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心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。心脑血管疾病是一种严重威胁人类健康的常见病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。这种疾病也对我国人民的健康和医疗卫生事业的发展带来了巨大的挑战。而在心脑血管疾病中，又以缺血性心脏病和缺血性脑卒中最为常见[1-3]。
黄酮类化合物（flavonoids）是一类广泛存在于自然界植物中的次生代谢产物。是一种以黄酮(2-苯基色原酮)为母核而衍生的一类黄色色素，其中包括黄酮的同分异构体及其氢化和还原产物[4]。它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用。本文将对目前黄酮类化合物抗心脑血管疾病的作用研究进展作一综述。
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早在1938年，Szent-Gyorgyi等研究发现来自于柠檬的黄酮类化合物橘皮苷具有强化毛细血管的作用，该项功能将有助于改善心脏微循环的水平，从而产生保护作用[5]。此后，一项名为Zutphen Elderly Study的流行病学研究探讨了膳食类黄酮摄取量与冠心病风险之间的相关性。该研究对65岁至84岁的老年男性黄酮类摄取量进行了统计，结果显示膳食类黄酮摄取量与冠心病引起的死亡之间呈明显负相关，同时与心梗发病率之间也呈弱负相关 [6]。在欧洲，荷兰科学家对黄酮醇类和黄酮类摄入量与冠心病死亡率和中风发生率之间做了分析，结果显示摄入量大于30 mg/d者两种疾病的发病风险仅为摄入量最低者的三分之一，且该项调查已排除了高胆固醇、高血压、饮酒、吸烟等心脑血管疾病常见危险因素的影响。而另一项针对饮茶人群的研究表明茶叶中富含的茶叶类黄酮可以很好地预防缺血性心脏病的发生 [7]。这些研究均提示我们黄酮类物质可能发挥较强的抗氧化作用，从而降低冠心病的发病率和死亡率。
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与心肌缺血类似，缺血性脑卒中同样严重威胁人类的生命健康。而与心肌缺血不同的是，损伤部位是人类神经行为的中枢—脑组织，因此，临床表现更为复杂。黄酮类化合物作为一种常见且重要的中药成分被较多的实验证明其具有抗缺血性脑卒中的作用。
研究表明从中药灯盏细辛中提取出来的黄酮类活性成分灯盏花素可以起到抗脑缺血的作用，其作用主要通过改善血液流变学、缩小脑组织梗死面积以及减少脑海马区域细胞凋亡数来实现[8-9]。此外，本课题组从传统中药中提取出来的黄酮类活性成分菸花苷，在实验中被证明同样具有确切的保护脑缺血损伤的作用。实验中急性脑缺血的大鼠在注射菸花苷后其生存率较对照组有大幅提升，同时缺血梗死面积显著缩小[10-11]，在各个时间点对给药组和对照组进行神经行为学评价如mNSS评分、提尾实验等，发现注射菸花苷的大鼠其行为学得分逐渐降低，提示神经功能逐渐趋向好转。此外，该实验还对各组大鼠脑电图和脑组织含水量进行了测定，结果表明，给予菸花苷治疗的大鼠脑电图消失的时间显著延长，同时其脑组织含水量显著降低，改善了脑水肿情况 [12]。证实了菸花苷对动物的实验性脑梗塞及缺血后再灌注引起的组织损伤有明显的预防和治疗作用。
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研究发现，缺血性心脏病和缺血性脑卒中的病理机制类似，可以归纳为氧化性损伤、钙超载、炎症反应、细胞凋亡及血小板凝集、自噬等。这几种因素之间相互作用，相互影响，形成多个复杂的调控网络，从而造成一系列病理级联反应。而黄酮类化合物可以通过对上述各因素的抑制作用来保护损伤的心肌组织和脑组织。
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现代医学研究表明，在心肌缺血发生时，人体内会产生较多的氧自由基，同时机体清除氧自由基的能力下降，使得堆积的氧自由基在心肌细胞中发生过氧化反应，从而破坏心肌细胞的结构和功能，导致心肌缺血进一步加重[13]。研究发现，超氧化物酶（SOD）作为生物体内清除自由基的首要物质，可减弱氧自由基对细胞造成的损伤，同时还具有修复受损细胞的功能，其活性高低可反映机体清除自由基能力的大小[14]；丙二醛（MDA）则作为脂质过氧化物反应的产物，常被用于评价机体氧化应激损伤的严重程度[15]；一氧化氮（NO）是我们熟知的生物体内反应极强的自由基，在机体发生心肌缺血时，该物质在血清中的水平明显下降。实验表明，葡萄籽中富含的原花色素可以有效地清除自由基，从而稳定心肌细胞膜，对心肌产生保护作用[16-17]。另一项研究以异丙肾上腺素作为诱导的急性心肌缺血大鼠为模型，探索了布渣叶总黄酮对心肌缺血的作用，结果显示，布渣叶总黄酮可明显降低大鼠血清中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）以及心肌组织中MDA的含量，同时心肌组织中SOD和NO的活性也得到提高[18]。揭示了黄酮类化合物通过抗氧化作用来产生保护心肌组织的作用。
