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α1-酸性糖蛋白基本特征及代谢调节作用的研究进展

向科发 万静静 张慧敏 史小飞 秦臻 刘霞

杨贺英, 罗彩萍, 彭婷, 梁文仪, 沈颂章, 苏娟. 花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析[J]. 药学实践与服务, 2025, 43(2): 75-81. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066
引用本文: 向科发, 万静静, 张慧敏, 史小飞, 秦臻, 刘霞. α1-酸性糖蛋白基本特征及代谢调节作用的研究进展[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(1): 6-11. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105032
YANG Heying, LUO Caiping, PENG Ting, LIANG Wenyi, SHEN Songzhang, SU Juan. Optimization of purification process and component analysis of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2025, 43(2): 75-81. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066
Citation: XIANG Kefa, WAN Jingjing, ZHANG Huimin, SHI Xiaofei, QIN Zhen, LIU Xia. The research progress on the basic characteristics and metabolic regulation of α1-acid glycoprotein[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(1): 6-11. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105032

α1-酸性糖蛋白基本特征及代谢调节作用的研究进展

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105032
基金项目: 国家自然科学基金( 81773726; 82073842); 上海市2021年度“科技创新行动计划”(21XD1404700)
详细信息
    作者简介:

    向科发,硕士研究生,Email:xkfhz2014@163.com

    通讯作者: 刘 霞,教授,博士生导师,研究方向:心脑血管药理学,Email:lxflying@aliyun.com
  • 中图分类号: R969[

The research progress on the basic characteristics and metabolic regulation of α1-acid glycoprotein

  • 摘要: 代谢稳态是机体生存必需的基础性功能。α1-酸性糖蛋白(AGP)是一种急性期蛋白,糖基化程度高达45%,具有高亲和力、低容量的特性。虽然AGP的生物学作用尚不完全清楚,但已经证明它可以调节免疫和代谢,并在携带药物转运,维持毛细血管屏障功能等方面发挥着重要作用。综述AGP的结构特征、生化特性,以及AGP的表达调控和代谢调节作用,提示其可能是代谢通路上的一个潜在关键因子,成为代谢性疾病的一个新的研究方向。
  • 花椒为芸香科植物红花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.或青花椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.的干燥成熟果皮,味辛,性温,具有温中止痛、杀虫止痒的功效,主治脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛[1]。生物碱是花椒的主要特征性成分,组成丰富、结构多样,具有抗炎、镇痛、抗菌、抗氧化、降脂和抗肿瘤等多种药理活性[2-8]。其中,不饱和脂肪酰胺类生物碱如羟基-α-山椒素(HAS)、羟基-β-山椒素(HBS)已经被证实能够调节脂质代谢,对非酒精性脂肪肝病等代谢性疾病的预防具有潜在效果[9]。然而,对花椒生物碱的制备、富集纯化工艺优化的研究较少。花椒生物碱高效提取与纯化是其后续活性评价和产品开发的基础,有利于花椒药用价值的深度开发,因此优化花椒生物碱的富集纯化工艺具有重要意义。

    大孔吸附树脂法是最常用的富集纯化手段,具有选择性好、吸附能力强、富集效果好、环保绿色等优点,在中药材、中药制剂方面应用广泛[10-11]。因此,本实验以HAS、HBS的得率为指标,筛选适宜纯化花椒生物碱的大孔树脂类型,采用单因素实验和正交试验确定树脂的最佳吸附、除杂、洗脱条件,建立大孔树脂富集纯化花椒生物碱的最佳工艺。采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MSE)技术鉴定成分,以期为花椒生物碱的物质基础研究和进一步的综合开发利用提供科学依据。

    花椒药材(批号:20220705-2,购于陕西省渭南韩城市),经海军军医大学张成中副教授鉴定为芸香科花椒属红花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim)的干燥果皮。

    1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Acquity I-CLASSTM UPLC 超高效液相色谱系统、Xevo G2-XS 四级杆串联飞行时间质谱(美国沃特世科技有限公司);R-100型旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司);XS205DU电子分析天平(梅特勒托利多科技公司)。

    HAS对照品(纯度≥98%,批号:P2834270,源叶);HBS对照品(纯度≥98%,批号:P2832664,诗丹德);95%乙醇(分析纯,上海泰坦科技股份有限公司);甲酸、甲醇、乙腈(色谱纯,赛默飞世尔科技公司);APS-17型、NKA-9型、HP-20型、AB-8型大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司);HPD-400型大孔吸附树脂(上海一飞生物科技有限公司);HP-20型大孔吸附树脂(日本三菱化学株式会社)。

    2.1.1   溶液的配制

    称取50 g花椒于圆底烧瓶中,加入500 ml的50%乙醇,95℃水浴加热,回流提取1 h,共提取3次。过滤后合并滤液,45℃减压浓缩至无醇味,过滤,加水分散至250 ml,即得上样液。

