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昆仙胶囊是由昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子、菟丝子四味中药组成的复方制剂，是国家“九五攻关”项目成果转化的中药六类新药，具有细胞因子拮抗、免疫抑制、抗炎镇痛等作用，临床上用于风湿性关节炎等免疫性疾病的治疗，疗效显著[1-5]，这可能与各单味药材中富含生物碱、萜类及黄酮类等多种抗炎镇痛的化学成分密切相关[6-9]。雷公藤甲素为君药昆明山海棠中的二萜内酯类毒性效应成分，且有效剂量和中毒剂量极为相近[10-11]，因此，为保证患者用药的安全性及有效性，有必要对昆仙胶囊中雷公藤甲素的含量进行限定。目前，昆仙胶囊现有的质量控制标准中仅对组方中的淫羊藿和枸杞子进行薄层鉴别，含量测定项下则监测雷公藤甲素和淫羊藿苷的含量，但通过实验发现雷公藤甲素的含量测定方法仍然存在前处理方法复杂，含量低，重现性及检测成分专属性差等亟待改进的问题，同时，原检验项目的设置也不够全面，难以对昆仙胶囊实现整体性质量控制。因此，本实验采用薄层色谱法补充建立方中所有药味的薄层鉴别方法，并改良了昆仙胶囊中微量毒效成分雷公藤甲素的含量测定方法，为提升该制剂的质量标准研究提供实验依据。
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Linomat-Ⅵ薄层色谱自动点样器、Reprostar3薄层色谱摄像仪（瑞士CAMAG 公司）；Agilent1260高效液相色谱仪，包括输液泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；BP211D十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；KQ-250DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
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雷公藤甲素（含量：99.8%，批号：111567-201404）、淫羊藿苷（含量：94.2%，批号：111737- 01516）、金丝桃苷（含量：94.9%，批号：111521-201809）对照品，以及对照药材：昆明山海棠（批号：121203-201503）、淫羊藿（批号：121632-201502）、菟丝子（批号：121232-201403）均购自中国食品药品检定研究院；21批昆仙胶囊以及各阴性样品均由广州白云山陈李济药厂有限公司提供，胶囊的批号分别为：K31002、K31005、K31006、K31007、K31008、K31009、K31010、K31011、K31012、K31013、K31014、L31001、L31002、L31003、L31004、L31005、L31006、L31007、L31008、L31009、J31002，分别编号为S1～S21。乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，水为杭州娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。
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取昆仙胶囊内容物6 g，放入500 ml具塞锥形瓶中，加入300 ml甲醇，超声30 min，过滤，将滤液减压浓缩至干，残渣加40 ml水溶解，二氯甲烷萃取2次，每次40 ml，并于萃取过程中加5 ml饱和NaCl水溶液，合并二氯甲烷萃取液，减压浓缩至干，残渣加少量甲醇溶解，加1 g硅胶(200～300目)拌样，称4 g硅胶装入直径为2 cm的柱子，上柱。先用120 ml石油醚-乙酸乙酯（3∶1）洗脱，再以120 ml石油醚-乙酸乙酯（2∶1）洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，残渣加入2 ml甲醇溶解，作为供试品溶液。另取昆明山海棠对照药材10 g，同法制备残渣后，加2 ml甲醇溶解，作为对照药材溶液。再取雷公藤甲素对照品加甲醇制成1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法（通则0502）试验，分别吸取对照品溶液5 μl，对照药材溶液及供试品溶液各10 μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮（12∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛的10%硫酸乙醇溶液，105ºC加热至斑点显色清晰。日光下，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰（见图1）。
图 1 昆明山海棠TLC色谱图
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取本品内容物50 mg，加70%乙醇2 ml溶解，滤过，作为供试品溶液。另取淫羊藿对照药材0.5 g，加乙醇10 ml，40～60℃温浸30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇l ml使溶解，作为对照药材溶液。再取淫羊藿苷对照品加乙醇制成1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以二氯甲烷：甲醇：水：甲酸（7∶3∶1∶0.2）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，烘干，置紫外光灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰（见图2）。