近年来，氧化应激学说同样也在脑缺血性疾病中被广泛研究。该机制不仅可以直接造成细胞破坏，使脑细胞坏死，还可以通过介导线粒体途径，神经细胞膜结构以及DNA修复酶和转录因子等间接地导致脑细胞凋亡。研究发现，注射天然黄酮类化合物木犀草素的脑缺血大鼠SOD、过氧化氢酶（CAT）活性相较于对照组明显提升，而MDA的含量则显著降低，该结果提示我们木犀草素可以加强机体清除氧自由基的能力，从而产生脑保护作用[19]。而在另一项体外研究中，中药黄芩中的黄酮类化合物黄芩苷可以抑制外源性和内源性过氧亚硝基阴离子诱导的神经毒性作用，保护人源神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）神经细胞系[20]。同时，从传统中药红花中提取出来的黄酮类成分菸花苷，也在此前的实验中被证实可以显著降低脑组织中MDA的含量，提高SOD活性[12]。以上结果表明，黄酮类化合物发挥抗心肌缺血及脑缺血的作用与提高机体抗氧化应激的能力有密切的关系。
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炎症反应广泛地存在于各种疾病的病理机制中，其主要通过致炎因子和炎性介质来介导一系列的链式反应。当炎症反应发生在缺血的心肌细胞时，会进一步加剧细胞的缺血和缺氧 [21]。在炎症反应中，具有代表性的重要炎症因子有白介素家族，如IL-1β、IL-6以及肿瘤坏死因子(TNF-α)等，这些炎症因子多出现在炎症反应通路的下游，直接影响并加剧炎症反应的发生和发展。而另一种重要的转录因子Kappa-B（NF-κB），作为一种氧化还原敏感因子在炎症反应中同样扮演了重要的角色，其介导的一系列炎症因子如上述的白介素家族、趋化因子、炎性小体等在心肌细胞缺血损伤中起到重要的作用[22-24]。以往的研究表明，香青兰总黄酮可以抑制心肌缺血大鼠心肌组织中的炎症因子白介素IL-1、IL-6和TNF-α的水平，使炎症因子减少释放，从而降低心肌组织中中性粒细胞的浸润，以达到保护心肌的作用[25]。另一项研究也发现，银杏黄酮同样可以抑制心肌组织中中性粒细胞的浸润，其作用主要通过下调NF-κB和细胞间黏附因子-1（ICAM-1）的表达来实现[26]。
与此类似，在机体发生缺血性脑卒中的时候，各类炎症因子依然扮演了重要的角色。研究发现，灯盏细辛在治疗脑梗死时可以显著降低TNF-α、IL-6的含量，从而减轻炎症反应[27]。在另一项对黄酮类化合物山奈酚的研究中发现，其抗炎作用已在细胞层面得到了证实。它可降低促炎因子的产生和mRNA表达，如胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）、IL-8等[28]，此外，在以PC12细胞作为研究对象的体外实验中，人们发现加入山奈酚处理后，该组细胞的炎性相关蛋白环氧化酶（COX2），诱导型一氧化氮合酶（iNOS）以及核因子NF-κB水平明显下调，且细胞活力随着的山奈酚的浓度增加而逐步增长；进一步的检测发现，对照组的磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶（P38-MAPK）表达升高，而山奈酚组表达降低，而当加入P38-MAPK抑制剂后发现对照组的炎性相关蛋白水平降低[29]，该结果提示我们黄酮类化合物山奈酚可以通过抑制P38-MAPK信号通路来对抗机体病理性炎症反应[30]，进而产生脑细胞保护作用。由此可见，黄酮类化合物主要通过影响炎症因子的表达和释放来发挥抗炎的作用。
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细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，是机体为了维持内环境稳定，通过基因控制的细胞自主而有序的死亡，涉及了一系列的基因激活、表达以及调控作用，与各种信号通路、免疫应答以及上述提到的炎症反应有着密不可分的联系。细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的重要病理机制之一。目前与细胞凋亡相关的基因有Bcl-2家族，Caspase家族等，相关通路有NF-κB信号通路、丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路等。这些基因同时参与了细胞凋亡的诱发和抑制。在一项研究中发现，我国瑶族传统草药成分铜钻总黄酮可以明显降低已形成心肌缺血再灌注损伤的大鼠心肌组织中Bax蛋白的表达，该蛋白可以促进细胞凋亡，同时实验还发现铜钻总黄酮还可以升高抗凋亡的Bcl-2蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡，避免心肌缺血再灌注损伤的进一步加重[31]。在另一项研究中，科研人员发现来源于印度崖豆的黄酮类化合物不仅可以降低Bax蛋白的表达，升高Bcl-2蛋白的表达，还可以提升心肌组织中结构氮氧化合成酶（cNOS）的活性，同时抑制诱生型一氧化氮合酶（iNOS）活性，从而显著改善心肌缺血再灌注大鼠的心肌组织病理学形态，其实验组的心肌细胞形态、结构和排列较之对照组更为完整和规律[32]。同时在MAPK信号通路中c-Jun氨基末端激酶（JNK）和P38蛋白激酶可促进细胞的凋亡。