    取216 ml上样液,上样于直径为2.7 cm、高度为18.9 cm的三菱HP-20型大孔树脂柱,动态吸附30 min,静置1 h后,取216 ml 20%乙醇除杂24 min;540 ml 80%乙醇洗脱1 h。收集洗脱液,45℃减压浓缩并干燥,即得提取物粉末。

    对照品溶液:精密称定HAS、HBS对照品适量,加50%乙醇定容,分别制成0.61 mg/ml、0.11 mg/ml的对照品溶液。

    供试品溶液:精密称定适量提取物粉末,加50%乙醇定容后,0.45 μm微孔滤膜过滤,即为供试品溶液。

    2.1.2   色谱条件

    色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm);流速:0.3 ml/min;检测波长:270 nm;柱温:30℃;进样量:5 μl。流动相:乙腈(A)-0.1%三乙胺(B);洗脱梯度:0~18 min,10%→35%A;18~30 min,35%→50%A;30~36 min,50%→90%A,36~39 min,90%A,39~40 min,90%→10%A。

    2.1.3   线性关系

    取HAS对照品溶液、HBS对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ml置于5个5 ml容量瓶中,50%乙醇定容至刻度,摇匀后得到系列梯度浓度的标准工作溶液,0.45 μm微孔滤膜过滤,在“2.1.2”项下色谱条件下进样。

    2.1.4   精密度

    取“2.1.1”项下对照品溶液2.0 ml置于5 ml容量瓶中,50%乙醇定容至刻度,混匀后0.45 μm微孔滤膜过滤,连续进样6次。

    2.1.5   稳定性

    取“2.1.1”项下的供试品溶液,于0、1、2、4、8、24 h分别进样。

    2.1.6   重复性

    按照“2.1.1”项方法平行制备供试品溶液 6 份,在“2.1.2”项下色谱条件进样测定。

    2.1.7   加样回收率

    精密称取已知HAS、HBS含量的花椒生物碱粉末适量, 共取9份,分别准确加入HAS、HBS对照品适量,按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液,进样分析并计算加样回收率。

    2.2.1   树脂类型

    95%乙醇浸泡树脂24 h,充分溶胀后湿法装柱,95%乙醇淋至洗脱液澄清透明,水洗至洗脱液无醇味,备用。取预处理后的不同类型的大孔树脂,按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液并进样,计算HAS、HBS的总得率。

    2.2.2   上样量

    湿法装柱,取“2.1.1”项下制备的上样液450 ml,以2 BV/h上样,流出液每30 ml收集1份。按“2.1.2”项下色谱条件进样,以累计上样体积(V/ml)为横坐标(X),以HAS、HBS的总泄漏率(%)为纵坐标(Y),绘制泄漏曲线。

    2.2.3   单因素实验考察上样条件

    除变量外固定其他工艺条件(树脂类型、上样量与树脂体积比、除杂溶剂、除杂体积、除杂流速、洗脱溶剂、洗脱体积及洗脱流速分别为三菱HP-20型、1 g∶2.5 ml、10%乙醇,2 BV、5 BV/h、70%乙醇、5 BV及5 BV/h)不变的情况下,分别考察上样液浓度(0.1、0.2、0.4 g生药/ml)、树脂柱径高比(1∶5、1∶7、1∶9)及吸附流速(1、2、4 BV/h)对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响。

    2.2.4   正交试验考察除杂、洗脱条件

    在单因素实验的基础上,采用L9(33)正交试验进一步分析除杂条件(除杂溶剂、体积、流速)、洗脱条件(洗脱溶剂、体积、流速)对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响(表1),总结最佳工艺并进行验证。统计分析使用SPSS 26.0 软件。

    表  1  除杂、洗脱条件正交试验因素水平表
    条件 水平 因素
    A因素溶剂 B因素体积(BV) C因素流速(BV/h)
    除杂 1 蒸馏水 1 2
    2 10%乙醇 2 3
    3 20%乙醇 3 5
    洗脱 1 55%乙醇 3 2
    2 70%乙醇 5 3
    3 80%乙醇 8 5
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    2.3.1   样品制备

    精密称定“2.2.4”项下以最佳工艺制备的花椒生物碱粉末5.0 mg,50%甲醇定容至25 ml,0.45 μm微孔滤膜过滤备用。

    2.3.2   色谱条件

    色谱柱:Waters ACQUITY HSS T3柱(2.1×100 mm, 1.7 μm);检测波长:270 nm;流速:0.3 ml/min;柱温:30℃;进样量:3 μl。流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸水(B),洗脱梯度:0~18 min,10%→35%A;18~24 min,35%→46%A;24~30 min,46%→90%A;30~32 min,90%A;32~33 min,90%~10%A;33~36 min,10%A。

