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放线菌以其能产生结构新颖且有良好生物活性的先导化合物而备受关注[1]，一直被认为是天然药物的重要生产者，其主要结构类型包括聚酮、生物碱、多肽和萜烯类化合物等，同时涵盖了多种多样的生物活性如抗菌、抗寄生虫、免疫调节、抗炎、抗癌等[2-4]，这突显了放线菌具有不可预估的药物开发潜力。
随着研究的深入，陆地和普通环境中的资源日趋枯竭，很多微生物及其次生代谢产物被重复开发和提取分离，发现新活性分子的几率愈来愈低，开发创新药物的难度越来越大[5-6]；而极地极端的生态环境造就的微生物具有产生更为特别的化学骨架和活性次生代谢产物的能力，是新型药源分子的重要来源。本文以采自北极楚克奇海域海绵共附生放线菌Streptomyces sp. LHW11-07为研究对象，从其发酵浸膏中分离鉴定了9个单体化合物1~9（图1），其中化合物1和2为该属内首次分离得到。
图 1 化合物1~9的化学结构
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AMX-600型核磁共振仪（德国Bruker公司）；Xevo G2-XS Q-TOF液质联用仪、1525/2996, 2998型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；半制备型HPLC色谱柱（Atlantis Prep T3，美国Waters公司；YMC C18，日本YMC公司）；中压柱色谱仪（法国Interchim公司）；恒温振荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；N-1000型旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；反相ODS硅胶和Sephadex LH-20柱色谱填料（Pharmacia公司）；正相硅胶（200-300目）和TLC薄层板（烟台江友硅胶开发有限公司）；分析级试剂（上海化学试剂公司）；色谱级试剂（德国Merck公司）；氘代试剂（美国剑桥同位素实验室公司）。
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菌株分离于北极海域来源的海绵样本，经16S rRNA基因序列鉴定为Streptomyces sp.，编号为LHW11-07，菌种保存于上海交通大学医学院附属仁济医院药学部海洋药物研究中心。
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培养基为ISP2：葡萄糖（4 g/L）、酵母提取物（4 g/L）、麦芽糖提取物（10 g/L）以及海盐（25 g/L），加水溶解后调节pH为7.2~7.4，分装后高压灭菌20 min (121 ℃)，冷却备用。
挑取Streptomyces sp. LHW11-07单菌落至1级种子培养基里（100 ml ISP2培养基至250 ml三角瓶），置于30 ℃，220 r/min的恒温摇床培养3 d，得1级种子液；将1级种子液按5%接种量接到2级种子培养基里（150 ml ISP2培养基至500 ml三角瓶），置于30 ℃，220 r/min的恒温摇床培养3 d，得2级种子液；将2级种子液按5%接种量接到大发酵培养基里（700 ml ISP2培养基至2 L三角瓶），置于30 ℃，220 r/min的恒温摇床培养7 d，共得到发酵液50 L。
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菌株培养7 d后，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯提取液，减压浓缩得粗浸膏9.8 g。粗浸膏先经凝胶柱分离，二氯甲烷：甲醇（1∶1）的混合溶剂进行洗脱，得到组份Fr.1~Fr.7。
组份Fr.4经正相中压柱色谱分离（二氯甲烷：甲醇100:0~0:100），得到组份Fr.4a~Fr.4j。组份Fr.4d再经反相中压柱色谱分离（10%~100%乙腈水），得到组份Fr.4d1~Fr.4d8，Fr.4d2和Fr.4d3用反相半制备HPLC纯化（35%甲醇水，YMC C18），分别得到化合物1 (12 mg, tR=26 min)和2 (47.6 mg, tR=30 min)；Fr.4d6用反相半制备HPLC纯化（49%甲醇水，YMC C18），得到化合物3 (8.4 mg, tR=23 min)和4 (2.0 mg, tR=30 min)；组份Fr.4g再经凝胶柱纯化，洗脱剂为正己烷：二氯甲烷：甲醇（4∶5∶1），得到组份Fr.4g1~Fr.4g11，其中Fr.4g3用反相半制备HPLC纯化（25%乙腈水，YMC C18），得到化合物5 (1.2 mg, tR=18 min)。
