0.999 2 20~700 0.02 0.10 木犀草素 Y=33 076X–177.98 0.999 7 12~200 0.005 0.01 2.3.2 线性范围考察
精密量取“2.1.1”项下配制的5 种黄酮成分的对照品混合溶液，照“2.2”项下进样测定，记录各待测组分的峰面积积分值。横坐标为黄酮成分质量浓度（X，ng/ml），纵坐标为峰面积（Y），进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果见表1，表明5 种黄酮成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验
精密吸取供试品溶液（批号
120131 ），照“2.2”项下操作，进样，连续测定5 次和连续测定5 d，记录各待测组分的峰面积积分值，计算日内、日间RSD。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的日内精密度RSD分别为1.09 %、1.42 %、1.69 %、0.86 %、1.27 %（n=5），日间精密度RSD分别为1.85 %、1.76 %、1.43 %、2.01 %、1.90 %（n=5），表明仪器精密度良好。2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号
120131 ）5 份，各0.5 g，精密称定，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，并进行含量测定。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的含量分别为260.16、1.84、19.76、13.39、3.73 μg/g（n=5），RSD分别为1.51 %、1.73 %、0.90 %、1.44 %、1.68 %（n=5），表明方法的重复性良好。2.3.5 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号120131）9 份，每份约0.5 g，精密称定，各精密加入对照品贮备液适量，使已知样品中加入的相当对照品量分别含芦丁140.00 μg、金丝桃苷0.90 μg、异槲皮苷10.00 μg、槲皮素7.00 μg、木犀草素1.90 μg的各对照品贮备液，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算加样回收率。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的平均加样回收率分别为：102.06%、101.60%、100.63%、102.81%、101.80%（n=9），RSD分别为1.56%、1.93%、0.67%、2.07%、1.84%（n=9）。
2.3.6 样品含量测定
取10 个批号的感冒安颗粒，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算含量，结果见表2。
表 2 不同批号感冒安颗粒含量测定结果（$\bar x $ ±s, n=3）批号 芦丁 金丝桃苷 异槲皮苷 槲皮素 木犀草素 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 110418 479.83±1.99 0.41 0.855±0.004 0.49 20.54±0.25 1.23 14.83±0.05 0.31 3.46±0.06 1.70 110704 198.98±3.01 1.52 0.596±0.006 1.05 11.79±0.20 1.68 15.31±0.13 0.86 4.51±0.01 0.19 111025 32.23±0.26 0.83 0.993±0.012 1.26 13.31±0.00 0.02 6.53±0.04 0.55 5.15±0.08 1.58 111121 69.18±1.03 1.51 0.499±0.006 1.26 13.36±0.21 1.56 8.04±0.14 1.69 5.65±0.07 1.19 111130 67.53±0.27 0.40 0.533±0.008 1.57 13.36±0.21 1.54 7.48±0.12 1.62 5.42±0.06 1.15 111221 275.38±3.61 1.31 0.291±0.002 0.73 11.44±0.02 0.21 15.74±0.02 0.14 6.51±0.02 0.24 120131 264.55±0.51 0.19 