    2.3.3   质谱条件

    电喷雾离子源(ESI),正离子模式扫描。离子源温度120℃,雾化气流速为800 L/h,毛细管电压为3.0 kV。锥孔电压40 V,补偿电压80 V。低能量扫描电压6 eV,高能量扫描电压30~60 eV;喷雾器压力为6.5×105 Pa,气帘气体积流量为50 L/h,扫描范围m/z为50~1500。亮氨酸-脑啡肽(m/z∶ 554.261 5 [M-H])和(m/z∶ 556.277 1[M+H]+)作为外标进行质量实时校正,体积流量设为5 μl/min。

    MassLynx V4.1工作站使用MSE模式采集质谱数据。

    3.1.1   花椒生物碱的HPLC图

    供试品HPLC图如图1所示,该色谱条件下,HAS与HBS色谱峰分离度大于1.5、理论塔板数均大于30000、峰形稳定、无干扰,能够满足样品分析检测要求。

    图  1  供试品溶液的HPLC图
    1.羟基-α-山椒素;2.羟基-β-山椒素
    3.1.2   线性关系考察结果

    以对照品溶液的浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),得到HAS的回归方程Y=3312.7 X−8.887,r=0.999;HBS的回归方程Y=33030 X+12.061,r=0.999。即HAS、HBS分别在进样浓度为24.4~488 μg/ml、4.4~88 μg/ml范围内呈良好的线性关系。

    3.1.3   精密度实验结果

    HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.94%、0.34%,仪器精密度良好,符合定量测定要求。

    3.1.4   稳定性实验结果

    HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.20%、0.43%,表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

    3.1.5   重复性实验结果

    HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.26% 和0.26%,表明方法重复性良好。

    3.1.6   加样回收率实验结果

    计算得到HAS低、中、高浓度的加样回收率分别为(103.66±0.62)%、(100.22±3.10)%、(102.47±1.24)%;HBS的低、中、高浓度的加样回收率分别为(101.35±0.89)%、(98.58±2.48)%、(98.86±1.02)%。结果表明该测定方法准确性好,可用于样品中HAS、HBS的含量测定。

    3.2.1   树脂类型的确定

    使用三菱HP-20型树脂富集花椒生物碱类成分时,HAS、HBS两成分的总含量(X)最高且结果稳定,结果见表2。因此,优选三菱HP-20型大孔吸附树脂进行后续实验。

    表  2  不同类型树脂对HAS、HBS总得率的影响(n=3)
    树脂类型 HAS、HBS
    总浓度(mg/ml)
    HAS、HBS
    总含量(%)
    $ \bar{X} $±SD(%)
    APS-17 2.42 4.06 4.06±2.17
    NKA-9 2.08 3.50 3.50±1.76
    宝恩HP-20 3.68 6.19 6.19±1.09
    AB-8 3.58 6.02 6.02±1.28
    HPD-400 3.59 6.03 6.03±0.98
    三菱HP-20 4.10 6.89 6.89±0.62
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    3.2.2   上样量的确定

    图2可知,当上样液体积为90 ml时,花椒生物碱开始少量泄漏;随着上样体积增加,流出液中生物碱浓度呈现上升趋势;当上样液为210 ml时,累计泄漏率为9.61%,接近上样液中HAS、HBS总浓度的10%[12]。因此确定最大上样量为210 ml,即上样生药量与树脂体积比约为1 g∶2.5 ml。

    图  2  三菱HP-20型大孔树脂动态吸附泄漏曲线
    3.2.3   上样条件的确定

    图3可知,当上样液浓度为0.2 g生药/ml时,HAS和HBS的得率最高;随着浓度升高,杂质增多,与生物碱竞争吸附活性位点,得率下降;此外高浓度上样液在静置吸附过程中较容易发生絮凝和沉淀现象[13-14]。故优选上样液浓度为0.2 g生药/ml。树脂径高比为1∶7、吸附流速为4 BV/h时,HAS和HBS的总得率最高。故选用树脂径高比为1∶7的三菱HP-20型树脂柱,动态吸附流速为4 BV/h。

    图  3  不同上样条件对HAS、HBS总得率的影响
    A.上样液浓度;B树脂柱径高比;C吸附流速*P<0.05,**P<0.01,与白色组比较。
    3.2.4   除杂、洗脱条件的确定

    表3所示,以HAS、HBS总得率为指标时,影响三菱HP-20型大孔树脂纯化花椒总生物碱的除杂因素依次为除杂溶剂(A)>除杂流速(C)>除杂体积(B)。除杂的最佳条件为20%乙醇、流速为5 BV/h。除杂体积由2 BV提升到3 BV,结果差异并不明显,为节约溶剂、提高效率,优选2 BV为除杂体积。