组份Fr.7经反相中压柱色谱分离（10%~100%乙腈水），得到组份Fr.7A~Fr.7D。组份Fr.7A用反相半制备HPLC纯化（20%乙腈水，YMC C18），得到化合物6 (18 mg, tR=19 min)和7 (3.4 mg, tR=25 min)；组份Fr.7B经正相中压柱分离（石油醚：丙酮100:0~0:100），得到组份Fr.7B1~Fr.7B9，Fr.7B4用反相半制备HPLC纯化（88%乙腈水，Atlantis Prep T3），得到化合物8 (12 mg, tR=23 min)和9 (8.4 mg, tR=26 min)。
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化合物1：淡黄色固体，ESI-MS显示准分子离子峰m/z 372 [M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)显示在低场区有吲哚环的特征信号δH 7.00 (1H, s, H-2)，7.49 (1H, d, J=8.0 Hz, H-4)，7.02 (1H, t, J=7.6 Hz, H-5)，7.05 (1H, t, J=7.6 Hz, H-6)，7.32 (1H, d, J=8.0 Hz, H-7)；4个活泼氢质子信号δH 10.89 (1H, d, J=2.6 Hz, NH-1)，7.83 (1H, d, J=3.0 Hz, NH-10)，7.62 (1H, d, J=3.0 Hz, NH-13)，9.20 (1H, s, OH-19)；4个芳香质子信号δH 6.53 (2H, d, J=8.4 Hz, H-17, H-21)，6.59 (2H, d, J=8.4 Hz, H-18, H-20)，提示分子中有1个对位二取代的苯环；在高场区有两组亚甲基质子信号δH 2.80 (1H, dd, J=14.5, 4.5 Hz, H-8)，2.43 (1H, ov, H-8)，δH 1.83 (1H, dd, J=13.4, 6.9 Hz, H-15)，2.47 (1H, ov, H-15)，两个次甲基质子信号δH 4.01 (1H, m, H-9)，3.95 (1H, m, H-12)。13C-NMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT谱表明其有20个碳信号，2个酮羰基碳δC 166.7，166.2，14个芳香碳，2个亚甲基碳δC 30.0，40.0和2个次甲基碳δC 55.9，55.2。对其碳信号进行归属：δC 118.7 (C-2)、108.9 (C-3)、127.5 (C-3a)、118.4 (C-4)、120.8 (C-5)、124.3 (C-6)、111.3 (C-7)、136.0 (C-7a)、30.0 (C-8)、55.9 (C-9)、166.7 (C-11)、55.2 (C-12)、166.2 (C-14)、40.1 (C-15)、126.4 (C-16)、130.7 (C-17, C-21)、114.9 (C-18, C-20)、156.0 (C-19)。以上数据与文献[7]对比基本一致，故确定为cyclo-(L-Tyr-L-Trp)。
化合物2：淡黄色固体，ESI-MS显示准分子离子峰m/z 274 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)发现其与化合物1一样有吲哚环的特征信号δH 7.09 (1H, s, H-2)，7.52 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4)，6.99 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-5)，7.02 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-6)，7.30 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-7)；3个活泼氨基质子信号δH 10.87 (1H, s, NH-1)，δH 8.30 (1H, m, NH-10)，7.85 (1H, d, J = 2.9 Hz, NH-13)；两组亚甲基质子信号δH 3.21 (1H, m, H-8)，3.13 (1H, m, H-8)，δH 3.65 (1H, m, H-15)，3.05 (1H, m, H-15)，两个次甲基质子信号δH 4.87 (1H, m, H-9)，4.00 (1H, m, H-12)。13C-NMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT谱表明其有14个碳信号，2个酮羰基碳δC 167.2，165.7，8个芳香碳，2个亚甲基碳δC 63.0，30.3和2个次甲基碳δC 57.3，55.5。对其碳信号进行归属：δC 127.6 (C-2)、111.2 (C-3)、136.0 (C-3a)、118.6 (C-4)、120.8 (C-5)、124.0 (C-6)、118.3 (C-7)、109.0 (C-7a)、30.3 (C-8)、57.3 (C-9)、167.2 (C-11)、55.5 (C-12)、165.7 (C-14)、63.0 (C-15)。以上数据与文献[8]对比基本一致，故确定为cyclo-(L-Trp-L-Ser)。