图 2 淫羊藿TLC色谱图
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取本品内容物50 mg，加70%乙醇2 ml溶解，滤过，作为供试品溶液。另取菟丝子对照药材0.5 g，加乙醇40 ml，超声30 min，滤过，滤液浓缩至5 ml，作为对照药材溶液。再取金丝桃苷对照品加乙醇制成1 ml含0.3 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述对照药材及金丝桃苷对照品溶液各2 μl，供试品溶液5 μl，分别点于同一聚酰胺薄膜板上，以乙酸乙酯：甲醇：水：甲酸（12∶2∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，105 ºC加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰（见图3）。
图 3 菟丝子TLC色谱图
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色谱柱：Agilent ZORBA SB-C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；流动相：乙腈（C）-0.1%甲酸水溶液（A）；梯度洗脱：0～10 min，15%→23% C；10～35 min，23%→26% C；35～40 min，26%→26% C；40～41 min，26%→98% C；41～52 min，98%→98% C；检测波长：220 nm（紫外检测时间40 min）；柱温：30 ℃；流速：0.8 ml/min；进样量：10 μl。
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取雷公藤甲素对照品，加甲醇制成每毫升含502 μg雷公藤甲素溶液，作为对照品储备溶液。
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取昆仙胶囊内容物约6 g，精密称定，其余步骤同“2.1.1”项下的方法，制得供试品溶液。
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取缺昆明山海棠的阴性样品适量，按照“2.1.1”项下的方法操作，制得阴性对照溶液。
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分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，按“2.2.1”项下色谱条件分析，结果显示，其与相邻色谱峰的分离度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.10，理论塔板数在5000以上，且阴性样品在各色谱峰的位置上未见干扰，说明该方法专属性良好，其HPLC图谱见图4。
图 4 昆仙胶囊样品中雷公藤甲素的HPLC色图谱
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将雷公藤甲素对照品储备液用甲醇稀释制成每毫升含502.00、401.60、200.80、100.40、50.20、40.16 μg的系列溶液，分别吸取10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积Y对质量浓度X（μg/ml）进行线性回归，得回归方程：Y=24.459X+347.82，r= 0.999 5，线性范围为40.16 ～502.00 μg/ml。
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取雷公藤甲素对照品溶液（100.4 μg/ml），进样10 μl，连续进样6次，测定峰面积，结果显示雷公藤甲素的平均峰面积为2813.93，RSD为0.19%，表明仪器精密度良好。
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按照供试品溶液制备方法，平行制备6份供试品溶液，分别进样10 μl，测定峰面积，结果表明，雷公藤甲素的平均含量为0.0097 mg/粒，RSD为3.57%，表明该方法重复性较好。
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取某一批次（L31008）样品，制备成供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24、36、48 h分别进样测定雷公藤甲素的峰面积，结果显示雷公藤甲素平均峰面积为2647.16，RSD为1.53%，说明供试品溶液在48 h内稳定。
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分别精密称取6份已知含量的样品约6 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，按照接近1∶1的量计算所需添加的雷公藤甲素对照品溶液，加入到样品中，按“2.2.3”项下方法平行制成6份供试品溶液，进样10 μl，记录峰面积，结果显示雷公藤甲素的平均回收率为98.12%，RSD为8.25%，说明该方法准确度较好，计算结果见表1。
表 1 雷公藤甲素的加样回收率试验结果(n=6)