研究发现玫瑰中黄酮类化合物可显著下调大鼠心肌组织中磷酸化JNK和P38的表达，从而抑制心肌细胞的凋亡 [33]。而另一条重要的信号转导通路PI3K/AKT在细胞的增殖、凋亡、代谢中也发挥了重要的生物学作用，其可抑制细胞凋亡的进程[34]。其中活化的AKT进入细胞质与细胞核后，可以调节Caspase家族中Caspase-3的表达，同时还可以调节内皮型一氧化氮（eNOS）以及抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax的表达[35-36]。实验发现，玉郎伞查尔酮可以激活PI3K/AKT信号通路，抑制大鼠心肌细胞的凋亡，从而产生抗心肌缺血的作用[37]。此外，有研究表明黄芩茎叶总黄酮可以降低发生心肌缺血再灌注损伤的大鼠心肌细胞的凋亡率，其作用可能与降低Caspase-3基因mRNA和蛋白表达有关[38-39]。
细胞凋亡同时也是缺血性脑卒中发生发展的一个重要病理机制。临床研究发现，认知障碍是缺血性脑卒中发病后的一项重要并发症，它严重影响患者的预后和生活质量。因此，大脑中负责学习记忆和认知的海马区成为了科学家们重点关注的对象。其中CA1区的神经元对脑缺血缺氧较为敏感，容易受到损伤，而CA3区及DG区的神经元则相对耐受[40]。尼氏体是神经元胞体和树突内的嗜碱性颗粒或小斑块，由游离的核糖体和粗面内质网构成，对缺血变化非常敏锐[41]。课题组在对黄酮类化合物菸花苷的一项研究中发现，缺血再灌注的大鼠海马区神经元大小不一，胞质不规则淡染，胞核皱缩变形，部分细胞脱失明显，CA1区锥体细胞和 DG区的颗粒细胞排列松散，CA3区锥体细胞排列散乱，表明大鼠发生急性脑缺血再灌注损伤后神经细胞受损严重，与之相比，使用菸花苷处理的MCAO大鼠神经元虽也出现了细胞淡染，大小不均，部分胞体肿胀，CA1区及DG区排列稍显混乱，但整体的形态接近正常，病理损伤明显减轻。同时，在尼氏体方面，模型组整体淡染，皮层的尼氏体大大减少，海马区尼氏体极少，表明造模后神经元功能受到损伤。与模型组相比，菸花苷组皮层尼氏体数目更多，个体更大，染色较均匀，海马区尼氏体虽多为颗粒状，个体稍小，但数目明显增多，说明神经元蛋白合成有所增加，较为活跃[42]。因此，我们可以得出结论，菸花苷通过促进神经元蛋白的合成，抑制神经细胞的凋亡，保持神经元的活性来提高机体抗脑缺血的功能。同样，黄芩苷在用于脑缺血动物模型时，也可以明显改善实验动物的认识记忆能力[43]，还通过下调促凋亡基因Bax的表达，下调Bax/Bcl-2的比值，降低COX-2的表达来抑制神经细胞凋亡[44]。以上研究表明，黄酮类化合物通过抑制细胞凋亡来进一步保护心脑组织免受缺血再灌注的损伤。
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研究发现，当心肌发生缺血时，心肌细胞线粒体中Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性下降，使线粒体对钙离子的摄入减少，同时包浆内的钠离子含量升高，造成Na+ -Ca2+交换增加，从而发生钙超载 ，加重心肌缺血的临床症状[45]。研究发现，玉郎伞黄酮能够提高心肌组织中的Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性，减轻细胞内钙离子超载的程度，改善缺血再灌注造成的心肌损伤[46]；从传统中药香青兰中提取的香青兰总黄酮也可以提高心肌组织中的ATP酶含量，保持线粒体的活性和结构完整性，使其功能得到发挥，从而抑制钙超载的发生[47]。
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在正常的生理状态下，血栓素花生四烯酸（TXA2）与环前列腺素（PGI2）处于一种相对平衡的状态。而在心肌受到缺血再灌注损伤后，该平衡即被打破。此时，心肌内皮细胞受损，导致PGI2合成减少而TXA2作用增强，进一步引起血小板大量聚集，从而加重心肌缺血的程度。研究表明，黄酮类化合物可以发挥抗血小板聚集的作用。如从黄顶茜草中分离出的硫酸黄酮能够阻断TXA2受体而发挥抗血小板凝集的作用 [48]。同样的，白桂芦苇中的黄酮类化合物也可以抑制血小板的聚集，从而起到保护心肌的作用[49]。上述现象的发生机制可能与黄酮类化合物抑制环氧合酶，提高血小板环磷酸腺苷（cAMP）合成，阻断TXA2受体，提高PGI2水平有着直接的联系。
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自噬是近几年科学界的一个研究热点，其因开启细胞循环自身物质的新纪元而备受全世界的关注 [50-52]。自噬根据发生过程分为三类：巨自噬，微自噬，分子伴侣介导的自噬。目前研究一般集中于巨自噬，其一般过程为：自噬前体的形成，自噬前体延长包裹底物形成自噬小体，自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体最终降解[53-55]。在脑卒中的发生过程中，自噬起到了关键的保护作用。