    表  3  除杂条件L9(33)正交设计及结果
    编号 因素 总得率(%)
    除杂溶剂(A) 除杂体积(B) 除杂流速(C)
    1 1 1 1 7.87
    2 1 2 2 9.09
    3 1 3 3 9.31
    4 2 1 2 10.33
    5 2 2 3 10.42
    6 2 3 1 10.67
    7 3 1 3 11.82
    8 3 2 1 10.73
    9 3 3 2 11.66
    k1 8.75 10.06 9.71
    k2 10.44 10.07 10.34
    k3 11.37 10.48 10.52
    R 2.62 0.64 0.81
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    表4可知,洗脱因素对HAS、HBS总得率的影响次序依次为洗脱溶剂(A)>洗脱流速(C)>洗脱体积(B);最佳组合条件为洗脱溶剂80%乙醇,洗脱体积为5 BV,洗脱流速5 BV/h。

    表  4  洗脱条件L9(33)正交设计及结果
    编号 因素 总得率
    (%)
    洗脱溶剂(A) 洗脱体积(B) 洗脱流速(C)
    1 1 1 1 2.55
    2 1 2 2 5.38
    3 1 3 3 7.15
    4 2 1 2 5.75
    5 2 2 3 8.11
    6 2 3 1 9.57
    7 3 1 3 9.20
    8 3 2 1 8.28
    9 3 3 2 6.36
    k1 5.03 5.83 6.80
    k2 7.81 7.26 5.83
    k3 7.95 7.69 8.15
    R 2.92 1.86 2.32
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    3.2.5   花椒生物碱富集纯化最佳工艺及验证

    实验确立花椒生物碱制备的最佳工艺为料液比1∶10,溶剂为50%乙醇,95℃水浴加热,每次回流提取1 h,提取3次,过滤后合并滤液;45℃减压浓缩至无醇味,纱布过滤,加水分散至生药浓度相当于0.2 g/ml的上样液;按上样生药量与大孔吸附树脂的体积比1 g∶2.5 ml,上样于三菱HP-20型大孔树脂,树脂柱径高比1∶7,动态吸附流速4 BV/h,静置1 h后,2 BV、20%乙醇以5 BV/h除杂;80%乙醇洗脱,体积5 BV,流速5 BV/h。收集洗脱液,45℃减压浓缩并干燥,即得花椒生物碱提取物。

    表5可知,三次重复实验花椒生物碱得膏率相近,富集纯化后HAS、HBS总含量的RSD为0.87%,证明本方法确定的大孔树脂富集纯化花椒生物碱的工艺稳定可靠,重复性高。此外,经纯化后花椒生物碱中HAS、HBS的含量分别为4.71%、1.02%,与富集纯化前相比,花椒生物碱的含量得到明显升高。

    表  5  最佳工艺验证结果
    编号 得膏率
    (%)
    富集前
    总含量(%)
    富集后
    总含量(%)
    富集后
    总含量RSD(%)
    1 6.88 0.82 5.73 0.87
    2 6.91 0.81 5.72 0.87
    3 6.95 0.82 5.64 0.87
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    通过中药系统药理学数据库与分析平台、PubChem、Web of science等数据库和国内外文献,收集花椒的化学成分信息,包括绘制化学结构、整理化合物名称与分子式、利用MasslynxV4.1计算化合物精确质量等,建立共包含95种生物碱的花椒化学成分数据库。

    图4可知,在正离子模式下,生物碱类化合物得到了较好的分离。结合质谱数据、相关文献对照品的裂解规律和紫外吸收,并与自建的花椒化学成分数据库进行对比分析,共识别鉴定或推导出20种生物碱类化合物,包括木兰花碱、茵芋碱、HAS、HBS等(见表6)。