1.825±0.012 0.68 20.29±0.04 0.17 13.66±0.02 1.52 3.78±0.01 0.26 120201 239.19±1.55 0.65 0.593±0.010 1.76 18.95±0.06 0.33 18.41±0.21 1.16 3.86±0.03 0.81 120207 109.20±2.14 1.97 0.503±0.004 0.83 18.00±0.21 1.16 6.72±0.08 1.22 4.21±0.02 0.37 120214 108.93±0.59 0.54 0.461±0.002 0.45 17.67±0.10 0.01 6.32±0.08 1.19 4.73±0.01 0.11 3. 讨论
3.1 MS/MS条件的优化
为了获得良好的MS结果，优化了检测的离子模式、碎裂电压、碰撞能量等参数，以获得高灵敏度的分子离子和碎片离子。结果显示，ESI采用负离子模式可使待测的黄酮成分有更高的灵敏度。对照品混合液经产物离子扫描显示，芦丁的主要碎片为m/z：300.1、271.0；金丝桃苷和异槲皮苷的主要碎片为m/z：300.1、270.8；槲皮素的主要碎片为m/z：178.6、151.0、120.9、106.9；木犀草素的主要碎片为m/z：150.9、132.9、106.8。依据定量碎片离子选择原则，从远离母离子、裂解方式稳定、碎片离子有足够的丰度等方面进行考察，最终选择的碎裂电压、碰撞能量和定量离子如表3所示。由于金丝桃苷和异槲皮苷是结构异构体，它们有相同分子离子峰[M-H]− m/z 463，MS/MS图谱中有相同的产物离子峰m/z 300，这两个化合物通过比较两者在HPLC中的保留时间进行定位。
表 3 5种黄酮化合物的质谱检测参数黄酮化合物 母离子 产物离子 碰撞电压
（U/ V）碰撞能量
（U/ eV）芦丁 609.1 300.1 190 38 金丝桃苷 463.0 300.1 170 25 异槲皮苷 463.0 300.1 170 25 槲皮素 301.0 151.0 130 19 木犀草素 285.0 132.9 150 37 3.2 定量方法学验证
采用已优化的测定条件，感冒安颗粒中5 种黄酮类成分通过与各自标准对照品的保留时间和MS谱图的比较得以鉴别和确认，结果见图1。由于金丝桃苷、异槲皮苷和芦丁均是以槲皮素为苷元，结合不同的糖而形成，金丝桃苷与异槲皮苷还具有相同的分子量，它们的保留时间非常相近。采用HPLC-UV或二极管阵列检测的方法专属性不强，待测成分间相互干扰，很难保证测定结果的准确性。而本研究采用MS/MS-MRM模式测定，实现了准确定量的目的。
图 1 感冒安颗粒提取液5 种黄酮成分的MRM色谱图A. 芦丁的MRM色谱图；B.金丝桃苷、异槲皮素的MRM色谱图；C.槲皮素的MRM色谱图；D.木犀草素的MRM色谱图；1.芦丁；2. 金丝桃苷；3.异槲皮苷；4.槲皮素；5.木犀草素3.3 结果分析
本研究采用经优化的超声提取法提取感冒安颗粒中黄酮成分，用所建立的LC-MS/MS方法测定了10 个批号样品，结果显示，每批样品中均为芦丁含量最高，金丝桃苷含量最低；批间样品同种黄酮成分含量存在差异。为了保证感冒安颗粒质量的稳定性，临床疗效的一致性，对其中的主要黄酮成分可以考虑设定最低限度要求。感冒安颗粒是经传统水提醇沉工艺制得的稠膏制粒而成，我们以往的研究表明，制剂中含有大量的酸性成分[16]，工艺提取过程中的高温、偏低的pH值可能导致金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等苷类黄酮化合物发生水解反应。本研究将3种黄酮苷对照品及生产工艺获得的稠膏经2 % HCl溶液在80 ℃水浴加热处理30 min，进行HPLC-MS/MS分析，处理后的稠膏样品中金丝桃苷和芦丁含量降低，异槲皮苷和槲皮素含量增加；在3种黄酮苷对照品水解液中，均有槲皮素产生；除此之外，芦丁对照品溶液水解还出现了异槲皮苷。由此可以推测，感冒安颗粒的制备工艺可能导致黄酮类成分的水解和转化。
本研究采用HPLC-MS/MS同时测定了感冒安颗粒中5 种黄酮类成分的含量，所建立方法的专属性、灵敏度、精密度和准确性均已得到确证，达到了同时测定多种结构相似的黄酮类成分的目的，为其质量标准的建立提供了方法学依据。我们的研究已经证明感冒安颗粒中含有多种酚酸类成分[17]，本研究又测定了其中的黄酮类成分。这些成分可能共同作用于流感病毒在宿主内复制的多环节，或者改善流感病毒对机体的炎性损伤，降低炎性细胞因子表达，改善氧化应激损伤，提高机体的免疫力等，充分发挥其多途径和多靶点作用优势，为其预防和治疗流感病毒所致呼吸道感染性疾病奠定物质基础。