课题组在MCAO大鼠模型中发现菸花苷可以增加大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗带的自噬小体数目，增强LC3的表达，提高活性形式 LC3-II 在LC3表达中所占的比例，增强参与吞噬泡形成的重要相关蛋白 BECN1 蛋白的表达，降低参与自噬溶酶体降解的重要蛋白 SQSTM1 蛋白的表达，降低自噬相关通路雷帕霉素靶蛋白依赖性途径中关键蛋白 phospho-mTOR 的表达，上调 BECN1、Atg7 mRNA 的表达，下调SQSTM1mRNA的表达。由此可知，菸花苷对大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗带的自噬水平有促进作用。同时在体外，在人源神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）细胞株上建立模拟体内缺血再灌注的缺复氧模型，结果显示，菸花苷同样可以增加SH-SY5Y细胞内自噬小体的生成，增加LC3的表达，提高自噬体膜标志性蛋白LC3-II表达含量，增强BECN1蛋白的表达，降低SQSTM1蛋白的表达，增强促进细胞内自噬流的进程[42, 56]。由此可知，黄酮类化合物菸花苷可通过自噬来发挥神经保护作用。
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黄酮类化合物作为一种常见的天然化合物，存在于自然界的许多植物以及传统中药中。随着科学技术的进步，人们发现这类化合物具有诸多的生物活性，而其强大的药理作用也屡见报道。如降低血管的脆性，改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，防治老年高血压、脑溢血、冠心病、心绞痛、扩张冠状血管，增加冠脉流量等。在这些药理作用中，其抗心脑缺血的作用对于临床上治疗和预防相关疾病显得尤为重要。在上文中，我们列举了许多不同种类的黄酮类化合物在心脑血管疾病中的作用，这些活性成分有的可以直接通过改善血管通透性、缩小梗死组织面积来保护心脑血管组织，有的则通过分子信号通路来产生保护作用。随着研究的推进，它们的作用机制也进一步地得到阐释。可以肯定的是，黄酮类化合物能够为人类治疗和预防心脑血管疾病提供新的治疗思路。当然目前很多实验仅涉及到分子机制中的某个环节，而对于完整的调控过程，精准的作用靶点还有待研究发现。只有通过这一系列系统科学的研究，才能够更好地为心脑血管疾病的治疗提供理论依据，从而进一步在临床得到广泛的应用。
Research progress of the effect of flavonoids on cardiovascular and cerebrovascular ischemic diseases
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摘要: 黄酮类化合物是一种广泛存在于传统中药中的次生代谢产物，拥有许多生物活性和药理作用。近年来，研究发现黄酮类化合物可以通过多种途径在缺血性脑卒中和缺血性心脏病的治疗中发挥有效的保护作用，同时对于其保护作用的机制也有了较为详细系统的阐释。比如黄酮类化合物可以在抗氧化、抑制炎症反应、细胞凋亡和自噬等病理生理机制中发挥有效作用。本文通过查阅国内外的相关文献，对黄酮类化合物抗心脑血管缺血性疾病的保护作用及其机制进行综述。旨在为抗心脑血管疾病药物的研究开发提供参考。Abstract: Flavonoids are secondary metabolites that widely existing in traditional Chinese medicine. They have many biological activities and pharmacological effects. In recent years, studies have found that flavonoids can play an effective protective role in the treatments of ischemic stroke and ischemic heart disease through various ways. The mechanisms of their protective effects have been systematically explained in detail. For example, flavonoids can affect pathophysiological mechanisms such as antioxidant, inhibition of inflammatory response, apoptosis and autophagy pathway. This paper reviews the protective effect and mechanisms of the treatments of flavonoids on cardiovascular and cerebrovascular ischemic diseases by referring to relevant literatures. The purpose is to provide reference for future research and development of drugs for the treatments of cardiovascular and cerebrovascular diseases.