    图  4  正离子模式下花椒生物碱BPI图
    表  6  正离子模式下花椒生物碱类成分碎片离子及鉴定结果
    峰号 保留时
    间(t/min)
    化合物 分子式 离子模式 理论值
    m/z
    实测值
    m/z
    误差
    (ppm)
    碎片离子
    m/z
    参考
    文献
    1 4.716 木兰花碱 C20H24NO4+ [M]+ 342.170 5 342.169 0 −4.38 342.169 0[M]+, 297.110 6[M-C2H7N]+, 282.088 2[M-C2H7N-CH3]+, 265.085 2[C17H13O3]+, 222.065 3[C15H10O2]+, 191.084 6[C15H11]+, 194.071 4[C14H10O]+, 165.069 3[C13H9]+ [17]
    2 5.483 ZP-amide D C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18]
    3 5.877 ZP-amide E C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 320.182 5[M+Na]+ [18]
    4 6.043 ZP-amide A C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19]
    5 6.724 ZP-amide B C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19]
    6 6.793 ZP-amide C C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18, 20]
    7 7.222 ZP-amide L C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18]
    8 7.902 ZP-amide K C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18]
    9 12.427 ZP-amide N C18H31NO4 [M+Na]+ 348.215 1 348.213 0 −6.03 349.217 7[M+H+Na]+, 348.213 0[M+Na]+ [18]
    10 16.168 茵芋碱 C14H13NO4 [M+H]+ 260.092 3 260.092 3 0.00 229.037 0[M-2CH3]+, 227.056 6[C13H9NO3]+, 202.046 8[C11H8NO3]+, 199.062 5[C12H9NO2], 184.037 9[C11H6NO2]+, 156.043 4[C10H6NO]+, 77.037 7[C6H5]+ [21]
    11 22.312 羟基-ε-山椒素 C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 302.171 4[M+K]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [22]
    12* 22.701 羟基-α
    山椒素
    C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [23]
    13* 23.113 羟基-β
    山椒素
    C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.187 5[M-OH]+ [23]
    14 23.605 Zanthoamides A C18H27NO4 [M-OH]+ 304.191 3 304.191 3 0.00 345.184 4[M+H+Na]+, 344.181 6[M+Na]+ [24]
    15 26.156 羟基-γ−山椒素 C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22]
    16 26.379 羟基-γ
    异山椒素
    C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22]
    17 26.786 bungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15]
    18 26.957 isobungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15]
    19 27.586 α−山椒素 C16H25NO [M+H]+ 248.201 4 248.201 2 −0.81 286.178 3[M+K]+ [23]
    20 29.068 四氢花椒素 C18H33NO2 [M+H]+ 296.259 0 296.257 7 −4.39 318.237 8[M+Na]+, 279.137 4[M+H-OH]+ [25]
    *:为与对照品比对的化合物。
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    实验前期,考察了酸提碱沉法与乙醇回流提取法,经比较发现两方法制备得到的花椒生物碱中HAS、HBS含量差别不显著。但以酸性溶液浸提生物碱时,耗时长、水溶性杂质较多,而且酸性溶液可能会使部分生物碱吸收氢离子导致质子化从而发生重排反应,破坏分子结构,综合考虑下本实验选择乙醇回流提取法。

    HAS、HBS是花椒的代表性酰胺类生物碱,具有降脂、抗氧化、麻醉、神经营养等多种活性,受到研究者的广泛关注[15-16]。本实验确立的工艺能够有效富集花椒生物碱,显著提高HAS、HBS含量,为后续HAS、HBS单体化合物的制备提供了基础。实验过程中尝试通过优化除杂条件、分段收集乙醇洗脱液等方法分离黄酮与生物碱类成分,但UPLC-Q-TOF-MSE得到的BPI图中,8~11 min仍存在着部分响应较高的黄酮类物质无法完全分离,后续还需要探索其他有效的方法进一步去除黄酮类成分。

    本实验在单因素实验基础上采用正交设计考察了花椒生物碱的最佳纯化工艺,利用UPLC-Q-TOF-MSE对生物碱成分进行分析鉴定,使用HPLC对制备得到的花椒生物碱中的HAS、HBS进行含量测定。本纯化工艺简单可行、稳定有效,可为花椒生物碱的综合开发利用及工业化生产提供科学依据,对提升花椒的综合经济价值具有深远意义。

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出版历程
  • 收稿日期:  2021-05-10
  • 修回日期:  2021-09-22
  • 网络出版日期:  2022-01-20
  • 刊出日期:  2022-01-25

α1-酸性糖蛋白基本特征及代谢调节作用的研究进展

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105032
    基金项目:  国家自然科学基金( 81773726; 82073842); 上海市2021年度“科技创新行动计划”(21XD1404700)
    作者简介:

    向科发,硕士研究生,Email:xkfhz2014@163.com

    通讯作者: 刘 霞,教授,博士生导师,研究方向:心脑血管药理学,Email:lxflying@aliyun.com
  • 中图分类号: R969[

摘要: 代谢稳态是机体生存必需的基础性功能。α1-酸性糖蛋白(AGP)是一种急性期蛋白,糖基化程度高达45%,具有高亲和力、低容量的特性。虽然AGP的生物学作用尚不完全清楚,但已经证明它可以调节免疫和代谢,并在携带药物转运,维持毛细血管屏障功能等方面发挥着重要作用。综述AGP的结构特征、生化特性,以及AGP的表达调控和代谢调节作用,提示其可能是代谢通路上的一个潜在关键因子,成为代谢性疾病的一个新的研究方向。