样品量（m/mg） 加入量（m/mg） 测得量（m/mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD
（%）0.097 6 0.097 9 0.188 7 92.98 98.12 8.25 0.097 6 0.097 9 0.181 8 85.92 0.097 6 0.097 9 2.050 5 109.71 0.097 6 0.097 9 1.937 0 98.11 0.097 6 0.097 9 1.972 9 101.78 0.097 6 0.097 9 1.957 8 100.23 -
分别取每批昆仙胶囊粉末约6 g，精密称定，按“2.2.3”项下的方法制成供试品溶液，每批样品平行制备2份，每份进样3针，进样量10 μl，记录峰面积，计算结果见表2。
表 2 21批次昆仙胶囊中雷公藤甲素的含量测定结果
批号 平均含量（mg/粒） 批号 平均含量（mg/粒） S1 0.010 3 S12 0.011 7 S2 0.009 2 S13 0.011 2 S3 0.009 1 S14 0.013 3 S4 0.005 9 S15 0.008 8 S5 0.011 7 S16 0.012 6 S6 0.009 0 S17 0.012 2 S7 0.006 5 S18 0.007 0 S8 0.007 6 S19 0.009 8 S9 0.011 6 S20 0.008 8 S10 0.010 2 S21 0.011 8 S11 0.008 4 -
本研究采用TLC法补充了昆仙胶囊全药味的鉴别方法，各项方法重复性好，专属性强，且阴性无干扰。与原标准相比，改良后的淫羊藿药材的薄层鉴别方法所获得的斑点分离度更佳，比移值适中；新增的昆明山海棠药材薄层法中点状点样优于条带状点样，喷以2%香草醛的10%硫酸乙醇溶液显色方式优于10%硫酸乙醇溶液显色；新增的菟丝子药材薄层鉴别中，按照2020版中国药典中菟丝子的鉴别方法以甲醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）为展开剂时[12]，所获得的目标斑点分离度及成点性均差，而以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（12∶2∶1∶1）为展开剂时，所获目标斑点的成点性及分离度均得到有效改善。但由于所测成分化学性质相差较远，尚无法实现“一板多测”。
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由于本品成分复杂，雷公藤甲素又属于微量成分，需对昆仙胶囊的前处理条件进行优化。首先，我们参考了厂家的前处理方法，即利用甲醇提取蒸发浓缩后，直接过氧化铝-硅胶柱纯化，结果得到的目标化合物含量较低，操作方法可重复性差，且液相色谱中雷公藤甲素分离度较差，易受其他化合物干扰。为此，我们又尝试通过甲醇提取，再多次萃取富集纯化的方法，均不能实现有效的测定。进而，我们结合厂家的方法，对我们的方法进行了优化，最终确定为甲醇超声提取后，用二氯甲烷萃取，然后通过硅胶柱再次富集和纯化目标成分，最终不仅提高了HPLC法检测雷公藤甲素含量的上限，且大大减少了其他化合物对目标色谱峰的干扰。整个前处理过程，还比较了不同的提取溶剂和萃取溶剂的效果，结果均不如本法。
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由于样品中其他黄酮类成分的含量相对较高，按照现行部颁标准中的液相方法测定目标成分时，容易出现色谱柱对目标成分的分离效果差，含量测定结果的重复性、重现性不理想，RSD较大等问题。为此，本实验又对定量测定雷公藤甲素含量的色谱条件进行了优化，主要比较了不同色谱柱（Diamonsil C18、Agilent ZORBA SB-C18、Amethyst C18及Waters SunFireTm C18），不同流动相（乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液），不同柱温（25、30、35、40 ℃）及不同体积流量（0.8、0.9、1.0 ml/min）对雷公藤甲素色谱峰的影响，最终以Agilent ZORBA SB-C18为色谱柱、乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相、柱温为30 ℃及流速为0.8 ml/min时，目标峰分离完全，效果最佳。
综上，本文建立的昆仙胶囊薄层鉴别及雷公藤甲素含量测定的方法，不仅弥补了昆仙胶囊全药味薄层鉴别的研究，同时也解决了现行标准中雷公藤甲素难测定，重复性差等难点，为完善昆仙胶囊的质量评价提供了依据。
Improvement of the quality standard for Kunxian capsules
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摘要:
目的 提升昆仙胶囊质量标准，以有效地控制产品质量。 方法 以雷公藤甲素、淫羊藿苷、金丝桃苷为指标性成分，增加或改进昆明山海棠、淫羊藿及菟丝子的薄层鉴别方法；以Agilent ZORBA SB-C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）为色谱柱，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，以220 nm为检测波长，改良雷公藤甲素的HPLC含量测定方法。 结果 昆明山海棠、淫羊藿及菟丝子的TCL法鉴别专属性强，特征斑点分离度良好、清晰，阴性无干扰；定量分析结果显示雷公藤甲素的质量浓度在40.16～502.00 μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系（r=0.999 5），平均加样回收率为98.12%，RSD为8.25%，准确度良好。 结论 本实验所建立的TLC鉴别方法和HPLC含量测定方法专属性强、重现性好，能有效地控制昆仙胶囊的质量。 Abstract:Objective To improve the quality standards of Kunxian capsules (KC) and effectively control the product quality. Methods Triptolide, icariin and hypericin were used as the indicator components, to increase or improve the thin layer chromatography (TLC) identification methods of Kunming begonia, epimedium and dodder. Agilent ZORBA SB-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) as a chromatographic column, the HPLC method for the determination of triptolide was improved with acetonitrile-0.1% formic acid solution as the mobile phase and 220 nm as the detection wavelength. Results The spots in the TLC method of Kunming begonia, epimedium and dodder has strong specificity, good and clear separation of characteristic spots, negative and no interference. The quantitative analysis of the content of triptolide in KC showed that there is a good linear relationship (r=0.9995) between the mass concentration of triptolide and the peak area in the range of 40.16-502.00 μg/ml, the average recovery was 98.12%, RSD was 8.25%, and the accuracy was good. Conclusion The TLC identification method and HPLC method established in this experiment have strong specificity and good reproducibility, and can effectively control the quality of KC. -
Key words:
- Kunxian capsules /
- TLC /
- triptolide /
- HPLC /
- quality standards
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子宫内膜异位症（endometriosis，EM）是临床上最为常见的慢性妇科疾病之一，以慢性盆腔疼痛、月经紊乱和不孕为主要的临床表现。EM本质是血瘀证，临床治疗时以活血化瘀为主，常用的药物有桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行等，能够有效缓解患者痛经、非经期盆腔痛等症状[1]。
目前活血化瘀类中药对EM治疗的具体机制不是很清晰，其针对的靶点也不是很明了。网络药理学将生物网络作为研究对象，探究药物、靶点、疾病之间的联系，系统完整地研究药物的机制，可展现出药物对于多个靶点、多个通路不同影响。因为和中医整体观念天然契合，网络药理学现已广泛应用于中药研究中[2-3] 。在本研究中，笔者采用网络药理学的方法探究活血化瘀类中药治疗EM的作用机制，构建“化合物-靶标-通路-疾病”网络，并初步探析何种活血化瘀药在EM治疗中更具优势，为临床用药以及进一步实验研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 活血化瘀类中药确认
根据卫生部“十一五”规划教材《中药学》分类，确认桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行七味活血化瘀药为本次主要研究对象。
1.2 中药有效成分以及相关靶点的获取
利用中药化学成分数据库TCMSP平台（http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），检索七味中药所含活性成分。依据数据库指南要求，将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%以及类药性（drug-like，DL）≥0.18作为筛选条件，对活性成分进行筛选[4]。OB值是评价药物能否发挥药效的重要药动学参数，DL值是指化合物与所有已知药物之间的相似程度。上述2个参数是评价中药化学成分吸收、分布、代谢、排泄的关键参数。获得符合OB、DL参数有效活性成分后，利用TCMSP数据库查询各有效活性成分对应相关靶点。利用Venn图工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对药物化学成分以及相关靶点进行共同点分析，寻找活血化瘀中药共有成分和作用靶点。