化合物3：白色固体，ESI-MS显示准分子离子峰m/z 261 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)提示有2个活泼氢质子信号δH 7.87 (1H, s, NH-8)，9.22 (1H, s, OH-4’)；1组对位二取代的苯环芳香质子信号δH 7.04 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-2’, H-6’)，6.63 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-3’, H-5’)；2个次甲基质子信号δH 4.24 (1H, t, J = 8.2 Hz, H-6)，4.03 (1H, dd, J = 9.9, 2.9 Hz, H-9)；4组亚甲基质子信号δH 3.42 (1H, m, H-3)，3.24 (1H, m, H-3)，1.73 (2H, m, H2-4)，2.00 (1H, m, H-5)，1.41 (1H, m, H-5)，2.93 (2H, m, H2-10)。13C-NMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT谱表明其有14个碳信号，2个酮羰基碳δC 168.9，165.1，6个芳香碳，2个次甲基碳δC 58.4，56.0以及4个亚甲基碳δC 44.6，34.7，27.8，21.9。对其碳信号进行归属：δC 165.1 (C-1)、44.6 (C-3)、21.9 (C-4)、27.8 (C-5)、58.4 (C-6)、168.9 (C-7)、56.0 (C-9)、34.7 (C-10)、127.0 (C-1’)、130.8 (C-2’, C-6’)、114.8 (C-3’, C-5’)、155.9 (C-4’)。以上数据与文献[9]对比基本一致，故确定为cyclo-(D-Tyr-D-Pro)。
化合物4：白色固体，ESI-MS显示准分子离子峰m/z 311 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)显示3个活泼氢质子信号δH 9.30 (1H, s, OH-11)，7.84 (2H, t, J = 2.9 Hz, NH-1, NH-4)；9个芳香区质子信号：4个归为1组对位二取代苯环δH 6.85 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-9, H-13)，6.65 (2H, t, J = 8.5 Hz, H-10, H-12)，5个归为1组单取代苯环δH 7.20 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-18)，7.04 (2H, d, J = 6.9 Hz, H-16, H-20)，7.28 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-17, H-19)；2组亚甲基质子信号δH 2.58 (1H, dd, J = 13.6, 5.0 Hz, H-7)，2.20 (1H, d, J = 6.5 Hz, H-7)，2.19 (2H, dd, J = 13.6, 6.5 Hz, H2-14)，2个次甲基质子信号δH 3.95 (1H, m, H-3)，3.90 (1H, m, H-6)。13C-NMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT谱显示其有18个碳信号，2个酮羰基碳δC 166.2，166.2，12个芳香碳，2个亚甲基碳δC 40.1，38.5和2个次甲基碳δC 55.7，55.4。对其碳信号进行归属：δC 166.2 (C-2)、55.7 (C-3)、166.3 (C-5)、55.4 (C-6)、40.1 (C-7)、126.5 (C-8)、130.8 (C-9, C-13)、115.0 (C-10, C-12)、156.1 (C-11)、38.5 (C-14)、136.7 (C-15)、129.7 (C-16, C-20)、128.2 (C-17, C-19)、126.4 (C-18)。以上数据与文献[10]对比基本一致，故确定为cyclo-(L-Tyr-L-Phe)。
化合物5：白色固体，ESI-MS显示准分子离子峰m/z 277 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)显示3个活泼氢质子信号δH 9.22 (1H, s, OH-4’)，8.02 (2H, dd, J = 5.6, 2.5 Hz, NH-1, NH-4)；4个芳香质子信号δH 6.90 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-2’, H-6’)，6.64 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-3’, H-5’)，提示分子中有1个对位二取代苯环；3个次甲基质子信号δH 4.06 (1H, q, J = 3.3 Hz, H-3)，3.44 (1H, m, H-6)，1.43 (1H, ov, H-8)，2个亚甲基质子信号δH 1.43 (1H, m, H-7)，1.23 (1H, m, H-7)，2.69 (1H, q, J = 13.6, 4.8 Hz, H-11)，3.01 (1H, q, J = 13.7, 3.7 Hz, H-11)以及2个末端甲基质子信号δH 0.63 (6H, ov, H3-9, H3-10)。