English Abstract

杨贺英, 罗彩萍, 彭婷, 梁文仪, 沈颂章, 苏娟. 花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析[J]. 药学实践与服务, 2025, 43(2): 75-81. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066
引用本文: 向科发, 万静静, 张慧敏, 史小飞, 秦臻, 刘霞. α1-酸性糖蛋白基本特征及代谢调节作用的研究进展[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(1): 6-11. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105032
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Citation: XIANG Kefa, WAN Jingjing, ZHANG Huimin, SHI Xiaofei, QIN Zhen, LIU Xia. The research progress on the basic characteristics and metabolic regulation of α1-acid glycoprotein[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(1): 6-11. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105032
    • α1-酸性糖蛋白(AGP)又称为血清类黏蛋白(ORM),是急性期蛋白(APP)家族的一员,1950年首次被发现[1]。AGP主要由肝脏合成,但许多肝外组织也能在一定条件下产生AGP[2]。在生理状态下,年龄[3]、性别[4]、发育[5]和怀孕都会影响AGP水平。人类在大多数疾病状态下,包括炎症、感染和癌症,AGP水平会增加2~6倍[6]。研究表明它的碳水化合物含量高达45%,等电点(pI)为2.8~3.8,具有药物载体、免疫调节、抗疲劳等多种功能。本文总结有关AGP的最新进展,重点介绍AGP在调节代谢中的作用。

    • 人类AGP是位于9号染色体长臂上的AGP-A、AGP-BAGP-B′3个相邻基因簇的产物[7]AGP-A基因编码血清AGP的主要成分AGP1(占血浆AGP的75%),而其他2个基因则编码AGP2 [8]AGP1AGP1*SAGP1*F1AGP1*F2三种等位基因,其中,AGP1*SAGP1*F1在全球人群范围内均有分布,AGP1*F2(由AGP1*SAGP1*F1演变而来[9])在欧洲人、北非人和西亚人中很常见。相反,AGP2基因在大多数群体中是单态的。到目前为止,大约30个罕见的变异等位基因已通过电泳技术在相应的位点被区分开。在大鼠中,每个基因组只有一个AGP基因,位于第5染色体上。在小鼠中,AGP的3个主要基因(AGP1AGP2AGP3)在4号染色体上排列成一个簇,分别编码AGP1、AGP2AGP3,这些基因与人类和大鼠的AGP基因结构相同,有6个外显子和5个内含子。一些研究表明,组成型的AGP-1水平远远高于AGP2(5倍),AGP1信使RNA(mRNA)的增加而不是AGP2 mRNA的增加是急性期反应期间小鼠AGP mRNA变化的主要原因[10]。此外,尽管AGP3基因序列与AGP2基因序列非常相似,但存在一定的差异。AGP3在内含子1中缺少86个核苷酸,而AGP2在内含子5中有一个额外的(GT碱基起始)28区。已在哺乳动物中观察到同源AGP基因,包括啮齿动物、猫、狗、猪、猴子和人类。小鼠、大鼠、兔和猪的AGP基因与人AGP的同源性分别为44%、59%、70%和70%[11]

    • AGP蛋白含有遗传多态性[12]。急性期刺激只能诱导AGP-A,因此AGP1是AGP家族中唯一的急性期蛋白。在人类中,AGP1前体是由201个残基组成的单个多肽链[13]。在蛋白质加工过程中,前18个残基的一个N-末端分泌信号肽被裂解,最终得到含有183个氨基酸的单链多肽,其中包括两个2硫键。AGP1和AGP2之间有22个氨基酸的差异。其他氨基酸可以出现在位置32和47上,导致多态性[14]。大鼠AGP蛋白的成熟形式分子量为40~44kDa[15],是一种187个氨基酸的蛋白质,只有一个二硫键,每个分子含有6个N-键复合型低聚糖[16]

    • AGP是一种高酸性蛋白质,其等电点(pI)很低,在2.8~3.8之间[2]. 这种特性使AGP主要与碱性药物(如利多卡因、普萘洛尔、维拉帕米)结合,但也可与中性亲脂性分子(如类固醇激素)和酸性药物(如苯巴比妥)结合,而白蛋白则主要与酸性药物结合[17-18]。大多数药物以不同程度的亲和力与两种血浆蛋白结合。AGP的广泛和可变的唾液酸化是其低且宽pI的原因,这一特性可以影响药物亲和力,并最终影响药物代谢动力学(PK)[6]。由于大多数疾病状态下AGP水平增加[19],具有高亲和力的药物可能表现出更高的结合状态,从而改变药物的PK特性,表现为药物的总清除率(CL)和静脉输注稳态分布容积(Vss)降低。AGP的酸性特质与大量唾液酸化的聚糖相关。人类AGP含有5个多肽主链的N-连接聚糖,每个N-连接聚糖可形成多个(2个、3个或4个)分支,这些分支都是唾液酸化的位点[20]。去涎酸可导致pI从4.2增加到4.7[21-22]。去涎酸和升高血浆pH值可降低药物与AGP的结合[23-24]。AGP在血清中去涎酸,无唾液酸AGP的内吞和降解由肝脏无唾液酸糖蛋白受体介导,即所谓的“肝结合蛋白”(HBP)[25]