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表 1 术后24、48周两组肾功能和尿常规比较（
$ \bar{x}\pm s $ ）组别 例数 时间 SCr（μmol/L） BUN（mmol/L） 24 h-UPro(μg) UA（μmol/L） 尿红细胞 (个/μl) 尿白细胞(个/μl) 对照组 35 24周 98.21±23.46 7.72±2.81 0.18±0.02 455.96±121.17 11.36±3.89 8.72±1.39 35 48周 95.82±28.13 7.88±1.99 0.19±0.02 477.62±98.91 20.46±1.77 9.61±2.97 治疗组 25 24周 97.44±25.25 7.69±2.55 0.18±0.02 403.74±131.23* 11.47±1.33 6.36±1.59 25 48周 96.57±26.17 7.84±2.12 0.17±0.02* 382.57±118.32* 11.83±2.01* 5.39±1.22** * P<0.05，** P<0.01，与对照组比较 
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表 2 术后24、48周两组血常规比较 （
$ \bar{x}\pm s $ ）组别 例数 时间 白细胞（×1012/L） 红细胞（×1012/L） 淋巴细胞（×109/L） 血小板（×109/L） 对照组 35 24周 7.21±1.45 4.56±1.17 2.49±0.80 211.55±50.42 35 48周 6.82±2.11 4.42±0.91 3.01±0.91 211.34±70.59 治疗组 25 24周 7.04±2.26 4.64±1.29 3.05±1.21* 215.70±66.24 25 48周 7.27±1.17* 4.97±1.12* 3.47±1.08* 206.10±59.84 * P<0.05，与对照组比较
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表 3 术后24、48周两组肝功能、血清蛋白及胆红素比较（
$ \bar{x}\pm s $ ）组别 例数 时间 肝转氨酶（U/L） 血清蛋白（g/L） 胆红素（μmol/L） 胆固醇（mmol/L） AST ALT TP ALB TBIL DBIL TC 对照组 35 24周 22.42±6.12 27.35±7.08 60.62±14.81 38.19±9.50 14.82±3.61 4.77±1.56 4.62±0.59 35 48周 21.55±5.71 29.69±5.96 63.33±15.44 40.55±6.57 12.71±2.97 4.51±0.96 4.85±0.66 治疗组 25 24周 14.89±6.22* 25.88±6.79 62.07±15.12 40.33±6.99 13.09±2.57 5.01±1.43 4.33±0.71 25 48周 13.92±3.29* 19.8.9±6.1.4* 66.46±18.43* 44.17±8.58* 9.78±2.69** 3.81±1.23* 4.21±0.82* * P<0.05，** P<0.01，与对照组比较
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表 4 术后1~48周两组免疫抑制剂FK506的用量比较 （
$ \bar{x}\pm s $ ）组别 例数 1周 4周 12周 24周 48周 对照组 17 0.10±0.02 0.10±0.02 0.09±0.03 0.09±0.01 0.08±0.02 治疗组 12 0.10±0.01 0.10±0.03 0.09±0.02 0.08±0.02 0.07±0.01* * P<0.05，与对照组比较
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表 5 术后1~48周两组免疫抑制剂CsA的用量比较 (
$ \bar{x}\pm s $ )组别 例数 1周 4周 12周 24周 48周 对照组 18 4.5±0.9 4.5±1.5 4.3±1.2 4.2±1.3 3.5±1.2 治疗组 13 4.5±1.0 4.5±1.1 4.2±1.3 4.0±1.5 3.3±1.1* * P<0.05，与对照组比较
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