13C-NMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT谱显示其有15个碳信号，2个酮羰基碳δC 166.2，167.4，6个芳香碳，2个亚甲基碳δC 43.7，37.7，3个次甲基碳δC 55.7，52.3，21.4以及2个甲基碳δC 22.9，22.8。对其碳信号进行归属：δC 166.2 (C-2)、55.7 (C-3)、167.4 (C-5)、52.3 (C-6)、43.7 (C-7)、21.4 (C-8)、22.9 (C-9)、22.8 (C-10)、37.7 (C-11)、125.8 (C-1’)、131.2 (C-2’, C-6’)、114.8 (C-3’, C-5’)、156.4 (C-4’)。以上数据与文献[11]对比基本一致，故确定为cyclo-(L-Tyr-L-Leu)。
化合物6：白色固体，ESI-MS显示准分子离子峰m/z 259 [M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)显示有2个活泼氢质子信号δH 5.05 (1H, d, J = 4.5 Hz, OH-4)和4.39 (1H, q, J = 4.0 Hz, OH-13)，3个甲基质子信号δH 0.88 (3H, d, J = 6.8 Hz, H3-12)，0.98 (3H, s, H3-14)和δH 1.05 (3H, s, H3-15)，5对亚甲基质子信号δH 2.14 (1H, m, H-3)，1.23 (1H, m, H-3)，1.74 (1H, m, H-9)，1.60 (1H, m, H-9)，1.44 (3H, m, H2-10, H-11)，1.32 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-11)，3.95 (2H, m, H2-13)，3个次甲基质子信号δH 1.68 (1H, m, H-2)，4.57 (1H, m, H-4)，1.77(1H, m, H-8)。13C-NMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT谱共显示有15个碳信号，包括4个季碳δC 52.1，150.1，136.7，39.8；3个次甲基碳δC 35.2，69.8，46.4；5个亚甲基碳δC 42.4，23.8，28.7，36.4，57.1以及3个甲基碳δC 13.7，29.1，24.4。对其碳信号进行归属：δC 52.1 (C-1)、35.2 (C-2)、42.4 (C-3)、68.9 (C-4)、150.1 (C-5)、136.7 (C-6)、39.8 (C-7)、46.4 (C-8)、23.8 (C-9)、28.7 (C-10)、36.4 (C-11)、13.7 (C-12)、57.1 (C-13)、29.1 (C-14)、24.4 (C-15)。以上数据与文献[12]对比基本一致，故确定为albaflavenol B。
化合物7：白色结晶固体，ESI-MS显示准分子离子峰m/z 268 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)可看出其有13个氢信号，包括5个活泼氢质子信号δH 3.56 (2H, m, NH2)，5.49 (1H, s, OH-5’)，5.36 (1H, t, J = 4.9 Hz, OH-2’)和5.23 (1H, s, OH-3’)，4个连氧次甲基质子信号δH 4.56 (1H, s, H-2’)，4.14 (1H, s, H-3’)，3.96 (1H, m, H-4’)和5.90 (1H, d, J = 5.8 Hz, H-1’)，1组亚甲基信号δH 3.66 (2H, m, H2-5’)以及2个低场区的烯氢质子信号δH 8.37 (1H, s, H-8)和8.21 (1H, s, H-2)。13C-NMR (150 MHz, DMSO)显示其共有10个碳信号，结合DEPT谱可推测有3个芳香季碳δC 149.9，119.8，154.3，2个连氮的芳香次甲基碳δC 151.7，138.6，4个次甲基碳δC 87.8，73.5，70.5，85.7，1个亚甲基碳δC 61.5。对其碳信号进行归属：δC 151.7 (C-2)、149.9 (C-4)、119.8 (C-5)、154.3 (C-6)、138.6 (C-8)、87.8 (C-1’)、73.5 (C-2’)、70.5 (C-3’)、85.7 (C-4’)、61.5 (C-5’)。以上数据与文献[13]对比基本吻合，故确定为β-adenosine。