    • 蛋白质通常经历翻译后修饰,影响生理功能和半衰期(t1/2)。糖基化寡糖链(聚糖)是常见的翻译后修饰之一,在真核蛋白质中的发生率约为50%[26]。AGP在不同的物种中有不同数量的N-连接的潜在糖基化位点[27],糖基化主要有3种变化:分支度、唾液酸化和岩藻糖基化。理论上,这种高度的结构多样性将产生超过105种不同的AGP糖型,每种糖型在每个糖基化位点上都可以进行独特的聚糖组合[2],但在健康人血浆中仅观察到约12~20种聚糖组合。此外,聚糖链上的终末糖是造成聚糖多样性的主要原因,并且这种微异质性强烈依赖于病理生理条件。例如,在急性期反应的早期阶段,表达二氨基聚糖的糖类显著增加,同时AGP岩藻糖基化程度增加明显[28];在特应性哮喘患者中,尽管血浆和支气管肺泡灌洗液AGP水平在两组之间相似,但与非哮喘患者相比,聚糖分支的程度发生了变化[27]。AGP的糖基化可能受饮食模式的影响,更高的糖基化与更健康的饮食模式相关。糖基化改变与多种疾病的发生发展有关,特别是癌症和2型糖尿病,研究表明饮食可能通过AGP糖基化改变影响疾病状态[29]

    • AGP主要由肝细胞和实质细胞合成[30]。AGP的肝外产生在40多年前就被描述过。人乳腺上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、人微血管内皮细胞、人粒细胞、单核细胞系THP-1、单核细胞、巨噬细胞和多形核白细胞已被证明能合成和分泌AGP。然而,在T和B淋巴细胞中未发现AGP[24]。组成型AGP基因在肝外器官如肺、乳腺、肾脏和脂肪组织中均有表达[2]。AGP属于先天免疫关键因素的APP家族一员,具有多样化的生物学活性。AGP活性的调节是复杂的。其中炎症不仅诱导AGP血清浓度的增加,而且诱导其碳水化合物部分质的改变,产生大量的糖型,每一种糖型都可能具有不同的活性[31]。AGP的调控主要包括内源性与外源性两方面的因素。

    • 炎性细胞因子TNFα、IL-1 、IL-8、IL-11和IL-6,以及C-反应蛋白(CRP)、结合珠蛋白(Hp)、血清淀粉样蛋白A(SAA)和血凝素等其他APP,已被证明可调节AGP表达水平[32-35]。研究发现肝、肠、血管壁、胰腺和肾脏中表达的核胆汁酸受体法尼类X受体(FXR)[36],可以通过小鼠AGP1启动子上游的FXR反应元件激活小鼠肝脏AGP的表达[37]。小鼠AGP基因的诱导更为复杂,涉及到正、负两种转录因子(C/EBPβ[38] 和因子B [39-40],两者均为核仁蛋白,包含在启动子180 bp区域中),它们在急性期反应中对AGP基因的转录诱导起协同作用。雌激素可以降低肌肉细胞和肝脏细胞的AGP蛋白表达及其启动子活性,阻断雌激素受体或者抑制p38丝裂原活化蛋白激酶可消除这种作用[41]。胆汁酸超载可以诱导肝细胞因子AGP表达[42]。另外,miR-362-3p被鉴定为AGP1的上游调节性miRNA,并对H/R损伤心肌细胞AGP1的mRNA和蛋白表达水平产生负调控[43]

    • 反复服用苯巴比妥和利福平可通过独立于炎症途径的机制提高AGP血清水平[44]。维甲酸通过激活维甲酸受体α和维甲酸X受体α,在转录水平上以剂量依赖的方式增加AGP的表达[45]。铅可诱导AGP基因过度表达,可能与NF-κB途径的激活相关[46]。维生素D可诱导人单核细胞AGP1的表达[47]。大环内酯类抗生素影响着AGP的表达水平。例如,克拉霉素可以剂量依赖性地增加正常和糖尿病大鼠血清中AGP蛋白水平以及肝脏中AGP mRNA的稳态水平[48];红霉素在体外和体内均以剂量和时间依赖的方式增加AGP蛋白的表达[49]。此外,临床研究发现用异丙肾上腺素、儿茶酚胺、纤溶酶原激活物抑制物1、他汀类药物或β受体阻滞剂治疗2型糖尿病或冠心病患者可以调节AGP水平[50]