1.3 EM相关靶点基因确认
利用美国国立生物技术信息中心Gene数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）将所获靶点信息转换成基因名称。查询GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，获得与EM相关基因靶点。最后将每种中药的作用靶点对应的Gene Symbol与EM基因进行比对，获得每种中药可能影响EM的相关基因，利用Cytoscape 3.6.0软件构建化合物－靶点网络[5]。
1.4 构建蛋白互作网络
为进一步研究靶点之间的相互关系，将活血化瘀药共同靶点上传至线上软件 STRING(http://string db.org)，构建蛋白互作网络。物种选择为Homosapiens，minimum required interaction score调整为highest confidence，隐藏网络图中游离节点，获取PPI网络。
1.5 KGEE通路分析
利用KEGG数据库（https://www.keg g.jp/）查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。筛选各中药KEGG通路中相关基因富集情况，并利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图。
2. 结果
2.1 活血化瘀类中药有效成分及对应靶点的获取
按照要求从TCMSP数据库中筛选出各中药有效成分，删除重复项，共有94种有效成分（supplementary materials table S1）。其中丹参有效活性成分达到65个，而泽兰有效活性成分只有2个。未能发现七味活血化瘀药共同有效成分，但β-谷固醇为川牛膝、红花、桃仁、泽兰所共有，槲皮素为川牛膝、红花、王不留行、益母草所共有，是涉及活血化瘀类中药最多的2种有效成分（supplementary materials table S2）。与此同时，我们找到了七味中药所共有的19个作用靶点（表1），包括孕酮受体（progesterone receptor）、前列腺素G/H合成酶1（prostaglandin G/H synthase 1）、前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2）、凋亡调节剂Bcl-2（apoptosis regulator Bcl-2）、核受体共激活剂（nuclear receptor coactivator 2）等。
表 1 七种活血化瘀中药共有的19个靶点序号 蛋白名称 基因名称 靶点标识码 1 钠通道蛋白5型亚基 SCN5A TAR00070 2 前列腺素G/H合成酶1 PTGS1 TAR00006 3 Beta-2型肾上腺素受体 ADRB2 TAR00261 4 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3 CHRM3 TAR00016 5 孕酮受体 PGR TAR00209 6 半胱天冬酶3 CASP3 TAR04087 7 热休克蛋白HSP 90 HSP90 TAR00444 8 钾电压门控通道亚家族H成员2 KCNH2 TAR00037 9 凋亡调节剂Bcl-2 BCL2 TAR00086 10 PKA催化亚基C-alpha PRKACA TAR00699 11 半胱天冬酶9 CASP9 TAR04090 12 γ-氨基丁酸受体亚基α-1 GABRA1 TAR00309 13 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1 CHRM1 TAR00038 14 前列腺素G/H合酶2 PTGS2 TAR00094 15 转录因子AP-1 JUN,FOS TAR00414 16 磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基，γ亚型 PIK3CG TAR00491 17 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2 CHRM2 TAR00210 18 核受体共激活剂2 NCOA2 TAR03276 19 维甲酸受体RXR-alpha RARA TAR00158 2.2 EM相关靶点确认
利用人类基因数据库查找EM作用靶点，与七味中药有效成分对应靶点进行比对，发现红花所含相关靶点数量最多，达到103个；而桃仁、泽兰所含相关靶点数量最少，为14个（图1A）；王不留行所含相关靶点占有效成分作用靶点比例最高，为54.7%；而桃仁最低，为29.8%（图1B）。经过去重处理后，七味中药所含EM相关靶点共119个（supplementary materials table S3）。利用Cytoscape3.6.0软件进行成分－靶点网络分析，获得图2，其中共计216个节点，其中黄色节点为活血化瘀药有效活性成分，而蓝色节点代表EM相关靶点。利用软件自带分析功能，对于网络各节点度值进行分析，网络中某些节点度值较高，提示该节点为网络中的关键节点（supplementary materials table S4）。在各中药所含有效成分中，槲皮素展现出极高的连接度（度值=87），远超其他有效成分，而其余较高连接度值依次是木犀草素（度值=43）、山柰酚（度值=33）、黄芩素（度值=23）、丹参酮A（度值=20）、花生四烯酸（度值=20）、β-谷固醇（度值=18）。中药是一个多有效成分的复杂系统，一个有效成分可作用于多个靶点，协同作用于某种疾病的治疗。而在靶点的分析中，较高连接度的靶点可能在EM的治疗作用中起着重要的作用。前列腺素G/H合酶2(PTGS2，度值=82）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1，度值=39）两者拥有最高的度值，是临床上炎性疾病治疗的主要靶点；核受体辅活化子2（NCOA2，度值=35）、核受体辅活化子1（NCOA1，度值=34)紧跟其后，同样在各炎症通路中作用显著；凝血酶(度值=31）是临床上治疗出血的重要靶点，直接作用于血液凝固过程的最后一环；Mu-type阿片受体（OPRM1，度值=30）则涉及到中枢镇痛功能。上述靶点均和EM症状及病机之间有着密切的关系。