化合物8：绿色无定型固体，ESI-MS显示准分子离子峰m/z 297 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, MeOD)显示有12个氢信号，包括1个活泼氢质子信号δH 8.37 (1H, s, H-11)，1个甲氧基质子信号δH 3.79 (3H, s)，1个甲基质子信号δH 1.25 (3H, d, J = 6.4 Hz, H3-13)，3个低场区的芳香氢质子信号δH 8.31 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4)，6.92 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5)和7.65 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6)，以及2个次甲基质子信号δH 4.74 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-8)和4.40 (1H, m, H-12)，后与文献[14]对比发现其有4个活泼氢质子信号没有显示出来，而根据相关化学位移可确定其是同一个已知化合物。13C-NMR (150 MHz, MeOD)显示有13个碳信号，结合DEPT谱可推测有6个芳香碳δC 123.4，119.4，126.2，128.2，152.5，115.6，2个羰基碳δC 171.8，172.4，而δC 162.1为醛基碳，2个次甲基碳δC 59.4，68.4，1个甲基碳δC 20.5，以及1个甲氧基碳δC 52.9。对其碳信号进行归属：δC 115.6 (C-1)、152.5 (C-2)、128.2 (C-3)、126.2 (C-4)、119.4 (C-5)、123.4 (C-6)、171.8 (C-7)、59.4 (C-8)、172.4 (C-9)、52.9 (C-10)、162.1 (C-11)、68.4 (C-12)、20.5 (C-13)。以上数据与文献[14]对比基本吻合，故确定为N-formylantimyic acid methyl ester。
化合物9：白色粉末状固体，ESI-MS显示准分子离子峰m/z 499 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)显示有19个氢信号：δH 8.20 (1H, s, H-11)，6.82 (1H, s, H-10)，6.32 (1H, dd, J = 10.5, 1.3 Hz, H-3)，5.01 (1H, m, H-7)，2.99 (1H, dd, J = 2.5, 15.8 Hz, H-8)，2.80 (1H, dd, J = 10.3, 15.6 Hz, H-8)，2.58 (1H, m, H-4)，1.66 (1H, m, H-5)，1.65 (3H, s, 2-Me)，1.27 (1H, m, H-6)，1.25 (1H, m, H-5)，1.06 (3H, d, J = 6.5 Hz, 4-Me)和0.95 (3H, d, J = 5.9 Hz, 6-Me)。而13C-NMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT谱显示只有14个碳信号：δC 166.0 (C-1)，126.8 (C-2)，147.4 (C-3)，30.7 (C-4)，37.6 (C-5)，35.1 (C-6)，74.5 (C-7)，24.0 (C-8)，149.4 (C-9)，122.9 (C-10)，151.3 (C-11)，12.7 (2-Me)，21.1 (4-Me)和16.2 (6-Me)，说明这个化合物可能是一个具有对称结构的二聚体，通过与文献[15]中化合物conglobatin A对比后发现两者波谱数据完全吻合，故最终确定为conglobatin A。
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自上世纪发现青霉素以来，微生物中活性次生代谢产物一直是药物先导化合物的重要来源之一，据统计1940年—2019年间，科学家从微生物中开发出293种治疗不同疾病的临床药物[16]。但随着研究的深入，很多微生物及其次生代谢产物存在被重复开发和提取分离的问题，加之多重耐药性的产生，迫使人们需要开拓新的制造药物的微生物来源[5-6]，而其中极地微生物资源是珍贵而特殊的。来自极地海洋等特殊生态环境的生物往往具有比陆地生物更为丰富的代谢途径和功能基因簇，增加了产生结构新颖且功能独特的次生代谢物的可能性。极地生物以微生物和一些能适应极端条件的海洋生物为主，然而与已报道的大量极地微生物相比，鲜有微生物活性天然产物相关研究报道，因此，极地微生物极具研究价值[17-18]。
笔者以一株采自北极海域海绵共附生放线菌Streptomyces sp. LHW11-07为研究对象，从其发酵浸膏中分离得到9个单体化合物1~9，包括环二肽化合物1~5，倍半萜化合物6，核苷类化合物7，以及两个其他结构类型化合物8和9，其中化合物1和2是首次分离于Streptomyces放线菌，而这些化合物的生物活性还有待进一步探究；本研究进一步丰富了该属放线菌的化学多样性，同时，为高值化开发利用极地微生物这一国家战略资源提供了物质基础和理论依据。