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Key words:
- flavonoids /
- ischemic heart disease /
- ischemic stroke /
- protective effect /
- mechanism of action
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乳腺癌是多发于女性中的恶性肿瘤性疾病，威胁着广大女性的健康[1-2]。据统计，全球女性癌症中，乳腺癌发病率和致死率均高于肺癌，目前居于首位，2020年约230万人诊断出患有乳腺癌，致死病例约68.5万[3]。先天性因素、膳食、环境、工作、发育成长阶段及雌激素类药物等多种因素都能成为乳腺癌的诱发因素[4-5]。目前，乳腺癌早期诊断普遍使用的是影像学检查（临床乳腺体格检查、超声、乳腺X线摄影、磁共振成像等）[6]以及肿瘤标志物(CEA、CA153、VEGF、TSGF等)临床筛查[7]，前者操作复杂且具有一定的组织伤害性[8]，后者局限于需多项联合检测且特异性不高[7，9]，均难以满足临床需求。尽管手术、化疗技术在不断提高，但是抗肿瘤药物疗效有限，乳腺癌患者预后效果不佳，尤其是晚期复发和转移普遍。因此，寻找乳腺癌细胞早期代谢生物标志物，进行安全灵敏的早期诊断，对于乳腺癌诊疗具有重要意义[10]。
作为继基因组学、转录组学、蛋白质组学的后起之秀，代谢组学以研究不同病理生理或基因突变条件下对机体内源性小分子化合物代谢变化为核心[11]。内源性小分子化合物是基因和蛋白质的下游产物，从分子生物层面实时动态地反映上游基因及外部因素对机体功能的影响[12]。代谢组学采用以高灵敏度、高通量为特征的现代仪器分析技术方法，对机体的内源性小分子化合物进行动态分析[13]。伴随乳腺癌发展，患者机体内与氨基酸、糖类、脂质等代谢有关的小分子代谢物会发生异常变化。利用代谢组学方法，将改变的内源性代谢物作为生物标志物，在此基础上寻找相关代谢途径，合理推测乳腺癌的发病机制，揭示生物标志物与乳腺癌发生发展间的关联，最终帮助乳腺癌的临床诊疗。本文主要综述代谢组学在乳腺癌早期诊断、药理研究与药效评估、疾病进程监测以及预后评估的研究进展。
1. 代谢组学概述
代谢组学以相对分子质量<1000的内源性代谢物为研究对象，研究样本包括血浆、尿液、唾液、脑脊液、细胞以及组织提取液等[14-16]，其中，血液和尿液最为常见[17]，研究思路为收集生物样品、样品分离、检测鉴定、分析数据、建立模型、获取细胞活动终产物信息，整个过程综合分析优势明显。按照研究目的分类，非靶向代谢组学和靶向代谢组学是两种常见策略[18]，前者进行轮廓分析，旨在获得较多的生物体内源性代谢物[12]，后者通过靶向分析，希望获得特定的内源性代谢物[19]。
代谢组学目前主流的仪器分析方法为核磁共振法(NMR)和质谱（MS）联用技术，后者主要包括液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[20]，以上分析技术各有其特点。NMR可获取大量的物质结构信息，所得样品分析无偏向、无损伤但灵敏度较低[21]。MS通过有损的离子化分析，提供物质分子量及结构信息，灵敏度更高、扫描速度快[22]，常与色谱在线联用以实现分离分析功能。GC-MS灵敏度高但不适用于热稳定性差的样品的分析，LC-MS则克服了GC-MS的劣势，可分析难挥发、热不稳定物质，分离选择性好、效率高，分析时间也随超高液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS）的推广得到进一步缩短，因此LC-MS实际应用范围更广[19，23]。近年来质谱成像（MSI）技术发展迅速，随之空间代谢组学作为代谢组学新的补充诞生，解决了传统代谢组学研究代谢物在组织中的空间信息缺失问题[24-26]。