图 1 七味活血化瘀中药EM相关靶点数量及所占比例A.基于OB≥30%和DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点个数；B.基于OB≥30%、DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点的比例2.3 PPI网络的构建与分析
利用STRING软件构建靶点PPI网络，图中包含119个节点，505条边，所有节点平均度值为8.49，具体见图3。根据“度值>均值”筛选出PPI网络中关键节点56个（supplementary materials table S6），前9位关键节点，平均度值为88，见表2，与PPI网络74%节点存在相互作用关系，提示它们在网络调控中起着关键作用，可能是活血化瘀药物治疗EM的关键所在。
表 2 PPI网络中关键节点节点名称 度值 节点名称 度值 节点名称 度值 ALB 97 IL6 92 PTGS2 83 AKT1 95 TNF 86 CASP3 80 VEGFA 94 MAPK8 83 MAPK1 80 2.4 KEGG通路分析
利用KEGG数据库查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。整理各中药KEGG通路相关基因富集情况，发现七味中药共有信号通路44条（supplementary materials table S5），筛选出与EM密切相关的19条通路（表3）。从表3中，不难发现，19条通路涉及性激素、炎症、细胞调亡以及血管生成等各个方面，其中炎症相关通路达到7条，为所有通路中最多。利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图，根据图4可知，在系列通路中，泽兰与桃仁作用均弱于其他五味中药。而在PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路中，多味中药靶点存在高度富集，红花在PI3K-Akt信号通路中显著富集，远超该药其他通路，值得注意。
表 3 七味活血化瘀中药的19条KEGG通路序号 标识码 信号通路名称 类别 1 hsa04151 PI3K-Akt信号通路 炎症相关 2 hsa04668 TNF信号通路 炎症相关 3 hsa04657 IL-17信号通路 炎症相关 4 hsa04625 C型凝集素受体信号通路 炎症相关 5 hsa04064 NF-κB信号通路 炎症相关 6 hsa04115 p53信号通路 炎症相关 7 hsa00590 花生四烯酸代谢 炎症相关 8 hsa01522 内分泌抵抗 激素相关 9 hsa04915 雌激素信号通路 激素相关 10 hsa04919 甲状腺激素信号通路 激素相关 11 hsa04921 催产素信号通路 激素相关 12 hsa04210 细胞凋亡 细胞凋亡 13 hsa04071 鞘脂信号通路 细胞凋亡 14 hsa01521 EGFR酪氨酸激酶抑制剂拮抗 血管相关 15 hsa04370 VEGF信号通路 血管相关 16 hsa01521 血小板活化 血管相关 17 hsa04722 神经营养蛋白信号通路 疼痛相关 18 hsa04725 胆碱能突触 疼痛相关 19 hsa04726 血清素能突触 疼痛相关 3. 讨论
本研究采用网络药理学的研究方法，从TCMSP数据库中提取出了94个符合标准的成分，通过VENE图去重以及分析网络图的拓扑特性后，发现槲皮素为四味活血化瘀药所共有，与83种EM相关靶点存在关联。现代研究表明，槲皮素具有抑制炎症、血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖的作用，通过抗氧化作用诱导细胞凋亡，还可通过雌激素受体，调控受体下游多种底物及信号通路而调节雌激素[6-7]。木犀草素与41种EM靶点相关联，具有抗炎、抗纤维化、抑制血管生成等作用[8]。EM发生发展过程中慢性炎症反应一直贯穿始终，且存在纤维化病变，木犀草素或在EM治疗中有一定作用[9-10]。
通过VENE图，发现七味中药共有作用靶点19个，部分共有靶点与Cytoscape网络图以及PPI网络中关键节点高度对应，进一步强调了该部分共有靶点在EM中的作用。如PTGS2，该靶点所调控环氧合酶（COX-2）的高表达会导致细胞的高增殖性、高侵袭性，诱导血管生成从而加重EM的疼痛和不孕症状[11]。NCOA2、NCOA1的水平异常与EM的进展关联密切。趋化因子参与子宫内膜异位种植过程中趋化、黏附、侵袭、血管形成及细胞生长分化等多个重要环节[12]。Xiu等发现，在分泌期，NCOA1和趋化因子CXCL12在异位子宫内膜中的表达明显高于正常子宫内膜；活化血小板对异位内膜具有促炎、促血管生成的作用，促使异位内膜细胞的侵袭和增殖[13-14]，子宫内膜基质细胞可分泌F2，以密集依赖的方式诱导血小板活化和聚集，从而影响EM的进展[15-16] 。VEGFA可促进新生血管形成并使血管通透性增加，陈晓莉等[17]研究表明，内异症组血清和腹腔液VEGF水平明显高于对照组，且重度患者腹腔液中VEGF水平高于轻度患者，VEGF在EMT患者血管生成中起促进性作用,在血清与腹腔液中的高表达与疾病发生发展相关。尉伟东等[18]发现CASP3蛋白在异位内膜和在位内膜中的评分明显低于正常对照组，caspase-3的水平下降提示内膜细胞活性下降，促使子宫内膜细胞自发性凋亡增加以及凋亡信号敏感性增强，诱导或加重EM。