据文献报道，化合物1对所测试的病原性细菌和真菌均具有一定的对抗作用[19]，化合物2测试了4种肿瘤细胞均无明显的细胞毒性[20]，化合物3对海胆Strongylocentrotus intermedius胚胎具有细胞毒活性[9]，化合物5具有抗炎活性并对H1N1和RSV病毒有一定的杀伤作用[21]，化合物7作为一种内源性嘌呤核苷，具有降低血压、抑制血小板聚焦、舒张血管、减慢心律等生理活性[22]，而化合物9可抑制癌细胞株的增殖，在体外对Trypanosoma brucei brucei GUTat 3.1表现出抗锥虫体活性等[23]。
Study on the secondary metabolites from a polar marine sponge associated actinomyces Streptomyces sp. LHW11-07
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摘要:
目的 对极地海绵共附生放线菌Streptomyces sp. LHW11-07进行次生代谢产物的研究，以期得到结构新颖且具有良好生物活性的小分子化合物。 方法 综合运用凝胶柱色谱、硅胶柱色谱、反相中压柱色谱和高效液相色谱等分离手段对Streptomyces sp. LHW11-07发酵产物进行分离和纯化，采用质谱、一维、二维核磁共振等现代波谱方法并结合相关文献调研鉴定它们的结构。 结果 从该菌的发酵产物中共分离得到9个单体化合物，分别为cyclo-(L-Tyr-L-Trp) ( 1 )、cyclo-(L-Trp-L-Ser) ( 2 )、cyclo-(D-Tyr-D-Pro) ( 3 )、cyclo-(L-Tyr-L-Phe) ( 4 )、cyclo-(L-Tyr-L-Leu) ( 5 )、albaflavenol B ( 6 )、β-adenosine ( 7 )、N-formylantimyic acid methyl ester ( 8 )和conglobatin A ( 9 )。 结论 化合物 1 和 2 是首次分离于Streptomyces属放线菌。 Abstract:Objective In order to obtain small molecule compounds with novel structure and good biological activity, the secondary metabolites of polar sponge-symbiotic Streptomyces sp. LHW11-07 were studied. Methods The fermentation product of Streptomyces sp. LHW11-07 was isolated and purified by gel column chromatography, silica gel column chromatography, reversed-phase medium pressure column chromatography and high performance liquid chromatography. The structures of the monomeric compound were identified by modern spectroscopic methods such as mass spectrometry, nuclear magnetic resonance and related literature reports. Results A total of nine compounds were isolated from the fermentation of this strain, which were cyclo-(L-Tyr-L-Trp) ( 1 ), cyclo-(L-Trp-L-Ser) ( 2 ), cyclo-(D-Tyr-D-Pro) ( 3 ), cyclo-(L-Tyr-L-Phe) ( 4 ), cyclo-(L-Tyr-L-Leu) ( 5 ), albaflavenol B ( 6 ), β-adenosine ( 7 ), N-formylantimyic acid methyl ester ( 8 ) and conglobatin A ( 9 ). Conclusion Compounds 1 and 2 were isolated from Streptomyces sp. for the first time. -
Key words:
- polar region /
- sponge /
- actinomyces /
- secondary metabolite