代谢组学的数据分析步骤为数据预处理、数据归一化和数据统计，即通过数据的过滤、补齐、归一化等去除仪器或生物偏差后，利用统计方法处理代谢组数据，其中，统计方法是从高维复杂的数据中提取出有效信息的关键。统计方法按照变量的多少分为单变量统计方法和多变量统计方法。常用的单变量统计方法有t检验、非参数检验、方差分析，主要用于实验-对照类研究中寻找两组间的差异代谢物[27]。多变量分析方法有传统算法和机器算法两类，常用的传统算法有偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）[28]及正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA)、主成分分析（PAC），以上又称为模式识别方法，适用于构建预测模型[29]。机器算法应用日益广泛[30]，目前常用的有随机森林（RF）[31]、支持向量机(SVM)[32]、神经网络(ANNs)[33]等。经以上手段获取具有统计学意义的数据，再与多种生化及代谢的数据库对比，继而对所得物质筛选鉴定，最终寻找到潜在的代谢标志物。
2. 代谢组学在乳腺癌中的应用
2.1 代谢组学在乳腺癌早期诊断中的应用
Catarina等[34]采用核磁共振氢谱（1H-NMR）分析了40位BC患者和38位对照（CTL）健康志愿者尿液代谢谱，采用K-S非参数检验和t检验及OPLS-DA等模式识别方法，发现BC患者肌酸、甘氨酸、丝氨酸、二甲胺、三甲胺N-氧化物、α-羟基异丁酸酯、甘露醇、谷氨酰胺等代谢物表现出高敏感性和特异性，代谢途径分析表明，差异代谢物出现可能与BC患者甘氨酸、谷氨酸、丁酸、糖酵解、TCA循环、牛磺酸和丙酮酸代谢途径遭到破坏有关。获得的差异代谢物具有作为生物标志物的潜力，可将BC患者与CTL区分，应用于早期诊断。
约1/4乳腺癌细胞都是三阴性乳腺癌细胞（TNBC），其特点是易转移浸润且复发率高[16]。Fang等[35]基于早期发现的40种氨基酸目标化合物，使用亲水作用色谱法-串联质谱（HILIC-MS/MS），对TNBC、非TNBC及正常的乳腺上皮细胞36种细胞内和34种细胞外小分子物质进行代谢组学分析。运用Mann–Whitney U检验或Kruskal–Wallis检验及OPLS-DA模式识别方法研究，发现与正常细胞相比，两种乳腺癌细胞氨基酸代谢库均明显扩大；与非TNBC相比，TNBC细胞内谷氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、N-乙酰丝氨酸和N-乙酰甲硫氨酸代谢明显增加(变化倍数>2，P<0.01, VIP>1)，TNBC对细胞外谷氨酰胺、丝氨酸、β-丙氨酸和赖氨酸摄取显著增加，对谷氨酸和L-半胱氨酸-谷胱甘肽排泄升高(P<0.01，VIP>1)。研究结果表明，TNBC细胞具有独特的氨基酸代谢特征，对其量化分析可为TNBC患者提供更多新的早期治疗目标靶点。
Daniele等[36]使用液相色谱-四级杆飞行时间质谱(LC-Q-TOF/MS），对23名BC患者和35名口腔健康妇女唾液进行非靶向代谢组学分析，使用t检验、卡方检验等单因素统计方法，对比METLIN数据库，鉴定出乳腺癌组中有31种化合物上调（P<0.05），其中，患者与健康人群相比，发现7种寡肽（H-Arg-Arg-Ser-OH，H-His-Lys-(Ala-Ser)-OH or (Gly-Thr)-OH，H-Ala-Lys-Phe-Trp-OH or H-Gly-Lys-Thr-Ser-OH or H-Arg-Arg-Ser-Ser-OH，H-Phe-Ile-Gln-Arg-OH，H-Glu-Phe-Gln-Arg-OH or H-Ile-Lys-Gln-Trp-OH，H-Phe-Lys-Lys-Trp-OH or H-Phe-Gln-Arg-Tyr-OH，H-Phe-Phe-Gln-Trp-OH）和6种甘油磷脂（PG14∶2、PA32∶1、PS28∶0、PS40∶6、PI31∶1、PI38∶7）表达上调，表现出明显的代谢差异，说明唾液代谢物有望区分乳腺癌患者和健康人群，适用于早期诊断。
依据不同亚型乳腺癌患者的代谢物差异性可以用于乳腺癌诊断甚至个性化治疗。Leticia等[37]采集了4种常见LA型、LB型、HER2+型和TN型乳腺癌患者和健康对照组的血浆样本，利用非靶向超高液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS）代谢组学方法进行分析，通过单变量非参数Wilcoxon秩和检验区分乳腺癌患者和健康受试者的数据差异，多变量PAC和PLS-DA评价统计模型质量，初步确定了4种乳腺癌分子亚型中变化显著的代谢物：LA，TN和HER2分子亚型患者血浆中L-色氨酸浓度显著降低，可能与L-色氨酸代谢激活芳烃受体帮助癌细胞免疫逃逸有关[38]；4种亚型乳腺癌患者磷酸乙醇胺、磷脂血浆浓度降低，提示乳腺癌中脂质代谢差异具有重要意义。上述代谢组学数据表明，色氨酸和部分脂质具有作为乳腺癌诊断的生物标志物潜力，有望推动乳腺癌患者血浆诊断和个性化治疗的发展。