    • 脂肪组织是一种高度异质性和动态的器官,在调节能量代谢和胰岛素敏感性方面起着重要作用。除了在营养传感和能量储存/耗散方面的经典作用外,脂肪组织还分泌大量生物活性分子(称为脂肪因子),通过旁分泌和/或内分泌作用参与免疫应答和代谢调节[51]。最近,AGP被鉴定为一种脂肪因子,在中枢通过与瘦素受体结合减少食物摄入,在外周通过抑制NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶信号减轻脂肪组织炎症分别发挥作用[52-53]。研究发现AGP增加3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取活性,并减轻高血糖诱导的胰岛素抵抗以及TNF-α介导的脂肪细胞脂解,改善了肥胖和糖尿病db/db小鼠的葡萄糖和胰岛素耐受性[52],表明AGP可以通过整合炎症和代谢信号保护脂肪组织免受过度炎症,从而避免引起脂肪组织的代谢功能障碍。另外的研究也表明AGP抑制脂肪组织中脂肪的生成可能是通过抑制胰岛素介导的葡萄糖氧化实现的[54]。最新的研究又将AGP的代谢功能定义为一种新的胆汁酸调节的肝细胞因子。宋浩利等人研究发现胆汁酸诱导肝脏AGP分泌,阻断脂肪细胞分化。在脂肪细胞分化过程中,AGP抑制C/EBPβ、KLF5、C/EBPα和PPARγ等成脂转录因子的基因表达,拮抗脂肪生成信号[42]。肝源性胆汁酸不仅是乳化膳食脂类的天然表面活性剂,而且是葡萄糖和脂类稳态的重要代谢调节剂[36],这样的能量代谢调节作用可能是通过刺激AGP分泌产生的。脂肪组织中细胞外基质(ECM)的过量沉积被定义为脂肪组织纤维化,是代谢紊乱如肥胖和2型糖尿病的主要原因。近期王鹏源等人研究发现,AGP可以通过激活AMPK抑制TGF-β1的表达,在脂肪组织中发挥直接的抗纤维化作用[55]。定期规律运动克服肥胖所带来的益处,部分源于运动过程中分泌的一些细胞因子(包括蛋白质、肽、酶和代谢物),增加了白色脂肪组织中棕色脂肪细胞特异性基因的表达而诱导白色脂肪组织的褐变[56]。同时,研究发现适当的运动训练能够升高血浆AGP水平[57-58],基于AGP与脂肪组织的密切关系,它很有可能在促进运动引起的白色脂肪棕色化中发挥一定的作用。

    • 拉姆塞等[59]研究发现急性期蛋白AGP可以与骨骼肌相互作用,抑制胰岛素刺激的葡萄糖氧化。另外,研究表明AGP具有抗疲劳作用,通过与细胞膜上CCR5受体结合激活AMPK,从而促进肌肉糖原合成增强肌肉耐力[49, 60]。同时,万静静等[49]发现大环内酯类药物红霉素通过升高AGP的表达增强骨骼肌细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化能力,促进ATP生成水平来调节肌肉耐力。AMPK是一种关键的细胞能量传感器,在细胞能量水平降低(AMP:ATP和ADP:ATP比率升高)或某些激素刺激(如脂联素)下被激活[61]。在脂肪组织中,AMPK激活促进脂肪酸氧化,抑制脂质合成[62]。研究已经证明脂肪组织中AGP与AMPK存在相互作用[55],因此,AGP在脂肪组织能量代谢方面的作用以及AGP如何作用于脂肪细胞的AMPK信号,是值得进一步研究的。

    • AGP与糖尿病风险的增加密切相关。研究表明1型糖尿病儿童和青少年的血清和尿AGP水平均显著升高,是糖尿病微血管并发症的一个重要独立因素[63]。ChinaMAP通过全基因组关联分析探索了中国人群中2型糖尿病和肥胖遗传相关因素,发现AGP是2型糖尿病风险高频基因位点,进一步的血糖相关分析发现AGP1与空腹血糖(FBG)升高显著正相关[64]。在健康的年轻成年人中,高水平的体脂百分比与血浆AGP的升高具有相关性[65],表明肥胖作为糖尿病的独立危险因素可能与AGP的升高有关。同时临床研究表明,AGP可以作为一个有意义的生物标志物,可用于区分患有代谢综合征的超重/肥胖女性和代谢健康的女性,而不依赖于体重、脂肪质量和体力活动/体能[66]。在慢性疲劳综合征患者和啮齿动物疲劳模型中,AGP在血液和肌肉等多种组织中显著升高,表明其作为一种抗疲劳蛋白具有指示性生物标志物的潜能[67]。研究发现代谢综合征患者组血清AGP值(P<0.001)显著高于对照组[68],血清AGP水平与代谢综合征相关临床危险因素密切相关[69],这些研究发现为利用AGP诊断青少年代谢综合征,以预防未来并发症提供了可能性。这些进一步验证了AGP在调节代谢稳态的作用,其在代谢相关疾病发生发展中可能发挥着重要作用。

    • 鉴于蛋白质组学和高分辨率质谱技术的最新进展,AGP定量和/或定性分析在疾病诊断、预后和特征描述方面的应用日益增多,使得AGP有可能成为提高相关疾病治疗成功率的鉴别标准。在此我们主要综述了AGP的结构特征、生化特性以及表达的调控,重点总结了AGP在调节代谢中的最新研究进展,表明它可能是一个与肥胖、代谢综合征等代谢性疾病相关的有前景的因素,为代谢性疾病的诊断、预防与治疗提供了一个新的策略方向。

参考文献 (69)

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