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随着我国经济的发展以及居民生活水平的提高，越来越多的人来到高原生活、工作和旅游，但由于高原地区氧分压较低，高原病的发病率呈现逐年上升的趋势[1]。高原脑水肿（HACE）是高原病发生发展过程中最为严重的阶段，其临床表现为头痛、协调丧失、虚弱、意识水平降低[2]，并对机体造成不可逆的损伤。7-羟乙基白杨素（7-hydroxyethyl chrysin，7-HEC）是课题组前期筛选发现并合成的具有自主知识产权的抗高原缺氧化合物[3]，研究发现[4-5]，其对脑缺血再灌注大鼠和模拟高原低压性缺氧致脑组织损伤大鼠均具有明显的保护作用，并能够减轻低压低氧诱导的认知功能损伤[6]，在抗高原缺氧方面表现出优异的活性与前景。因此，本文主要从7-HEC对高原脑水肿的可能作用机制出发，探究其与自噬、周期、凋亡等通路之间的关系，为防治高原脑水肿的可能作用机制奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 动物、试剂与仪器
27只SPF级雄性Wistar大鼠（体重180～200 g），购自联勤保障部队第九四〇医院动物实验科，合格证号：SCXX（军）2012-0029，动物伦理委员会编号：2021KYLL173。
7-HEC由实验室景林临副教授自行合成；MDA、SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所）；CDK2、CDK6、CyclinD1、CyclinE2、PARP、Bax、Bcl-2、P62、LC3B抗体（英国Abcom公司）；BCA蛋白试剂盒（Solarbio公司）；脱脂奶粉（美国BD公司）；Western Bright TM ECL（美国Advansta）。
IEC-Micromax高速离心机（美国ThermoElectron公司）；Tissuelyser快速研磨仪（上海净信科技公司）；BP210S电子天平（赛多利斯有限公司）；HP-8453紫外分光光度计（美国惠普公司）；SpectraMax i3全自动荧光酶标仪（美国Molecular Devices公司）；FLYDWC20-ⅡA大型低压低氧动物实验舱（中航贵州风雷航空军械有限责任公司）。
1.2 动物分组及高原脑水肿模型的建立[7]
将27只SPF级雄性Wistar大鼠适应性饲喂3 d后，随机分为3组，正常对照组、缺氧模型组、7-HEC给药组。给药组连续灌胃7-HEC（350 mg/kg）7 d，对照组和模型组给予等量灭菌注射用水。第四天，模型组和给药组放入大型低压低氧动物实验舱中，以10 m/s速度减压上升至相当于海拔6000 m处，缺氧处理3 d后处死，取脑组织。缺氧处理期间，氧舱温度：8:00～20:00，12 ℃，20:00～次日8:00，2 ℃；动物自由摄食及饮水；给药组继续灌胃给药。
1.3 脑组织氧化应激指标的检测
每组分别取6只大鼠脑组织标本，准确称重后，按质量（g）∶体积（ml）=1∶9 加入生理盐水制成10 %组织匀浆，采用WST-1法检测SOD活性、采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，以上操作均按试剂盒说明书进行。
1.4 蛋白质印迹法测定凋亡、周期、自噬相关蛋白的表达
每组选取3只大鼠脑组织，称重后加入9倍量高效裂解液，使用组织研磨仪进行组织匀浆，于冰上裂解30 min，低温离心后吸取上清匀浆液10 μl，BCA法测蛋白含量，剩余上清与4×上样缓冲液按体积3∶1比例混匀，封口膜封口，95 ℃煮沸10 min进行蛋白变性，取等量蛋白样品上样，采用 SDS-PAGE 进行分离，电泳完成后将蛋白转至PVDF膜上，含5 %脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜。用TBST缓冲液漂洗4次，每次10 min。加入二抗，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤PVDF膜4次，每次10 min。配制ECL发光液，按照A液和B液1∶1进行配制，涂抹发光液，放入ChemiDoc MP Imaging System全能型成像系统进行曝光。用Image J软件对蛋白条带进行灰度值分析。
1.5 统计学分析
实验结果以（
$ \bar x \pm s $ ）表示，采用 SPSS 21.0 软件进行数据分析，选用单因素方差分析法进行组间变量分析，LSD-t 法比较组间差异。以P<0.05表示有显著性差异，以P<0.01表示有极显著性差异。2. 结果
2.1 氧化应激相关指标的测定
大鼠脑组织中氧化应激相关指标MDA与SOD的测定结果如图1所示，与对照组相比，缺氧组大鼠脑组织中MDA含量显著性升高，SOD活力显著性下调（P<0.05），当给予7-HEC时，缺氧组大鼠脑组织中MDA含量下调，SOD活力上调，且差异具有统计学意义（P<0.05）。结果提示，7-HEC可能参与机体氧化应激的调节，起到防护高原脑水肿的效果。
2.2 凋亡相关蛋白的表达
如图2所示，大鼠脑组织中PARP与Bcl-2的蛋白表达在缺氧组下调，给药后显著上调（P<0.01），大鼠脑组织中Bax的蛋白表达在缺氧组上调，给药组显著下调（P<0.01），为进一步探讨Bcl-2与Bax对凋亡的易感性，对Bax/Bcl-2的比例进行比较，结果显示，与对照组相比，缺氧组显著下降，与缺氧组相比，给药组极显著上调（P<0.01）。结果提示，7-HEC可能参与细胞凋亡从而防治高原脑水肿。