基于以上研究，笔者对代谢组学在乳腺癌早期诊断中发现部分特征代谢物的应用进行归纳总结，见表1。
表 1 代谢组学在乳腺癌早期诊断中发现的特征代谢物作者 样本来源 技术方法 统计学方法 特征代谢物 Catarina等 尿液 1H-NMR K-S非参数检验和t检验与PAC,PLS-DA和OPLS-DA 肌酸、甘氨酸、丝氨酸、二甲胺、三甲胺N-氧化物、
α-羟基异丁酸酯、甘露醇、谷氨酰胺等Fang等 TNBC、非TNBC及正常的乳腺上皮细胞 HILIC-MS/MS Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验与OPLS-DA 胞内：谷氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、
N-乙酰丝氨酸、N-乙酰甲硫氨酸
胞外：谷氨酰胺、丝氨酸、β-丙氨酸、赖氨酸谷氨酸、
L-半胱氨酸-谷胱甘肽Daniele等 唾液 UPLC-Q-TOF-MS t检验、卡方检验等 7种寡肽和6种甘油磷脂 Leticia等 血浆 HPLC-HRMS 非参数Wilcoxon秩和检验、PAC、PLS-DA 色氨酸、磷酸乙醇胺、磷脂 综上所述，基于代谢组学，针对不同乳腺癌患者所能提供的研究样品，采用合适的仪器、数据分析方法获取差异显著的内源性小分子代谢物信息，有效减小检查手段对乳腺癌患者造成的机体损伤，并丰富乳腺癌早期诊断方法，使代谢组学成为乳腺癌早期诊断的有力辅助工具。
2.2 代谢组学在乳腺癌药理研究和药效评价中的应用
癌细胞无限增殖需要大量的能量和物质基础。癌细胞具有特殊的代谢方式，即在有氧条件下倾向于糖酵解而不是三羧酸循环来产生能量[39]，这种新陈代谢重编程称为Warburg效应[40]。一方面，糖酵解中间产物可以合成肿瘤细胞生长所需蛋白质和脂质等生物大分子[41]，同时线粒体损伤可限制丙酮酸进入，使更多丙酮酸在胞质内通过无氧氧化释放能量[42]。另一方面，癌细胞可持续摄取营养物质[43]以及通过加强糖异生途径弥补Warburg效应缺陷。基于癌细胞特殊的代谢重编程，通过药物代谢组学分析，监测机体用药后内源小分子代谢物变化有利于乳腺癌药理研究和药效评估。
Ghanem等[44]对经抗坏血酸处理的管腔和基底样乳腺癌细胞，进行了代谢组学分析，结合细胞存活率数据，发现高剂量抗坏血酸使得乳腺癌细胞糖酵解过程中磷酸丙糖途径（PPP）被严重破坏，ATP水平下降，代谢物重新定向积累为脂质小滴，以及磷酸戊糖途径中代谢物和酶活性增加；细胞死亡依赖于抗坏血酸诱导的氧化应激和ROS积累、DNA损伤以及细胞内辅助因子(包括NAD+/NADH)耗竭效应。综上表明，高剂量抗坏血酸通过诱发乳腺癌细胞“氧化还原危机和能量灾难”发挥细胞毒作用。
Arminan等[45]通过NMR技术检测及主成分分析方法分析处理数据，以评估在N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺-阿霉素共聚物（HPMA-Dox）影响下体外细胞培养模型和体内原位乳腺癌模型的精准抗癌效果，并结合蛋白质表达和流式细胞技术，研究了给药前后原位乳腺癌患者内源性小分子化合物相关生化改变，发现与游离Dox给药相比，用HPMA-Dox进行治疗后，乳腺癌细胞凋亡增加，糖酵解减弱，磷脂水平降低，且HPMA-Dox在体内模型的血液循环时间增加，同时肿瘤储积高、心脏储积低，说明HPMA-Dox药代动力学加强、组织分布得以优化。提示HPMA-Dox可作为一种更精确的抗癌药物模式用于乳腺癌临床治疗。
Panis等[14]将120名单侧乳腺浸润性癌患者随机分为未经化疗组(CA组，n=50)、单剂量短期紫杉醇静脉滴注组(PTX组，n=30)、心脏剖面健康组(CTR组，n=40)，采用LC-MS对其血浆样品进行分析后发现，与CA组乳腺癌患者相比，单剂量短期紫杉醇静脉滴注可使患者血浆高密度脂蛋白水平显著降低，过氧化氢水平升高；与CTR组相比，PTX组患者C反应蛋白和肌酸激酶分数明显升高。以上表明单剂量短期紫杉醇静脉滴注就足以引起脂质代谢显著改变，可能导致毒性累积效应，进一步增加乳腺癌患者心脏病发生风险。可见，代谢组学可参与化疗药物给药优化方案研究，提高药物抗癌效果。