利用KEGG数据库，找到了七味活血化瘀药共有EM相关通路19条，涉及性激素、炎症、细胞凋亡以及血管生成等方面。所有通路中，炎症通路达到36%。其中PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路是靶点富集最多的通路，提示活血化瘀药主要通过抗炎作用来对EM起治疗作用。与正常女性相比，EM患者的子宫内膜在位和异位内膜细胞的PI3K表达增加，AKT磷酸化水平升高，证实PI3K/AKT信号通路可影响EM进展[19]。EM是一种雌激素依赖性疾病，呈现出慢性炎症反应，多种炎性因子参与其病理过程，包括NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-17等[20]。许丽华等[21]通过实验发现，EM患者血清及腹腔液中TNF-α水平显著高于对照组。EM患者Ⅲ和Ⅳ期血清和腹腔液中TNF-α水平均高于Ⅰ和Ⅱ期，证实了TNF-α与子宫内膜异位症的发生发展密切相关,有助于子宫内膜异位症的诊断。IL-1家族在EM发生发展中作用显著，与正常女性相比，EM患者静脉血中IL-1β浓度显著增高。不仅仅是IL-1β，研究显示，IL-1β前体蛋白（proIL-1β）也可以加重炎症反应，EM患者腹腔液中IL-1β、proIL-1β水平均高于健康女性。IL-1家族细胞因子的损伤，导致EM患者腹腔免疫机制的紊乱，局部以及全身IL-1β、IL-18调控机制的缺陷，使得内膜组织的侵袭性以及生长性大幅增加，从而导致EM[22-24]。炎症相关通路的高富集也与之前网络图中TNF、IL-6等炎性相关靶点的高度值相对应，进一步强调了活血化瘀药物通过抗炎作用治疗EM的作用机制。细胞凋亡是一种独特的程序性细胞死亡，细胞的有效清除而不会引起炎症反应，EM特征为异位内膜细胞凋亡率下降。与健康女性子宫内膜相比，EM异位内膜抗凋亡因子表达增加，促凋亡因子表达减少，证实了细胞凋亡在EM的发病中确有作用，并和炎症反应存在一定关联[25]。EM发生发展过程中亦伴随着血管生成增多以及局部病灶周期性出血，EM患者异位内膜血管内皮生长因子(VEGF)表达量增高，抗血管生成因子(sFlt-1)表达量下降，证实VEGF信号通路、血小板激活通路均参与此过程，与前面靶点分析也形成呼应[26-27] 。脑源性神经营养因子是各种慢性疾病中慢性疼痛形成和维持的调节因子，EM伴有疼痛的患者血清和腹膜液中神经营养因子浓度明显高于无疼痛EM患者[28]。利用KEGG通路分析，可以发现活血化瘀药对于炎症、凋亡、疼痛、血管生成等相关通路均具备调控作用，进一步强调了临床上活血化瘀药对于EM的治疗价值。
综上所述，活血化瘀中药可通过多靶点、多通路协同作用方式对EM进行治疗，体现了中医药治疗疾病特色。上述七味中药中，桃仁、泽兰对于EM的作用低于其余活血化瘀药，而红花、益母草在EM治疗体系中，EM相关靶点高于其余中药，可能会起到更好的疗效，在临床上可尝试推广使用。本研究从网络药理学角度出发，根据活血化瘀中药有效成分和作用靶点，在一定程度上对活血化瘀中药治疗EM进行了机制的解析，为指导临床用药提供了一定的依据。但本研究仅仅基于TCMSP数据库，利用计算机软件从理论上对活血化瘀中药治疗EM作用机制做了探析，还需要通过实验和临床实践来进一步证实，而且还需要扩大活血化瘀药物探究范围，结合临床实际，深入剖析活血化瘀药共同点与差异之处。
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表 1 雷公藤甲素的加样回收率试验结果(n=6)
样品量（m/mg） 加入量（m/mg） 测得量（m/mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD
（%）0.097 6 0.097 9 0.188 7 92.98 98.12 8.25 0.097 6 0.097 9 0.181 8 85.92 0.097 6 0.097 9 2.050 5 109.71 0.097 6 0.097 9 1.937 0 98.11 0.097 6 0.097 9 1.972 9 101.78 0.097 6 0.097 9 1.957 8 100.23 
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表 2 21批次昆仙胶囊中雷公藤甲素的含量测定结果
批号 平均含量（mg/粒） 批号 平均含量（mg/粒） S1 0.010 3 S12 0.011 7 S2 0.009 2 S13 0.011 2 S3 0.009 1 S14 0.013 3 S4 0.005 9 S15 0.008 8 S5 0.011 7 S16 0.012 6 S6 0.009 0 S17 0.012 2 S7 0.006 5 S18 0.007 0 S8 0.007 6 S19 0.009 8 S9 0.011 6 S20 0.008 8 S10 0.010 2 S21 0.011 8 S11 0.008 4
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