图 2 大鼠脑组织中凋亡相关蛋白电泳图及蛋白表达量（$ \bar x \pm s $ ，n=3）#P<0.05，##P<0.01，与对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较2.3 周期相关蛋白的表达
如图3所示，与对照组相比，大鼠脑组织中周期相关蛋白CyclinE2、CyclinD1、CDK6、CDK2的表达在缺氧组均下调（P<0.05）；与缺氧组相比，在给药组中，CyclinE2、CyclinD1、CDK6、CDK2蛋白的表达显著上调（P<0.05）。结果提示，7-HEC可能参与细胞周期调控从而防治高原脑水肿。
图 3 大鼠脑组织中周期相关蛋白电泳图及蛋白表达量（$ \bar x \pm s $ ，n=3）#P<0.05，##P<0.01，与对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较2.4 自噬相关蛋白的表达
如图4所示，大鼠脑组织中P62的蛋白表达在缺氧组极显著上调，给药后显著下调（P<0.01）；与对照组相比，大鼠脑组织中LC3-B的蛋白表达在缺氧组显著下降，与缺氧组相比，给药组极显著上调（P<0.01）。结果提示，7-HEC可能参与细胞自噬过程从而防治高原脑水肿。
图 4 大鼠脑组织中自噬相关蛋白电泳图及蛋白表达量（$ \bar x \pm s $ ，n=3）#P<0.05，##P<0.01，与对照组比较； **P<0.01，与模型组比较3. 讨论
氧化应激是一种有害事件，可导致活性氧大量产生或抗氧化防御功能不足，损害神经血管单元的完整性，造成神经元不可逆死亡，进而血脑屏障破坏形成脑水肿[8]。MDA是脂质过氧化的产物，其含量可以间接反映组织氧化应激的水平，SODs是一类具有催化超氧化物生成过氧化氢的抗氧化酶[9]，可以直接或间接地反映氧化应激的水平。本研究发现，经给药干预后，大鼠脑组织MDA含量显著降低，SOD活力显著提高，表明7-HEC可改善脑水肿大鼠的氧化损伤，从而对脑水肿起到一定的预防作用。
研究表明，缺氧与细胞周期、凋亡、自噬密切相关，细胞周期蛋白表达异常会引发细胞凋亡[10]。细胞周期失调的细胞有机会通过DNA损伤反应的各种机制来阻止DNA修复、细胞周期调节和DDR基因转录。目前研究认为，自噬是另一种DDR机制，它通过促进或防止细胞死亡来应对DNA损伤，从而发挥作用[11]。细胞周期从G1期到S期的调节因子是CDK2蛋白，自噬主要影响细胞周期的G1期和S期，因此自噬与周期也存在密不可分的关系。
细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死亡方式，是一种正常的生理变化。缺氧是细胞凋亡的诱导因子之一，细胞凋亡加剧是低氧环境诱发机体机能损伤的重要途径[12]。其受Bax和Bcl-2控制。Bcl-2蛋白的过表达在动物模型中被证明可以减轻肝和肾的损伤，而Bax的过度表达则可诱导细胞凋亡[13]。本实验的结果表明，缺氧组大鼠脑组织中Bax/Bcl2比值降低，诱导细胞凋亡，加重脑水肿，7-HEC可上调Bax/Bcl2比值，进而抑制细胞凋亡，起到抗高原脑水肿的作用。
细胞周期在细胞增殖和分裂中起着关键作用，其由两类蛋白精确调控，CDKs、cyclin作为关键的周期蛋白。这两类蛋白决定了细胞维持在停滞状态或继续进行细胞周期。细胞周期抑制已被证明可以提供神经保护，减少星形胶质细胞瘢痕形成和微胶质激活，并改善创伤性脑损伤后的运动和认知恢复[14]。在本实验中，缺氧环境可下调周期蛋白的表达，而7-HEC可上调周期蛋白的表达，对高原脑水肿起到一定的预防作用。
缺氧与自噬密切相关。缺氧条件下，会诱导自噬的发生。自噬是一种高度调控的连续过程，它是一种重要的程序性细胞死亡[15]。LC3蛋白与P62蛋白相互作用，是自噬的标志物。P62蛋白通常存在于自噬体中，并在自溶酶体形成时被降解[16]。LC3蛋白是哺乳动物自噬蛋白和自噬小体标记物，LC3B是自噬体标记的四种不同亚型中使用最广泛的一种。自噬受体包括P62等一系列连接泛素化底物和LC3的适配器，自噬体一旦形成，就会经历成熟阶段，然后与溶酶体融合，发生自噬。此外，P62还可调节细胞凋亡，主要通过选择性减少胞质中促凋亡蛋白来减轻细胞死亡，保护机体免受伤害[17]。在本实验中7-HEC可下调P62、上调LC3B的表达，从而促进自噬，保护机体免遭高原脑水肿损害。
凋亡、自噬、周期三种生物过程相互联系，相互影响，作用于机体，保障机体的正常运行。凋亡、自噬、周期相关因子的变化又会影响氧化应激通路的发生发展。在本实验中，7-HEC降低大鼠脑组织中MDA含量，上调SOD含量，从而抑制HACE引发的氧化应激；其还可上调周期和自噬蛋白的表达，从而增强大鼠脑神经元细胞的增殖活性，加速损伤细胞的自噬，保护机体免受HACE的损害。综上，7-HEC可抑制细胞凋亡和周期，增强自噬，进而抑制机体氧化应激，从而达到防护高原脑水肿的作用。
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