左旋肉碱、酰基肉碱和相关酶是癌症代谢网络中的重要介质。以往研究中LC-MS对乳腺癌中左旋肉碱、酰基肉碱的研究都是均质组织分析，缺乏异质性癌症组织中肉碱的空间分布差异[46]。Sun等[47]利用MSI对异种移植小鼠模型和人类癌组织样本及正常组织中的17种肉碱进行成像并开发了高空间分辨率基质辅助激光解吸电离-质谱成像（MALDI-MSI）方法，发现由170个癌症样本和128个正常样本组成的肉碱谱模型能准确区分乳腺癌，L-肉碱和短链酰基肉碱在人类乳腺癌和异种移植小鼠模型中都有显著改变，乳腺癌中由肉碱系统介导的β氧化代谢途径改变，并且首次发现代谢酶CPT2和CRAT在乳腺癌组织中差异表达。证明肉碱代谢在乳腺癌的代谢物和酶水平上都被重新编程。
2.3 代谢组学在乳腺癌疾病进程监测及预后评估中的应用
心理神经病症(PN)是指许多乳腺癌患者在化疗期间及化疗之后出现疼痛、疲劳和抑郁症状。Debra等[48]使用液相色谱高分辨率质谱法对19位早期乳腺癌女性化疗前后血清样本分别进行非靶向和靶向代谢组学分析，非靶向分析发现化疗后乳腺癌患者乙酰-L-丙氨酸和硫酸吲哚酚浓度升高，5-氧代-L-脯氨酸浓度降低；色氨酸途径靶向分析表明尿氨酸水平、犬尿氨酸/色氨酸水平升高。t检验和Pearson相关系数进一步揭示上述差异代谢物与PN症状显著相关，促进了早期乳腺癌女性PN症状发展程度生物学机制研究。
研究表明，患者他莫昔芬体内代谢物因多昔芬浓度与雌激素受体α(ERα)阳性乳腺癌复发有关[49]，同时他莫昔芬本身和其他代谢物也表现出抗雌激素抗肿瘤活性[50]。Vries等[50]用细胞增殖法测定他莫昔芬、(Z)-因多昔芬、(Z)-4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬抗刺激素活性，建立抗雌激素活性评分模型(AAS)，采用Cox回归方法研究AAS与复发的关系，证明因多昔芬浓度可作为他莫昔芬和代谢物抗雌激素作用的代替，与乳腺癌复发显著相关。
Kamil等[51]用LC-MS/MS对小鼠原位接种4T1转移性乳腺癌细胞进行血浆代谢组学分析和脂质组学分析，建立PLS-DA模型。结果显示，荷癌小鼠癌细胞早期转移表现为L-精氨酸代谢减弱，精氨酸酶和多胺合成增强；晚期转移表现为精氨酸代谢途径改变，不对称二甲基精氨酸血浆浓度升高，能量代谢重新编程为糖酵解，戊糖磷酸途径加速以及三羧酸循环速率降低，脂质分布模式改变，包括总磷脂酰胆碱减少，与二酯结合的磷脂分数减少以及溶血磷脂增加，以上代谢变化在一定程度上表征了癌症转移进展。
目前，OncotypeDX 21基因表达检测技术常用来评估乳腺癌的复发以指导乳腺癌治疗，但在临床的不确定性和基因组不一致的情况下，许多早期乳腺癌的患者仍然会受到过度治疗[52-54]。McCartney等[55]利用1H-NMR分析了87例内分泌受体阳性、HER2阴性早期乳腺癌（eBC）患者血清，使用RF建立eBC患者复发风险的统计模型。最终根据代谢组学特征进一步细分复发风险，并有效区分了每个Oncotype风险分类：在7例复发中代谢组学分析准确预测了其中的6例，1例复发发生在低风险组，3例发生在中风险组，3例发生在高风险组，成功建立了一种通过血清代谢组学分析进一步完善OncotypeDX基因检测风险评分的方法。
3. 总结与展望
乳腺癌在全球发病率日益上升，长期困扰广大女性健康，成为全球医疗卫生领域研究焦点[56]。目前，乳腺癌的早期诊断、药物开发应用以及预后测评等方面还需攻克众多难关，迫切需要新的研究技术的支持。代谢组学以高通量、高灵敏度为特征的技术在乳腺癌领域应用日趋广泛，为乳腺癌潜在代谢标志物的筛选，药物靶点发现、药物潜在作用机制等提供新思路[11]。与其他研究方法相比，代谢组学具有无创取样、研究对象相对简单、检测工作量较小、可实现实时监测、全面综合分析等明显优势。同时，代谢组学作为一门新兴组学，虽然已取得部分进展，但本身发展仍处于探索阶段，应用于临床实践还有所不足：代谢组学研究具有数据维度高的特点，采集与处理过程中可能存在信息丢失、低含量差异代谢物可能被掩盖的问题；数据库不够完善，目前大量未知代谢物的结构鉴定和细胞功能研究困难，对已鉴定出产物的变化机制研究大多仍不明确难以直接指导临床；联用技术操作和数据分析处理的综合性专业人才储备不足等。在精准医疗浪潮推动下，进一步完善代谢组学研究的标准化流程后，利用代谢组学与基因组学、转录组学、蛋白组学以及微生物菌群学[57]对乳腺癌进行多学科技术互补、大数据综合分析，将有利于乳腺癌的早期诊断、发病机制研究以及疾病预后相关诊疗方案的系统优化，为乳腺癌个性化靶向治疗提供更合理的科学指导。
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